一种非天然核苷酸构成的核酸编码化合物库
阅读说明：本技术 一种非天然核苷酸构成的核酸编码化合物库 (Nucleic acid coding compound library composed of non-natural nucleotides ) 是由 李进 巩晓明 窦登峰 于 2020-10-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种非天然核苷酸构成的核酸编码化合物和化合物库。本发明的核酸编码化合物和化合物库通过引入Z、P、S、B、S’五种人工碱基,克服了使用天然碱基的核酸编码化合物库的应用局限。(The invention discloses a nucleic acid coding compound and a compound library consisting of non-natural nucleotides. The nucleic acid encoding compounds and compound libraries of the present invention overcome the limitations of the use of natural base libraries of nucleic acid encoding compounds by introducing Z, P, S, B, S' five artificial bases.)
技术领域
本发明具体涉及一种非天然核苷酸构成的核酸编码化合物和/或化合物库。
背景技术
在新药研发领域，针对生物靶标的高通量筛选是快速获得先导化合物的主要手段之一。然而，基于单个分子的传统高通量筛选所需时间长、设备投入巨大、库化合物数量有限(数百万)，且化合物库的建成需要数十年的积累，限制了先导化合物的发现效率与可能性。近年来出现的DNA编码化合物库技术(WO2005058479、WO2018166532、CN103882532)，结合了组合化学和分子生物学技术，在分子水平上将每个化合物加上一个DNA标签，能在极短的时间内合成高达亿级的化合物库，而且化合物能够通过基因测序的方法进行识别，大幅度地增加了化合物库的大小和合成效率，成为下一代化合物库筛选技术的趋势。DNA编码化合物库技术正开始在制药行业广泛应用，并产生了诸多积极的效果(Accounts ofChemical Research,2014,47,1247-1255)。
随着该技术运用的扩展，DNA编码标签也体现出其在某些生物靶标筛选上的局限：1)如转录因子等与DNA序列存在相互作用的蛋白、核糖核酸(RNA)等作为疾病调控靶标时，传统DNA编码化合物库筛选会产生较多背景结合信号。这些信号可能来自化合物的DNA标签与转录因子蛋白的亲和作用，或化合物的DNA标签与RNA靶标产生的杂交亲和，这些信号并非经由化合物结构本身与生物靶标的结合。2)传统DNA编码化合物库筛选应用于某些生物样本(如基于活细胞原位膜蛋白靶点的筛选)时，由于这些生物样本容易产生内源基因组DNA对富集分子的DNA标签扩增和检测的干扰，从而降低扩增效率以及形成一定错配假阳性扩增信号。
Shuichi Hoshika等公开了一种非天然碱基的核酸编码系统(Science，2019，363：884- 887)。本发明将非天然碱基应用于DNA编码化合物库技术，使用与天然编码核苷酸不同的编码系统，从而克服上述应用局限，提升编码化合物库技术的应用范围。
发明内容
本发明公开了一种核酸编码化合物，包括功能部分和核酸部分，其中核酸部分的碱基选自非天然碱基Z、P、S、B、S’；
其中，碱基Z为碱基P为碱基S为碱基B 为碱基S’为
进一步地，所述核酸编码化合物还包括连接基团，通过连接基团将功能部分和核酸部分连接。
进一步地，所述核酸部分包括单链核酸和/或双链核酸。
更进一步地，所述双链核酸中，碱基Z和碱基P对应，碱基S和碱基B对应，碱基S’和碱基B对应。
进一步地，所述核酸部分由核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸组成。
更进一步地，所述核糖核苷酸的碱基为Z、P、S’、B，所述脱氧核糖核苷酸的碱基为Z、P、S、B。
进一步地，所述核酸部分核酸长度大于10bp。
更进一步地，所述核酸部分可以插入带有天然碱基的核苷酸，但不插入连续3个或3 个以上的天然碱基核苷酸，并且天然碱基的核苷酸数量在核酸部分核苷酸总数中的比例低于30％。
进一步地，所述核酸编码化合物结构如式I所示：
其中，
X是至少3价的原子或分子骨架；
L1为可连接核酸5’端的连接基团；
L2为可连接核酸3’端的连接基团；
Z1为第一核酸部分；
Z2为第二核酸部分；其中第二核酸部分的碱基与第一核酸部分的碱基至少部分对应；
M为可连接功能部分的连接基团；
Y为一个或多个合成子构成的功能部分。
更进一步地，所述X为碳原子。
更进一步地，所述M选自亚烷基链或聚(乙二醇)链。
更进一步地，所述L1、L2选自亚烷基链或聚(乙二醇)链。
进一步具体地，所述亚烷基链、聚(乙二醇)链带有磷酸接头基团。
更进一步地，所述Z1和Z2各自还包含PCR引物结合位点序列。
本发明还公开了一种核酸编码化合物库，包含至少102种不同的上述核酸编码化合物。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的
具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步地详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1是已知与TAR RNA有结合作用的化合物550，具有两个可与核酸编码进行连接的位点。
具体实施方式
实施例1、核酸编码化合物的构建
1)将与TAR RNA有结合作用的化合物550(图1，Ki＝0.039μM)，按照WO2005058479或WO2018166532中描述的方法，构建带有核酸标签的核酸编码化合物1～3和对照化合物4～6，化合物结构如下：
编号
化合物部分
核酸标签
1
化合物550
与TAR RNA有结合作用的天然DNA序列
2
化合物550
本发明非天然核酸序列
3
化合物550
与TAR RNA无结合作用的天然DNA序列
4
无
与TAR RNA有结合作用的天然DNA序列
5
无
本发明非天然核酸序列
6
无
与TAR RNA无结合作用的天然DNA序列
实施例2、本发明核酸编码化合物的筛选方法验证
将TAR RNA序列的3’末端用生物素进行修饰，用于固定。将tat小肽末端用FAM进行标记。将TAR RNA用中性亲和素蛋白磁珠固定，用FAM-tat进行孵育，洗脱一次，随后加热TARRNA和磁珠，测定上清中FAM的荧光含量，确认FAM-tat同固定的TAR RNA 结合，确保TAR RNA具有活性。
将化合物1～6与TAR RNA在筛选缓冲液(50mM Tris,80mM KCl,0.3mg/mL ssDNA,0.01％Tween 20,pH 7.5)中进行孵育1h，之后加入中性亲和素蛋白磁珠室温孵育30min 以固定TAR RNA，再用筛选缓冲液洗脱，随后将磁珠转移到洗脱缓冲液(50mM Tris,160 mMKCl,pH 7.5)中加热至95℃维持10min，收集上清。用qPCR对洗脱缓冲液中的核酸含量进行定量，比较各组之间核酸的富集程度。
将化合物1～6按照10^5～10^9分子数加入传统的DNA编码化合物库中，对TAR RNA进行筛选，具体操作步骤如上所述。将第一轮筛选得到的编码化合物在TAR RNA中进行第二轮筛选，如此重复直到洗脱总分子数在10^8左右。将得到的编码化合物进行PCR扩增和测序，再进行测序结果的解码，比较化合物1～6最后的富集拷贝数。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种水流轧花机