新型嗜水气单胞菌噬菌体Aer-HYP-3及其在抑制嗜水气单胞菌细菌生长方面的用途
阅读说明:本技术 新型嗜水气单胞菌噬菌体Aer-HYP-3及其在抑制嗜水气单胞菌细菌生长方面的用途 (Novel aeromonas hydrophila phage Aer-HYP-3 and application thereof in inhibiting growth of aeromonas hydrophila bacteria ) 是由 尹圣君 俊苏云 权安升 蒋基英 康桑贤 于 2019-02-18 设计创作,主要内容包括:本发明涉及一种从自然界分离出的肌尾噬菌体科噬菌体Aer-HYP-3(登录号:KCTC 13479BP),其具有杀死嗜水气单胞菌细菌的能力,并且具有由SEQ ID NO:1表示的基因组,还涉及一种使用包含所述噬菌体作为活性成分的组合物来预防和治疗由嗜水气单胞菌引起的疾病的方法。(The present invention relates to a bacteriophage Aer-HYP-3 (accession No: KCTC 13479BP) of Myoviridae, which is isolated from the natural world, has the ability to kill Aeromonas hydrophila bacteria, and has a genome represented by SEQ ID NO:1, and a method for preventing and treating diseases caused by Aeromonas hydrophila using a composition comprising the bacteriophage as an active ingredient.)
技术领域
本发明涉及一种从自然界分离出的噬菌体,该噬菌体感染嗜水气单胞菌细菌,从而杀死嗜水气单胞菌细菌,还涉及一种使用包含上述噬菌体作为活性成分的组合物来预防和治疗由嗜水气单胞菌细菌引起的疾病的方法。更具体地,本发明涉及一种从自然界分离出的肌尾噬菌体科噬菌体Aer-HYP-3(保藏号:KCTC 13479BP),其具有杀死嗜水气单胞菌细菌的能力,并且具有由SEQ ID NO:1表示的基因组,还涉及一种使用包含上述噬菌体作为活性成分的组合物来预防和治疗由嗜水气单胞菌细菌引起的疾病的方法。
背景技术
气单胞菌属属于γ-变形杆菌,是广泛分布在世界各地并且普遍存在于土壤和水中的细菌,并且这些细菌中的一些细菌是可能引起人类疾病的条件致病菌。这些细菌主要被分为非运动型气单胞菌属和运动型气单胞菌属。嗜水气单胞菌是代表性的运动型气单胞菌属,并且已知嗜水气单胞菌通过对淡水鱼、两栖动物、爬行动物和人类的口腔感染或者透皮感染引起急性感染、慢性感染和潜伏感染。已知嗜水气单胞菌的血清型包括热稳定的体细胞O抗原、热不稳定的荚膜K抗原和鞭毛H抗原,并且已知迄今为止所知的大多数致病的嗜水气单胞菌细菌都表现出热稳定的体细胞O抗原。
对于一部分由于各种环境因素(如温度、集约化农耕和水中的有机物)产生的压力以及因为伤口、寄生虫感染和其他病原体而受到影响并且最终被感染的鱼,嗜水气单胞菌引起其系统性急性出血性败血病。特别是,如果在高温下发生嗜水气单胞菌细菌感染,幼鲑将大规模死亡,黑鲈将出现红斑病,而金鱼将出现继发性皮肤感染和疖病。此外,我们知道,在温水鱼养殖业中,由嗜水气单胞菌感染所造成的高死亡率会导致严重的经济损失。因此,急需研发出适用于预防和进一步治疗嗜水气单胞菌感染的方法。
虽然已经使用各种抗生素来预防或者治疗由嗜水气单胞菌引起的疾病,但是目前,细菌对这种抗生素的耐药性日益增加,因此急需研发出除了抗生素之外的其他方法。
最近,使用噬菌体作为应对感染性细菌疾病的对策引起了广泛关注。尤其是,这些噬菌体由于对抗耐抗生素细菌的强抗菌活性而受到极大的关注。噬菌体是感染细菌的很小的微生物。一旦噬菌体感染了细菌,噬菌体就在细菌细胞内增殖。在增殖之后,噬菌体的后代破坏细菌的细胞壁并且从宿主细菌中逸出,这表明噬菌体具有杀死细菌的能力。噬菌体感染细菌的方式的特征在于其非常高的特异性,因此,感染特定细菌的噬菌体类型的范围有限。即,某种噬菌体只能感染特定的细菌,这表示某种噬菌体能够提供只针对特定细菌的抗菌作用。由于噬菌体的这种细菌特异性,噬菌体只对目标细菌具有抗菌作用,而不影响环境中或者动物体内的共生细菌。已经被广泛用于细菌治疗的常规抗生素会顺带影响许多其他种类的细菌,导致诸如污染环境和干扰动物体内正常菌群等问题。对比之下,使用噬菌体不会干扰动物体内的正常菌群,因为目标细菌是通过使用噬菌体来选择性地杀死的。因此,可以安全地利用噬菌体,这样一来,与抗生素相比较,大大减少了使用噬菌体会产生不利影响的可能性。
噬菌体最初由英国细菌学家Twort于1915年发现,当时他注意到微球菌菌落由于未知的某物而被软化并且变得透明。在1917年,法国细菌学家d'Herelle发现在痢疾患者***物的滤液中的痢疾志贺氏菌被某物破坏,并且对该现象进行了进一步研究。结果他独立地鉴定出了噬菌体,并且将其命名为“噬菌体”,意为“细菌吞噬者”。自此以后,对诸如志贺氏菌、伤寒沙门氏菌和霍乱弧菌等致病菌起作用的噬菌体被不断地鉴定出来。
由于噬菌体杀死细菌的独特能力,噬菌体自被发现以来就作为应对细菌感染的可能的有效对策引起了关注,并且已经进行了许多与之相关的研究。然而,自弗莱明发现青霉素以来,由于抗生素的普遍传播,有关噬菌体的研究仅在一些东欧国家和前苏联得以继续。自2000年以来,由于耐抗生素细菌的增加,常规抗生素的局限性已经变得显而易见,研发噬菌体作为常规抗生素的替代品的可能性已经变得十分突出,因此,作为抗菌剂的噬菌体再次引起关注。
如上所述,噬菌体往往对目标细菌具有高度特异性。由于噬菌体对细菌的高度特异性,即使针对相同的物种,噬菌体也经常只对其中某些菌株表现出抗菌作用。另外,噬菌体的抗菌强度会根据目标菌株而变化。因此,为了有效地控制特定细菌,有必要收集多种有用的噬菌体。因此,为了研发出用于控制嗜水气单胞菌的有效的噬菌体利用方法,必须获得对嗜水气单胞菌表现出抗菌作用的多种噬菌体。此外,需要从所得到的噬菌体中筛选出在抗菌强度和光谱方面优于其他噬菌体的噬菌体。
发明内容
技术问题
因此,本发明的发明人致力于研发适用于使用从自然界分离出的并且能够杀死嗜水气单胞菌的噬菌体来预防或者治疗由嗜水气单胞菌引起的疾病的组合物,并且进一步致力于设定使用该组合物来预防和治疗由嗜水气单胞菌引起的疾病的方法。其结果是,本发明的发明人从自然界分离出了适合于该目的的噬菌体,并且确定了将分离出的噬菌体与其他噬菌体区别开来的基因组序列。之后,本发明的发明人研发出包含噬菌体作为活性成分的组合物,并且确定了该组合物能够有效地用于预防和治疗由嗜水气单胞菌引起的疾病,由此形成本发明。
因此,本发明的目的是提供一种从自然界分离出的肌尾噬菌体科噬菌体Aer-HYP-3(保藏号:KCTC 13479BP),其具有杀死嗜水气单胞菌的能力,并且具有由SEQ ID NO:1表示的基因组。
本发明的另一目的是提供一种适用于预防和治疗由嗜水气单胞菌引起的疾病的组合物,该组合物包含分离出的噬菌体Aer-HYP-3(保藏号:KCTC 13479BP)作为活性成分,该分离出的噬菌体Aer-HYP-3感染嗜水气单胞菌,从而杀死嗜水气单胞菌。
本发明的又一目的是提供一种使用适用于预防和治疗由嗜水气单胞菌引起的疾病的组合物来预防和治疗由嗜水气单胞菌引起的疾病的方法,该组合物包含分离出的噬菌体Aer-HYP-3(保藏号:KCTC 13479BP)作为活性成分,该分离出的噬菌体Aer-HYP-3感染嗜水气单胞菌,从而杀死嗜水气单胞菌。
本发明的再一目的是提供一种用于使用上面所描述的组合物来预防和治疗由嗜水气单胞菌引起的疾病的药浴剂(浸渍剂)。
本发明的又一目的是提供一种通过使用上面所描述的组合物来预防和治疗由嗜水气单胞菌引起的疾病以对养殖起作用的饲料添加剂。
技术解决方案
本发明提供了一种从自然界分离出的肌尾噬菌体科噬菌体Aer-HYP-3(保藏号:KCTC 13479BP),其具有特定地杀死嗜水气单胞菌的能力,并且具有由SEQ ID NO:1表示的基因组,还涉及一种使用包含该噬菌体作为活性成分的组合物来预防和治疗由嗜水气单胞菌引起的疾病的方法。
本发明的发明人分离出噬菌体Aer-HYP-3,然后于2018年2月7日将其保藏在韩国生物科学与生物技术研究所的韩国典型培养物保藏中心(保藏号:KCTC 13479BP)。
本发明还提供了一种适用于预防和治疗由嗜水气单胞菌引起的疾病的药浴剂和饲料添加剂,该药浴剂和饲料添加剂包含噬菌体Aer-HYP-3作为活性成分。
由于本发明的组合物所包含的噬菌体Aer-HYP-3能有效地杀死嗜水气单胞菌,因此,其在预防(预防感染)和治疗(治疗感染)由嗜水气单胞菌引起的疾病方面是有效的。因此,本发明的组合物能够被用来预防和治疗由嗜水气单胞菌引起的疾病。
本文中使用的“预防”一词是指(i)预防嗜水气单胞菌感染和(ii)抑制由嗜水气单胞菌感染引起的疾病的发展。
本文中使用的“治疗”一词是指(i)抑制由嗜水气单胞菌引起的疾病和(ii)缓解由嗜水气单胞菌引起的疾病的病理状况。
本文中使用的“分离”一词是指通过使用多种实验技术来从自然界分离出噬菌体并且取得可以将本发明的噬菌体与其他噬菌体区别开来的特征的行为,并且进一步包括使用生物工程技术来使本发明的噬菌体增殖以使该噬菌体在工业上适用的行为。
本发明的组合物所包括的在药学上可接受的载体通常用于制备药物制剂,并且其示例包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、***胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油,但是不限于此。除了上述成分之外,本发明的组合物还可以包括润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂。
本发明的组合物中包含噬菌体Aer-HYP-3作为活性成分。以1×101pfu/ml至1×1030pfu/ml或者1×101pfu/g至1×1030pfu/g的浓度,优选地以1×104pfu/ml至1×1015pfu/ml或者1×104pfu/g至1×1015pfu/g的浓度包含噬菌体Aer-HYP-3。
可以根据本发明所属领域的技术人员可以容易地实施的方法,使用在药学上可接受的载体和/或赋形剂来配制本发明的组合物,以按照单位剂型来制备该组合物或者将该组合物加入到多剂量容器中。此处,可以油或者水介质中的溶液、悬浮液、或乳剂的形式,或者以提取物、粉剂、颗粒、片剂或者胶囊的形式来提供制剂,并且制剂还可以包含分散剂或者稳定剂。
可以根据其使用目的以药浴剂或者饲料添加剂的形式来提供本发明的组合物,但是不限于此。为了提高其效力,还可以将对其他细菌物种具有抗菌活性的噬菌体包括在本发明的组合物中。另外,还可以将对嗜水气单胞菌具有抗菌活性的其他种类的噬菌体包括在本发明的组合物中。可以适当地组合这些噬菌体以使组合物的抗菌效果最大化,因为这些噬菌体对嗜水气单胞菌的抗菌活性可能因抗菌强度或者抗菌谱的不同而有所不同。
有益效果
根据本发明,与基于现有抗生素的传统方法相比较,使用包含噬菌体Aer-HYP-3作为有效成分的组合物来预防和治疗由嗜水气单胞菌引起的疾病的方法会具有对嗜水气单胞菌具有非常高的特异性的优点。这意味着该组合物可以用于预防和治疗由嗜水气单胞菌引起的疾病,而不影响其他有用的共生细菌,并且具有较小的由于其用途而导致的副作用。通常,当使用抗生素时,共生细菌也受到损害,最终降低动物的免疫力,因此,使用抗生素会引起各种副作用。同时,对于各种对相同细菌物种表现出抗菌活性的噬菌体而言,噬菌体的抗菌效果因为抗菌强度或者抗菌谱[即噬菌体对属嗜水气单胞菌物种的各种菌株表现出抗菌活性的范围,因为噬菌体通常对属于相同细菌物种的某些菌株发挥抗菌活性,也就是说,即使属于相同细菌物种,不同菌株对噬菌体的敏感性也各不相同]的不同而有所不同。因此,本发明可以针对嗜水气单胞菌提供与其他对嗜水气单胞菌起作用的噬菌体的抗菌活性不同的抗菌活性,当将其用于工业领域时,这一点将在有效性上产生很大的差异。
附图说明
图1示出了噬菌体Aer-HYP-3的电子显微照片。
图2示出了有关噬菌体Aer-HYP-3杀死嗜水气单胞菌的能力的实验的结果。基于平板培养基的中心线,左侧示出了只使用不包含噬菌体Aer-HYP-3的缓冲液所获得的结果,并且右侧示出了使用包含噬菌体Aer-HYP-3的溶液所获得的结果,在右侧观察到的洁净区是由于试验目标细菌通过噬菌体Aer-HYP-3的作用发生分解而形成的斑块。
具体实施方式
通过以下示例,将更好地理解本发明,仅为了说明本发明而提出这些示例,而不应该将这些示例解释为限制本发明的范围。
示例1:能够杀死嗜水气单胞菌的噬菌体的分离
使用从自然界收集的样品来分离出能够杀死嗜水气单胞菌的噬菌体。此处,用于噬菌体分离的嗜水气单胞菌菌株已由本发明的发明人预先分离并被鉴定为嗜水气单胞菌。
下面详细说明分离噬菌体的过程。将收集到的样品添加到以1/1,000的比率接种了嗜水气单胞菌的TSB(胰蛋白酶大豆肉汤)培养基(酪蛋白消化液,17g/L;大豆消化液,3g/L;葡萄糖,2.5g/L;NaCl,5g/L;磷酸氢二钾,2.5g/L),然后在25℃下振荡培养3至4小时。在培养完成之后,以8,000rpm进行20分钟离心,并且回收上清液。以1/1,000的比率给回收的上清液接种嗜水气单胞菌,然后以25℃振荡培养3至4小时。当样品中包括噬菌体时,总共重复上述过程5次以充分增加噬菌体的数量(滴度)。在重复该过程5次之后,以8,000rpm将培养液离心20分钟。在离心之后,使用0.45μm的过滤器来对回收的上清液进行过滤。将由此获得的滤液用于典型的斑点测定以便检查其中是否包括能够杀死嗜水气单胞菌的噬菌体。
进行斑点测定如下。以1/1,000的比率给TSB培养基接种嗜水气单胞菌,然后以25℃彻夜振荡培养。将如上面描述的那样制备的3ml(OD600为1.5)的嗜水气单胞菌培养液散开在TSA(胰蛋白酶大豆琼脂:酪蛋白消化液,15g/L;大豆消化液,5g/L;NaCl,5g/L;琼脂,15g/L)板上。将板放在洁净的工作台上大约30分钟以使散开的溶液干燥。在干燥之后,在散有嗜水气单胞菌的板上对如上面描述的那样制备的10μl的滤液进行成斑,然后放置大约30分钟进行干燥。干燥之后,在25℃下将经过成斑的板静置培养1天,然后针对在滴有滤液的位置处形成洁净区进行检查。如滤液产生洁净区,则判断其中包括了能够杀死嗜水气单胞菌的噬菌体。通过上述检查,可以获得包含具有杀死嗜水气单胞菌的能力的噬菌体的滤液。
从证实具有能够杀死嗜水气单胞菌的噬菌体的滤液中分离出纯噬菌体。使用典型的噬斑测定来分离纯噬菌体。具体地,使用无菌吸液头回收在噬斑测定过程中形成的噬斑,将噬斑添加到嗜水气单胞菌培养液,然后,在25℃下培养4至5小时。此后,以8,000rpm进行20分钟离心以获得上清液。以1/50的容积比向由此获得的上清液添加嗜水气单胞菌培养液,然后,在25℃下培养4至5小时。为了增加噬菌体的数量,重复上述过程至少5次,在这之后,以8,000rpm进行20分钟离心以提供最终的上清液。使用由此获得的上清液来再次进行噬斑测定。通常,无法通过某个过程的单次迭代即完成纯噬菌体的分离,因此,使用上面形成的噬菌斑来重复上述过程。在重复至少5次之后,获得包含纯噬菌体的溶液。通常会重复分离纯噬菌体的过程直到所产生的噬菌斑在大小和形态方面都变得彼此相似为止。另外,使用电子显微镜来确认纯噬菌体的最终分离。重复上述过程,直到利用电子显微镜检查确认分离出了纯噬菌体为止。以典型的方法进行电子显微镜检查。简而言之,将包含纯噬菌体的溶液装载在铜网上,然后用2%的乙酸铀酰进行负染并且使其干燥。然后,使用透射电子显微镜来观察其形态。在图1中示出了分离出的纯噬菌体的电子显微照片。基于其形态特征,确认如上所分离出的新型噬菌体是肌尾噬菌体科噬菌体。
将包含如上所确认的纯噬菌体的溶液进行以下纯化处理。基于溶液的总容积以1/50的容积比向包含纯噬菌体的溶液添加嗜水气单胞菌培养液,然后,培养4至5小时。此后,以8,000rpm进行20分钟离心以获得上清液。总共重复该过程5次以获得包含足够数量的噬菌体的溶液。使用0.45μm的过滤器对从最后一次离心获得的上清液进行过滤,然后进行典型的聚乙二醇(PEG)沉淀处理。具体地,按照10%PEG 8000/0.5M NaCl向100ml的滤液添加PEG和NaCl,将其在4℃下静置2至3小时,然后,以8,000rpm进行30分钟离心以提供噬菌体沉淀物。将由此获得的噬菌体沉淀物悬浮在5ml的缓冲液(10mM Tris-HCl、10mM MgSO4、0.1%明胶,pH 8.0)中。所得到的材料可以被称为噬菌体悬浮液或者噬菌体溶液。
收集如上面描述的那样纯化的噬菌体,将其命名为噬菌体Aer-HYP-3,然后于2018年2月7日将其保藏在韩国生物科学与生物技术研究所的韩国典型培养物保藏中心(保藏号:KCTC 13479BP)。
示例2:对噬菌体Aer-HYP-3的基因组的分离和序列分析
分离出噬菌体Aer-HYP-3的基因组如下。从使用与示例1中所描述的相同的方法而获得的噬菌体悬浮液中分离出基因组。首先,为了消除悬浮液中所包括的嗜水气单胞菌的DNA和RNA,将200U的DNase I和200U的RNase A添加到10ml的噬菌体悬浮液中,然后将其在37℃下静置30分钟。在将其静置30分钟之后,为了使DNase I和RNase A的活性失活,向其添加500μl的0.5M乙二胺四乙酸(EDTA),然后将所得到的混合物静置10分钟。另外,再将所得到的混合物在65℃下静置10分钟,然后,向其添加100μl的蛋白酶K(20mg/ml)以破坏噬菌体的外壁,然后在70℃下发生反应20分钟。此后,向其添加500μl的10%十二烷基硫酸钠(SDS),然后在65℃下发生反应1小时。在发生反应1小时之后,向所得到的反应溶液添加10ml的苯酚:氯仿:异戊醇的混合溶液,以25∶24∶1的成分比混合该混合溶液,然后将其充分混合。然后,以13,000rpm将所得到的混合物离心15分钟服从而分离各层。在分离出的各层中,选择上层,以1.5的容积比向其添加异丙醇,并且以13,000rpm将其离心10分钟以使基因组沉淀。回收沉淀物,通过添加70%乙醇来对其进行洗涤,并且以13,000rpm将其离心10分钟。回收洗涤过的沉淀物,在真空中使其干燥,然后将其溶解在100μl的水中。重复该过程,从而获得噬菌体Aer-HYP-3的足够量的基因组。
使用Macrogen公司的Illumina Mi-Seq测序仪来对由此获得的基因组进行下一代测序分析,然后获得有关噬菌体Aer-HYP-3的基因组的序列的信息。噬菌体Aer-HYP-3的最终分析出的基因组的大小为54,451bp,并且整个基因组序列由SEQ ID NO:1表示。
在网络上使用BLAST调查了如上所获得的噬菌体Aer-HYP-3基因组序列与先前报道的噬菌体基因组序列的同源性(相似性)。基于BLAST调查的结果,噬菌体Aer-HYP-3的基因组序列被鉴定为与气单胞菌噬菌体pAh6-C(GenBank保藏号KJ858521.1)的序列具有相对较高的同源性(查询范围/同一性:93%/97%)。然而,噬菌体Aer-HYP-3基因组的开放阅读框(ORF)的数量为75,而我们发现气单胞菌噬菌体pAh6-C具有86个开放阅读框,基于此,这两个噬菌体也被评估为不同。
因此,可以得出以下结论:噬菌体Aer-HYP-3是与先前报道的噬菌体不同的新型噬菌体。此外,由于噬菌体的抗菌强度和抗菌谱通常根据噬菌体的类型而变化,因此,认为噬菌体Aer-HYP-3可以提供与先前报道的任何其他噬菌体的抗菌活性不同的抗菌活性。
示例3:对噬菌体Aer-HYP-3杀死嗜水气单胞菌的能力的评估
对分离出的噬菌体Aer-HYP-3杀死嗜水气单胞菌的能力进行了评估。为了对杀伤能力进行评估,以与示例1中所描述的相同的方式使用斑点测定来观察洁净区的形成。使用本发明的发明人分离出的并且鉴定为嗜水气单胞菌的总共15个菌株作为用于对杀伤能力进行评估的嗜水气单胞菌菌株。噬菌体Aer-HYP-3具有总共杀死15个嗜水气单胞菌菌株中的13个菌株的能力,达到了实验目标。在图2中示出了有代表性的实验结果。同时,还对噬菌体Aer-HYP-3杀死迟钝爱德华氏菌、鳗弧菌、鱼肠道弧菌、格氏乳球菌、副乳链球菌、海豚链球菌和杀鲑气单胞菌的能力进行了评估。结果,噬菌体Aer-HYP-3不具有杀死这些微生物的能力。
因此,可以得出以下结论:噬菌体Aer-HYP-3具有很强的杀死嗜水气单胞菌的能力,并且会对许多嗜水气单胞菌菌株表现出抗菌作用,这表明噬菌体Aer-HYP-3可以用作用于预防和治疗由嗜水气单胞菌引起的疾病的组合物的活性成分。
示例4:使用噬菌体Aer-HYP-3来预防嗜水气单胞菌感染的实验
向包含9ml的TSB培养基的试管中添加100μl的浓度为1×108pfu/ml的噬菌体Aer-HYP-3溶液。向另一根包含9ml的TSB培养基的试管中仅另外添加相同量的TSB培养基。然后,向每根试管添加嗜水气单胞菌培养液,使得在600nm处的吸光度达到大约0.5。在添加嗜水气单胞菌之后,将试管转移到在25℃下的培养箱,然后进行振荡培养,在此期间,观察嗜水气单胞菌的生长。如在下面的表1中示出的,观察到:在添加了噬菌体Aer-HYP-3溶液的试管中,嗜水气单胞菌的生长受到抑制,而在未添加噬菌体溶液的试管中,嗜水气单胞菌的生长未受到抑制。
[表1]
对嗜水气单胞菌的生长抑制
上述结果表明:本发明的噬菌体Aer-HYP-3不仅抑制嗜水气单胞菌的生长,而且具有杀死嗜水气单胞菌的能力。因此,得出以下结论:噬菌体Aer-HYP-3可以用作用于预防由嗜水气单胞菌引起的疾病的组合物的活性成分。
示例5:使用噬菌体Aer-HYP-3来预防由嗜水气单胞菌引起的疾病的动物试验
在水箱中分开准备和养殖总共两组虹鳟鱼,每组二十条(平均体重:22.8g;平均体长:14.9cm),进行14天的实验。控制水箱周围的环境,并且使水箱所在的实验室中的温度维持恒定。自实验开始起的整个试验周期内,以典型的饲养方式来向实验组(给予了噬菌体)中的虹鳟鱼提供包含1×108pfu/g噬菌体Aer-HYP-3的饲料。为了与之进行比较,以相同的饲养方式来向对照组(未给予噬菌体)中的虹鳟鱼提供具有相同成分但是不包括噬菌体Aer-HYP-3的饲料。从实验开始之后的第七天起持续2天,另外在饲料中添加1×108cfu/g的嗜水气单胞菌,每天提供两次饲料,从而造成感染嗜水气单胞菌。从实验开始之后的第九天起,每天对所有试验动物进行疖病检查。通过测量体表上的溃疡的大小来对疖病进行评估。根据常用的溃疡大小(US)分数(正常(无溃疡):0;小溃疡(溃疡大小:小于0.5cm):1;大溃疡(溃疡大小:0.5cm或者更大:2))来测量体表上的溃疡的大小。在下面的表2中示出了其结果。
[表2]
体表上的溃疡大小的测量结果(平均值)
从上述结果可见,可以确认本发明的噬菌体Aer-HYP-3在预防由嗜水气单胞菌引起的疾病方面非常有效。
示例6:使用噬菌体Aer-HYP-3来治疗由嗜水气单胞菌引起的疾病
评估噬菌体Aer-HYP-3对由嗜水气单胞菌引起的疾病的治疗效果如下。在水箱中分开准备和养殖总共两组虹鳟鱼,每组四十条(平均体重:23.2g;平均体长:15.4cm),进行14天的实验。控制水箱周围的环境,并且使水箱所在的实验室中的温度维持恒定。从实验开始之后的第五天起持续3天,以典型的饲养方式每天提供两次染有1×108cfu/g嗜水气单胞菌的饲料。从提供染有嗜水气单胞菌的饲料的该过程的最后一天起,在两个水箱中同时观察到实验对象虹鳟鱼出现疖病的临床症状。从用染有嗜水气单胞菌的饲料进行饲养之后的第二天起(从实验开始之后的第八天起),以典型的饲养方式向实验组(给予了噬菌体)中的虹鳟鱼提供包含噬菌体Aer-HYP-3(1×108pfu/g)的饲料。为了进行比较,以相同的饲养方式来向对照组(未给予噬菌体)中的虹鳟鱼提供具有相同成分但是不包括噬菌体Aer-HYP-3的饲料。从强制感染嗜水气单胞菌3天之后的第二天起(从实验开始之后的第八天起),每天对所有试验动物进行疖病检查。如在示例5中示出的,通过测量体表上的溃疡大小来对由嗜水气单胞菌引起的疖病进行评估。在下面的表3中示出了其结果。
[表3]
体表上的溃疡大小的测量结果(平均值)
从上述结果可见,可以确认本发明的噬菌体Aer-HYP-3在治疗由嗜水气单胞菌引起的疾病方面非常有效。
示例7:制备饲料添加剂和饲料
使用噬菌体Aer-HYP-3溶液来制备饲料添加剂,使得每克饲料添加剂包含数量为1×108pfu的噬菌体Aer-HYP-3。按照以下方式来制备饲料添加剂:向噬菌体溶液添加麦芽糊精(50%,w/v),然后将其冻干并最终粉碎成细粉。在上述制备过程中,干燥处理可以是减压干燥、加热干燥或者是室温干燥。为了制备用于比较的对照,不使用噬菌体溶液,而是使用用于制备噬菌体溶液的缓冲液(10mM Tris-HCl、10mM MgSO4、0.1%明胶,pH 8.0)来制备不包含噬菌体的饲料添加剂。
以250的重量比将由此制备的两种饲料添加剂中的一种分别与生鱼为主的湿颗粒混合,从而获得两种最终饲料。
示例8:制备药浴剂
制备药浴剂的方法如下。使用噬菌体Aer-HYP-3溶液来制备药浴剂,使得每毫升药浴剂包含数量为1x108pfu的噬菌体Aer-HYP-3。在制备药浴剂的方法中,添加噬菌体Aer-HYP-3溶液,使得用于制备噬菌体溶液的每毫升缓冲液包含数量为1x108pfu的噬菌体Aer-HYP-3,并且充分地予以混合。为了制备用于比较的对照,原样使用用于制备噬菌体溶液的缓冲液作为不包含噬菌体的药浴剂。
以1,000的容积比用水来稀释由此制备的两种药浴剂,从而获得最终的药浴剂。
示例9:确认虹鳟鱼养殖的饲养效果
使用在示例7和示例8中制备的饲料和药浴剂来评估作为养结果的虹鳟鱼养殖的改善情况。具体地,本评估重点放在死亡率。将总共200条虹鳟鱼分为两组,每组包括100条虹鳟鱼(A组:用饲料进行饲养,B组:用药浴剂进行治疗),进行四个星期的实验。将每一组再分成各包括50条虹鳟鱼的子组,并且将子组分类为施用噬菌体Aer-HYP-3的子组(子组-①)和不施用噬菌体的子组(子组-②)。在本实验中,目标虹鳟鱼是5周龄的虹鳟鱼(平均体重:23.2g;平均体长:15.4cm),并且在分开的彼此以一定的空间间隔放置的水箱中对实验子组中的虹鳟鱼进行养殖。如在表4中示出的那样对子组进行分类和命名。
[表4]
虹鳟鱼饲养实验中的子组分类和表达
在提供饲料的情况下,以如在表4中分类的典型饲养方式来提供示例7中制备的饲料。按照以下典型的治疗方式来进行使用药浴剂的治疗:使用如在示例8中描述的那样制备的药浴剂将鱼浸入如表4中分类的药浴剂的稀释溶液中。下面的表5示出了结果。
[表5]
虹鳟鱼饲养实验中的死亡率
组别
死亡的虹鳟鱼/实验中的虹鳟鱼(数量)
死亡率(%)
A-①
4/50
8.0
A-②
10/50
20.0
B-①
6/50
12.0
B-②
17/50
34.0
上述结果表明:提供根据本发明所制备的饲料和使用根据本发明所制备的药浴剂的治疗在降低虹鳟养殖的死亡率方面是有效的。因此,得出以下结论:本发明的组合物在用于饲养虹鳟鱼时是有效的。
虽然已经参照本发明的示例性实施例明确地示出和描述了本发明,但是本领域的技术人员应了解,具体描述仅是优选实施例,并且本发明的范围不限于此。因此,本发明的范围应由所附权利要求书及其等效物限定。
保藏机构名称:KCTC
保藏号:KCTC 13479BP
登记日期:20180207
国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约
依据细则7.1发布的
原始保藏收据
国际表
保***的名称:iNtRON生物技术有限公司地址:137Sagimakgol-ro,Joongwon-gu,Seongnam-si,Gyeonggi-do,Republic of Korea(邮编13202)
序列表
<110> iNtRON Biotechnology, Co. Ltd.
<120> 新型嗜水气单胞菌噬菌体Aer-HYP-3及其在抑制嗜水气单胞菌细菌生长方面的用途
<130> KP090559
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 54451
<212> DNA
<213> Bacteriophage Aer-HYP-3
<220>
<221> misc_feature
<222> (13443)..(13443)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
catcatcctg aaccagacca ctccggaagg tcaggaaacc gtacgtatcc gtgagaccct 60
gccgctgcag ttcctgccgg ttcagctcca cggtttggtg tacgaagttc cgggtcgtgg 120
ccgcttcggt ggtctggaag tgacctaccc gcgcgccatc gacatctggt acggcctgta 180
ataccccgta actgagggct ccggccctct aatttggaga agataatgca agttcaaaac 240
actactgatc actacatctc tttcgttgct cgtaccaatc ctggtgccaa gaccaaaggc 300
tacgacccac gtggtaatga aatcatgcgt gacgagctgc cgcagctgcg tactgtgacc 360
atccctggtg gtgccactgt cgaagttgac gatgcactct ggaacgctgc taccagcggc 420
aagcctgcca cccgtcaagg tatcgagatg gaaaaggtgc cggtacaact gggttccgac 480
gatccgtcca aggaagccaa gtaccacgtc ctgaaccccg tgggtgacgg caaggtggtg 540
cacttcaatc cggtcatgga gctggtgcga gccggtgatc tgaagatcgt agagcacgcc 600
aagtctgaac tgactctgga agatctgcgg aaggcagttg aactcgctca aggctacgcc 660
ctgcccaagg aagtagacga agagaaactg cagcacatgt acaacgtgct ctgtaagtaa 720
ggacaatcaa tgctcaccta cgattcgtgg ctggacaagt tcccgcagtt cgtagctgtc 780
tctgagcctc aatgggcaga gctccagctc gaagcaaccg tagaaatggg cgccgatgtc 840
tttcgttgga atggccaaga tgcgtacgat attgcccaag gctatctgat ggcgcatctt 900
gctgctcaag cagaatcgaa cgaggcgggg gaccacaccc cgctccaacc gttccgcgag 960
aaagaagttg atgatgtgcg agtcgagtat gcagtgtcga gagatatgca gaataacctc 1020
gacccgtatc tggctaccag ctatggtcag cagtacatca agtggcgacg catggcattt 1080
gctggcccac gtgtgatttg aggttactat gatctcatta gcaccagctt ttggatcgca 1140
caccactact caggtgatgt tgcggttgga aattccaggc cagtacgatg gcgacaacat 1200
ctggattact ggtggttatg gtttagcctt tccaataagg gctacgccaa tcccactagg 1260
tgatccagat tacggcgact acggtaaggc tctgaagtcc gacccgtctg gcgaacggca 1320
accagctcaa atcaagattg catctcgatg gaagctgccg aacaattccc tgatggaata 1380
cggaactgag ttgtacaaga taatccggga aggtgactac cactccgcag ggttctggca 1440
ggccattggt gccacagata ccacactgca tccggtagtg ccgctggatt atccaagtga 1500
tatgatgctg atgtacggca acaagctcgt accagtgtcc cgaatcataa ggccaaggta 1560
tggaaaaagc gggtgatacc cttcgagcta tgaagctcgt ggacctcgct ctgggcaagc 1620
caaagttctc ctatgagatg aagcgcaacc agcctaagcc gaaggtcgac agctttgcag 1680
ctgtgctcct gctcgacgag cgtaatccag gccgtgacag gaacgaagtc attgagactc 1740
caactggatt tatcaaccgg acgtctggag ttcggttggt agtgtttcaa atcttgttca 1800
ccgaaggcat cccagatgtc tctcgattcg tctccagctt tatgcggcct gacgtgcagg 1860
acttcatggt agagaacgat ctcgccgtgt tgaagcacga gaaggtaacg aacaagactc 1920
tgatccttga aaccaactgg gaagtgcgcg agagcgtatt aatcgaatgc ctggtacgcc 1980
ggtcgttcga tagcgagatt ggtatcatct ccgaggtaga tgcaaatggt atctacaacg 2040
agggtgatat gacagtcccg atgcatatca atatcaagga accttgatga gcctttcaat 2100
cactaatgtt gttgacgtca acatcctgat tgccccgaaa gctaaagccc tgcaaagctt 2160
cggcaagctg gtattcgtca ccgacgaaag cccgaaggtg cccctcgctg gtaccatctt 2220
ctcctactct ggcatcgaag ccgtagcaga tgaatgggaa ctgacctctg aggtctacaa 2280
gggtgctacc actttctacg gccagaaccc gagcggttcc ttcatggtcg cgctggcagc 2340
tgctgctact ccggctgttc tgaccggcgg ctccgccgat ctggcagaca tccaggccat 2400
caccgctggt ggctttacca ttcacgtgaa tggcatggct cagaacatca ctgatgttga 2460
cttctccggc gcgtccacac tgaccgctgc cgctgccatc ctggaaggcg agctgactgg 2520
cgttgacgtg accgtgtctg gcaccagctt cgtgctgacc acccagacca tcggtaccgg 2580
tgcgtccatc tctgtggcca ctgccgacat atccggcact gccgccgcac tggcgctgac 2640
caccctgacc ggtgctgtcg tgactgctgc cgttgtgccg gagtctcctg tggaggcact 2700
gaccaaggcc gccgacactg atccgtcctt ctacggcatc gtgctgaaca agaagtggcg 2760
cgacaccgcc caggccattg acaccgccga gtatgctcag gcgtcccgcc gtgtgttctt 2820
caacacctcc aacgaccctg ccactctgga caagaccagc gaagacagca tcgcgtacaa 2880
actgaaaggc atgtccattc agcgcgtgct gactcactac agctccaagc ccaacgagta 2940
cccgtcctgt gcggttgctg gtcgtgcttt cctggtgaac ttcgaaggca ccaacaccac 3000
cattaccctg aacctcaagg tgatgaaggg cgttaccttc gagaagctgc gtcagaccga 3060
gcatgaagca atgcaggcga acaactgcaa cgccatcgtt gacctggccg gtgcattcgt 3120
atactccgac tcccgcatgg gcgacggtac ctggttcgat gctgttcacg gtgtggactg 3180
gctgcagaac cgtatcgaga ccggtatctt caatcggatg tacaccactc cgaccaagat 3240
cccgtatacc gataccggtg tcaccatcat catcgccgag atcgagcagg ccctgcgtca 3300
agcagtgacc aacggtctgg ttgctccggg caataccacc tctggtgagt acctcccgct 3360
gggttacaag atcgtgtaca ttccgactgc acaagtgtct caagccgaca agtccaaccg 3420
tgtctacaaa ggtatcacct ttgaagccgt tggtgccggt gcgatgcaca aggtagtagt 3480
tggtggctcc ttcaacgaat aaggataacg atgaaacagt atagctttta caacgtcgat 3540
cttctggtcg acggtatcct catggaaggc ttctccgact ctgccgcaat catcaccgcg 3600
tctcgtgacg caccgcaaca cggtaaggtg atggatgcgc gtgggaagat ggttgcgatt 3660
acctcagctg acaagtctgg taccgtaacc ttcgacctgc tgcaagtctc tgattccaac 3720
cagtggctgc aggttcgtgc catgcagacc cacgacgccg gtacttccgg tggcactgac 3780
gtcttcctgc cggtgcagct gatgatgaac gataagatgg gtcgcgctgt cgtgaccggt 3840
gttaacggca tcatcaccat gcagcctggt atcgttcgtg gtaccggtgt agcgaccgac 3900
acctgggtta tgcagttcga gcaactgtgg atcctgcgcg gtcagtccga gaacgtcggc 3960
gtctaaccaa catacggagt aaccaatggc ttgtaaagac atgaatcggg ttatcgatga 4020
taatccgatc tatgttcgtc aatggccggc atctgtagcg ttggagaatt taagtgaggc 4080
gttggggctt atgggccccg acttctcttt cttcgtcgac ggatcctacc aattcacgga 4140
catgctgcaa gtgctgcacc gcagcgattc caagcggctc gttgcactgc tgaagaagtt 4200
tgctatggcc gctcgtgtag acggtaaaga gctgcaagaa gcgcagttca accagtacta 4260
cagcggggag atcttcaaga tcttcaaggt attcgccttc gtagcagaag ttaactaccg 4320
agattttttc gagctagggg tacctccagc agagccagac cagcaggaag agcaggacga 4380
gtcgcaagac ccgcagccgc cagcgccgag cttgacccct tagaagaaaa gccgaagacg 4440
ctcgaagagc tgtttcctga ggttgacttc tacttgtatc ggggtgtaat ttgccatccg 4500
cctatgtgct caatgagtga tctgtcggat ggatcattat ctctgtatga cctccatatc 4560
atgcacgaga taatggacct gaaacaagaa ctgaaacaag gagacaaaga tggctaagcg 4620
cccaaccctt tcgattcccc gcaaggcgaa gcacaaaggg cagatgcaga atccgatcaa 4680
tgactttaaa gctgcaaaga gtagtcactc ttatgctgct gcccagtttg acattccaca 4740
aaagccggtg tcaaaaccgc tgcagcgtaa gagtgcctca ttctgggatg atggagaagg 4800
agaggactat gttgagcgca ctatggggcg acccactgag tccatccact ctgaagagta 4860
catcgcacaa gcaactacgc cggaacaaat cctggcgagt cgtatcaacg cggctggccc 4920
tgatgtagca tcggcattca tgtcgcatgt tgccaaggct aagtccctgg ggtcggtaga 4980
ccatacgggc ttcgcgatga gctccaatcc agctgagagg ctgcaataca tggcagggca 5040
aggaggcatc aacctccaga aagtagcatc agctatgcgg cacagggaca agcagtgggg 5100
atcacctgct gcggagggtt cccacgagga agacttctct gtacgtatgg ttgaggctgc 5160
gaagaccaga gcctaccaag gcctgcaaag cccgacacaa cgcgccatgt caatcgtagg 5220
cgcgatgacc accagtgacc agtcctggaa gcagcaagtt gatgctccag atctgataac 5280
ccctgacacc cacgacaagt gggtagaccc tctacagaag gctgtcaacg cggttcagtt 5340
catagctggt gcgtatattg atccgaacaa gctggaaggt ggtgagttcg gacctgccta 5400
cgccgatcta catgggcgcc ttactaaggt gctctcaagg caaatacctg cacggatagc 5460
gaacactggc ttcgagcaag ccacgcgtgg tgctggtagt aagcctgtag gttggaccca 5520
agccttgccg tctgtacagg acgtccgtaa gatgctgccc gtgtctgacc ggatgttcct 5580
caccaacaag ctggataagc tgtgggagga gaagaatggt cgacatgagt caccgttcac 5640
agacgcgatc aagaccatcc gagacgtgta ccgttctggt aacgagggtg gtctgtccaa 5700
gccgaagaac ttcgagtacc gtgagcggca atatctcctt gacgagatgg ctgcatccgg 5760
acttgtagac ccaacccaga ccgtcatttc ccagaaccct ggacgagacg agatgtatga 5820
cttcaaggtc actaccgatg gtggtgagct gatgaactct gcattgcaag cgctgggtgc 5880
aactgccgct gacctcgttg gtgaccctgt catccgggct caagtaaagc gtgctgctgc 5940
tgaaatagct gcaactggtt ctgcaagtac cactgggact gttggagaca acctgacacc 6000
gaaggctgcc ctgctgggta tgcgtgactt cggtggaggg cctatcccgt tccagctgga 6060
gccgtacaag aagttcgagc gtggccgtgg tggtggcgcc accaccagga agaaaaaccc 6120
tgtagcacct gctggcatca agcctggtga tgtaatccaa acagcagcag aggcccaagc 6180
agaagtacgc caacgcactg gtgaccctga cggagccaga gcaaagtatt tcgcagagcg 6240
gccgtggttg aaagccatcg catcggatga tgacaaatca gacccgatgt cggcatggca 6300
gcgcaatcgt cgtggcaaag tgacctcatc cgccgcaggt gccttggcag acccagagtc 6360
tgcaagagga gctttgcatg cagtggtgaa gggggcgctg accaatccca acgacccagt 6420
gtctattggc cgaggctcta tctggactaa gtccggtgat gccctcgaac cagtggcact 6480
ggactggtac cgtaagcacg tcgaccctga tgcctttgaa cctggtctta tctttaaccg 6540
gaacaaggct ggacaggcaa ctactcctga tgctattgct gatggtggtc gccgtaacgt 6600
agaagtgaag tctcgcaaca aattcattga ccccaacaac ccgttggatg ctaatgaagc 6660
gaagactctg cggaagaact acttgcagat gcagcaccag atgtacctca ccggtgcgtc 6720
cagtactgac cttgtcgaga tcctcaggga ccaagagaac cccaatgccc ctctgggcaa 6780
gaacggcctc aacgacaaca acatccgtaa gcgccgtgta gaccgtgatg acgagctcat 6840
ccggcagatg cggccgcaat gggaaacggc aggaaaggca gctgacaaga tcgcaggcct 6900
gaatgaccgt acccagaaga tgttcgccaa agcagtggaa gaaggtaaca ttcagtcctt 6960
cgagaagctg tccaaacgtc acgggattga aggccatgaa gcactcgcag caacgctcgg 7020
gctggcggaa ggcaagggta gtggcggtgg tggcggcggt ggagacaatt ctcgaccgta 7080
ccgtggaaac tacggcgggt tcggcggtcg tgatgctcct actactcttc ggggtggtgt 7140
gcgtggtggc ttagctgcca tgggtcgacc tggtaagatg ctcaacgtag ctcttgctgg 7200
tgctgaaatc ctctgggaca cagcgaacga catcaacgac acaggcctga atctatctgc 7260
gcaagcacgt gcaactggca tgcgtgaaga cttgttccgt aagacacgac tgagtatgac 7320
ccaaggtaaa taccttgatg atgcctcagc aatgtcggac atgtcatcta tcgcgcttgc 7380
caagggaggc ctggaacagg gtttcactga ccgtgctgta aacttggtca ccagtactcg 7440
tggtgccatt actctaggtg acttgcagaa tacaaacctg caagacccgg atgccatcag 7500
aaacctgatg agtcagacag aaagccgtct tcgccgccga ggcgtaagtg aattcggcat 7560
cgcagctact atggaacagt cagggctgaa gtccttactg agtgccactg atgctgctgg 7620
tggtcgtgag tcgttgaaca acgcagtcac gaacatcaat gacaatattc tggaactgaa 7680
gctgacagcc ggtgattacc tggggcagat tgcaggattc ggggaagagt acttcaaggc 7740
catgagctca gcattgcagg acattgctgg ggtgctagcc ccaaatgctg gtggtggtgg 7800
agctcttgtc gaaggacgag ttcctatgtc aacgaccaga gacggtgtca ttggccctgc 7860
catccagtca gccattgatt cagtgactga cttcgccttg cctacaaggg caggtgaact 7920
ggccgacgag atctcattgt tctctggtat gaacggcacg ctacctgagg ctaacagggc 7980
ggcactcgag aagcaattcc gaggcatctc tgcatctcag cgcaacaggg taatggatgc 8040
aatccgcaac gactccttgg ataccaatca actggccaag gacgttcgtg gtggtggcaa 8100
gctagaagtg gagctcaaga ctgatggtat ctctctgact gtgaaagacc agtccggacg 8160
tatcacttcg aaggctttca aaccttatca aggcggagcg gaataacatg ttcggtcgca 8220
ttatgcggtt ggaggcgagg cgggagctca cggcagaccc gttcttcgtc acagacaagc 8280
tgcgcattaa ctgcgaaatc gaaatgtcgt tggcgcagca actggcccaa gccagtatca 8340
ccatctacaa cctgtcagaa gagaactcaa aagctctgac gtcaggtgac catgaggtgg 8400
cctcgaagga caatgctgag tcactgcgag tggcgtctaa agtctttatc cggctctatg 8460
ctggatacca agacgagatg ctggcgaacg gtgaactgcc attggtgata gagggtattg 8520
ttatgaacgc ctacgcgcgt cgtgcagtac cccaccacct cacgcatcta tttgtactgc 8580
cgttggcaag ctcgttcctg agacagccat tcacaccgtt ctctgtgcct cgtggaactc 8640
ccctgaggtt tgtgttggag cggatgacgt gggaggccgg ctttgaagcg gtgacgtttg 8700
atctgccgga ctccatcctg cagcaagaca tgggtggaga agctcttgag ccggaccctg 8760
acttgtacgg cacattgcac aagctaggaa aggcgtattc gtttactttc tctcaaagag 8820
caagtggcat tgggttctac ccgaggatcg acgatagcgc gcagagccac aacgagttca 8880
accatttgca ggctaacgga gaagtctaca acgtcaagcc attcttgctg aaaggcgcac 8940
ctactgttgg tgttgccacg atcagcttcc cgatggtgtt agacgccaaa gtattcccag 9000
gctgggtgat cgatgtccaa gacatctccg gcactcgagg tgacttggcg ttaccctcag 9060
gtggcttgcc tgactactct gcgcttggtg acccgttgtt ctacacggac gacgttgcca 9120
agtacgcagt gctaccacgg tacatgctaa agaaagtcat ccacaagatg gacacctacg 9180
tcgacttgtg ggagacacta gtagttggga ctgttccgac tgctggtgat tatggaaagt 9240
gggagcaaca tggctaacaa actcagagac acaatgatca tctgggagga agagcccgga 9300
tcaggcaagt ggagtgtact cgcatttgac ggtgtagttc gtgaaggtca cagtggggct 9360
gtccaggtaa ctggctatcc tgtggactca ggcttccaag tctcggacca cgccatacgt 9420
cagaaccgta tcatcacact agacaccatc acctcgaata tctcaatgtc agtagctact 9480
agccgcaaga cattcgaaga gtctttcaat gagctgatgg tggccattgg ctcagctcag 9540
acaggcggtg gtgcaccagt atatgatgct ggagaggtgt tcgacccaga gcaggagata 9600
gcttcagctg gccctgcgta ctccgagacc accaaatacg gtcgcgccgg ttacgacaac 9660
gacgctatca atatcaccat cccgtacacc agcattacac ttgggacgat taccaacccg 9720
attgcaacag cgttactctg ccaagtctct atcgacaagg tggacgaagc gctgaacaca 9780
gtcgacaggt tgaacgccct tggcaagctg gtgcatgtgg tgactctgcg tggtgttcgt 9840
aagaactgtg ttatccgcca gtacgatgca atcaacgatg tgaccaactc ctactcagtg 9900
cctatcgcgc tgacactgga gcagatgaac gtggttgacc tgactcgtag tactgtgcag 9960
gtaagtacca actacagtaa cggtgaagtg gtagctcaag agcaggccac tgtccggcga 10020
gtagtccctg aggctgcaac ggtagagaac gccatcaatc cagcggctgt acagctgttg 10080
gctgcaccgg tatctcgtgc ggttcaagct accgctatct ctgacggtga agtaccagac 10140
attgttccgg catcgttcta cgagatggaa caccgtgaag taccattctc cactgggttt 10200
gacactcggt tcatctacga gggcacagag tacacacttg gaagagtgcg gtacaacgtg 10260
actctcggtt gctttgtgac tatcctgcaa tggcggaaag acggaaagta cgagaccatt 10320
gcaagcctgc cgttgcagag cggggtgaat ctcgttaggc agtatgccac caacatgccg 10380
tcattcgtag ctgtgaatac tcaggagcgg aacagcgacc cgtcagcacc agagaacctg 10440
cgactgtata tcatcaaagg gttcgatgaa acattcttag gattgtaatg gacgtcaaga 10500
cgaagacaat tgggactatt gtgtccttcg acccagaaag ccagatggct acggtcaagc 10560
tggcaaccaa cggaaccaac agtactctcg acaccaacta cttcaaccaa gaagggttga 10620
cgctgataga cgtaccggtg gaattcccaa ggtgtggtgc gttcgtaatg acgttccctg 10680
tgaatgcggg agatgactgt atcgtagagt tctatgagtc tggaatagac cactggctct 10740
acgagaacag acgggcgtac aatgtcgtaa atggccggtc agagccagca gcacgcaggc 10800
ggtatagccg taaagacgcg tcctgccgag tggcaatcga caacctcgcc aaccctattg 10860
gtgggttcaa tacctctgga cttgaaatca ggcatcgtaa cggtaaccag aagatggtat 10920
tccatccgga tggagtgatt gaaacgatca gtccgtctga catcaagttc atagccggtg 10980
gagacatcac ctttaaggct gacggaaata tcggtcttga gggctcgaat atcgagtcca 11040
cagccacggg ttccaaccaa gtgaaaggca caagcgtaac actgaagggc caaagcatct 11100
cgatggagca ataatgccag ccgtactcac gcatgtctca aagaccagtg ggcacgatgg 11160
attccctcct acccagtcta agggcggtaa ctcgttcgta ggcattggag gtcatccggt 11220
tatactggta ggccaagaat tcgaaccgca ctctaacggt agtactcaca caccgaagct 11280
gattggcggc tcctcgttca tcaaggtgaa cggagtgcct gtcggactag tcggtgataa 11340
acttgattgt ggcgacacgg tcattgagag cgctactagt ttcttcacag caggaggctg 11400
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gagaaccgat aaactggagt acactgtcca gcttgtcaaa tgcaggctcc ttacctttct 11520
tggtgagtgg gccttgaacc gaggaattgg tgtgccttgg actggagtac tggacaggtc 11580
ttacgacatc tccgcgacga agttcgcaat ccagaacact atccagacca ccgtgggtgt 11640
taagtcactc aattctttat ctctgaaagc ggacccaaca acgcgtctgt tgactgtaga 11700
attcacggcg acgtcgatct acggtgaaat tagcgcagga gtaacggtat gaccggtatt 11760
accgaagctg gaatcacggt caagacttat gacgagtgcg ttcgcagtct cgaacaaaga 11820
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atcaggataa tggcagcatt catctacgat cagtggctgc tggccgagca agcgtaccac 11940
agttacaacc cgtccgtagt gaccggtact ggactggaca accttgttcg gctgaatggc 12000
ctgactcgta tcgtcgatac tccgactcgt gtcggtgtgt acttcgatgc tactactagt 12060
gctggtgagg ttctccctgc tggtactgtg gtagagaccg ccactgacaa aattcaattc 12120
gttaccactc gcagcatcat cctgcctggc gaagtgatcg cgtcgtgcct taccaaaggc 12180
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gttgttgatg gtattcctcc tcacgcattc aggacggtgg tcgagggtgg tgcgctggaa 12480
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ccgtggcaat tgccttcggg taccaaggca tatcgggcga acaatgggct gcggctgcaa 26520
tcctcacgtt catcctttgg atcaccggaa acatcgtagc gagtgtatgc taatggctaa 26580
atttattgca cctgagaaag gcggcttcct gtcctactac gggctgtcga agtaccaact 26640
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ggtcgccggt aacaaggcga tcttcgaata ctgcgaacgt attcgacaaa tgaaccaaca 40080
agaggagaag cctaatggct ttgtttgata aagcaactga gaagtctgct ggtggtaacg 40140
gccagaagat ggaagccccg ctgctggcgc tgggtggcta ccctgccgta ctgatccgta 40200
tcgtcgacct cggcgagcag cccggctccg ctcagtaccc cgacccgtcc tacaagatgg 40260
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