具体实施方式

图1示出了根据实施例的荧光显微镜100的示意图。荧光显微镜100被配置为估计STED分辨率，如在下文中详细解释的。首先，将简要概述荧光显微镜100的基本结构。

荧光显微镜100包括在图1中通常被称为102的成像单元和处理器104，处理器104可以被配置为控制荧光显微镜100的整体操作。

成像单元102包括激发光源106，激发光源106用于发射激发光L1，激发光L1适于激发样本108内的激发焦点中存在的荧光团以自发地发射荧光L3。激发光L1的波长适合于特定实验中使用的荧光团。成像单元102还包括损耗光源110，损耗光源110用于发射损耗光L2，损耗光L2适合于损耗由激发光L1生成的激发焦点的外部区域。选择损耗光L2的波长，使得当用损耗光L2照射时，受激发射可靠地诱导存在于样本108中的荧光团从其激发态返回到基态。具体地，损耗光L2的波长可以近似等于荧光团在从激发态转变为基态时发射的荧光L3的波长。

激发光源106将激发光L1发射到镜114上，镜114将激发光L1反射到第一波长选择分束器116上。分束器116将激发光L1反射到朝向扫描设备120传输激发光L1的第二波长选择分束器118上。

损耗光源110将损耗光L2发射到相位掩模122上，相位掩模122以如下方式影响激发光L2：在激发焦点的区域中，光L2的空间分布呈现最小值，优选为零，并且从最小值陡然上升。在穿过相位掩模122之后，损耗光L2在镜124上反射到第二波长选择分束器118上，从第二波长选择分束器118损耗光L2被反射到扫描设备120。

扫描设备120被配置为将由分束器118叠加的激发光L1和损耗光L2移向物镜126，物镜126将叠加的光分布L1/L2聚焦到样本108中。通过操作扫描设备120，叠加的光分布L1/L2在样本108上移动，从而利用叠加的光分布L1/L2扫描样本108内的多个点。

用叠加的光分布L1/L2照射的样本108发射荧光L3，荧光L3通过物镜126返回到扫描设备120。因此，图1的示例性配置提供了荧光L3的所谓反扫描检测。随后，荧光L3通过分束器118、116并落在检测器128上。

不用说，分束器116、118表现出与激发光L1、损耗光L2和荧光L3的波长相适应的光谱特性，以便能够通过反射和透射来导光，如图1所示。

检测器128可以被配置为通过检测荧光的强度来执行图像采集。替代地或附加地，检测器128可以被配置为通过对表示从样本108发射的荧光L3的荧光光子应用时间选通检测来执行图像采集。因此，在处理器104的控制下，检测器128检测荧光光子并取决于荧光光子在检测器128上的到达时间来分类荧光光子。例如，检测器128被配置为通过应用时间相关的单光子计数来检测到达时间。为此，检测器128检测相对于开始时间的荧光光子的到达时间，开始时间可以由激发光源和损耗光源106、110之一发射的光脉冲来限定。

在图1中所示的特定示例中，可以假设激发光源106和损耗光源110均由脉冲激光源形成。然而，此配置仅是示例。例如，根据替代实施例，损耗光源110可以被配置为发射损耗光L2的连续波(CW)激光。

图2是示出在激发光源106和损耗光源110都是脉冲激光源的情况下，在处理器104的控制下由检测器128执行的时间选通检测的示意图。根据图2，激发光源106在检测时间选通器TG1期间输出具有P1的脉冲持续时间的激发脉冲。随后，损耗光源110在检测时间选通器TG2期间输出具有脉冲持续时间P2的损耗脉冲DP。如图2所示，激发脉冲EP和损耗脉冲DP暂时不重叠。通过应用两个分开的检测时间选通器TG1和TG2，检测器128允许生成表示纯共焦图像的第一帧和表示纯STED图像的第二帧。在图3中，左侧显示了模拟的共焦图像，右侧显示了模拟的STED图像。如下面详细解释的，表示共焦图像的第一帧和表示STED图像的第二帧可以用于估计STED分辨率。在这方面，要注意的是，第一帧不限于共焦图像。准确地说，可以使用任何帧来表示参考图像，只要此参考图像具有可以预先确定的分辨率以用作估计未知STED分辨率的参考即可。

在下文中，将解释根据实施例的用于估计STED分辨率的方法。在此实施例中，仅一个STED帧用于确定其分辨率。然而，如下文所示，该方法也可以应用于例如通过在激发脉冲之后应用多个检测时间选通器所创建的多个STED帧。

图4示出了流程图，该流程图示出了根据实施例执行的用于估计STED分辨率的方法步骤。

在步骤S1中，从视场生成表示参考图像的第一帧，例如，通过应用检测时间选通器TG1的图像采集。如上所述，参考图像可以是共焦图像，但不限于此。在任何情况下，参考图像具有可以预先确定的特定参考分辨率。例如，参考图像的分辨率可以仅取决于用于生成参考图像的光学系统的光学参数。根据图1的示例性配置，可以通过收集来自样本108的荧光L3的物镜126来形成上述光学系统。因此，可以基于物镜126的光学参数预先确定参考分辨率。

在步骤S2中，从相同视场生成表示STED图像的至少一个第二帧，例如，通过应用检测时间选通器TG2的图像采集，其中STED图像具有将通过所述方法估计的STED分辨率。执行步骤S1和S2的顺序没有特别的关系，可以颠倒。

在步骤S3中，通过将卷积核应用于第二帧来模糊表示STED图像的第二帧。卷积核包括至少一个拟合参数，这将在下面更详细地说明。

在步骤S4中，确定卷积核的拟合参数的优化值，其中，优化值使第一帧和通过包括拟合参数的卷积核而模糊的第二帧之间的差最小化。

最后，在步骤S5中，基于在步骤S4中已经确定的拟合参数的优化值，并且基于预先已知的预定参考分辨率，估计STED分辨率。

在下文中，解释了图4的一般方法的具体实现。

首先，更详细地说明在图4的步骤S3中应用的合适的卷积核。在此示例中，二维(x，y)高斯模糊核f_Δ由等式(1)表示：

在步骤S3中，用等式(1)中限定的高斯模糊核f_Δ对表示STED图像的第二帧(F₁)进行模糊。因此，当未模糊的第二帧由F₁指定时，在步骤S3中创建的模糊的第二帧由f_Δ*F₁给出。优选地，通过执行如上面由符号“*”指示的卷积来实现表示STED图像的第二帧(F₁)的模糊。

等式(1)中限定的高斯模糊核包括三个未知参数α、β和σ_Δ。为了最小化第一帧(共焦)(由F₀指定)和模糊的第二(STED)帧f_Δ*F₁之间的差，根据等式(2)的以下最小化问题考虑如下：

通过求解根据等式(2)的最小化问题，可以估计差分辨率σ_Δ。假设第一帧F₀是纯共焦帧，则STED分辨率由等式(3)给出：

与取决于内部荧光团性质的STED分辨率σ_STED相比，由σ_confocal表示的共焦分辨率仅取决于光学系统的光学参数，即，取决于图1的实施例中的物镜124的光学参数和激发光的波长。共焦分辨率σ_confocal可以根据等式(4)限定：

在等式(4)中，λ是激发光L1的波长，并且NA是物镜126的数值孔径。因数是高斯的标准偏差和在半最大值半宽度(HWHM)之间的转换因数。

因此，使用等式(4)，可以仅基于光学系统的光学参数来估计STED分辨率，而无需考虑任何未知的内部荧光团参数。

严格来说，等式(4)仅在共焦和STED点扩散函数(PSF)均为高斯的情况下才有效。但是，等式(4)可以很好地近似用于典型的实值PSF。

在上面说明的示例中，为了简洁，考虑了二维情况。但是，扩展到三维(x，y，z)的情况是直接的。在三维情况下，可以考虑根据等式(5)的三维高斯核：

在等式(5)中，σ_Δ和σ_Δz分别是横向和轴向差宽度。

再次要注意，分别根据等式(2)和(5)的二维和三维高斯核仅仅是用于模糊第二帧F₁的合适的卷积核的示例。可以使用其他核，例如基于球贝塞尔函数的核或基于艾里函数的核。但是，最好使用高斯模糊核，因为确定核的拟合参数的优化值所需的数值工作量小。

还要注意，基于等式(2)估计的差分辨率σ_Δ受到噪声的显著影响。为了说明噪声影响，图5示出了随变化噪声模拟共焦图像的计算的结果。具体地，曲线C1示出了针对信噪比SNR的不同值，基于等式(2)估计的差宽度σ_Δ。对于小的SNR值，估计的差宽度σ_Δ与指示真实宽度的线C2所表示的预期宽度有所不同。仅在大的SNR值的限制下，精确估计才是可能的。但是，STED图像通常是非常有噪的。另外，估计的噪声依赖性在很大程度上取决于图像内容，这使得系统分析变得困难。

为了解决噪声问题，发明人根据等式(2)进行了最小化问题的一些理论分析。基于适当的近似，可以解决关于差宽度的最小化。近似解由等式(6)给出：

在等式(6)中，未知常数β₁和β₂是取决于图像内容并且在实际实验中不可接近的参数。信噪比SNR可以根据等式(7)限定为STED图像的平均光子计数的平方根：

正如预期的那样，等式(6)在大的SNR值的限制内收敛到真实值σ_GT，如图5中所示。如果可以从同一个视场中以不同的噪声水平进行多个STED采集，则这三个未知参数β₁、β₂、σ_GT可以通过图5中曲线C₃所示的曲线拟合来估计/计算。但是，这种多重曝光采集在实际实验中不容易执行。例如，光毒反应或待成像的生物样本的移动阻止了不同采集的定性比较。因此，在下文中，提出了一种方法，该方法使得能够从单个共焦帧和单个STED帧估计未知参数β₁、β₂、σ_GT。

为了估计拟合参数β₁、β₂、σ_GT，需要至少三个输入点。为了提供这些输入点，需要应用STED帧的降采样。例如，因数为2的降采样可用于创建四个具有与原始帧不同的SNR值的帧，如图6中所示。为此，可以应用分箱处理，其中将帧的相邻像素组合成像素块，以提高信噪比。

例如，通过从2x2像素配置中挑选一个像素(在图6a中显示为斑点区域)，创建具有与原始STED帧相同的信噪比SNR₀的第一降采样像素(在图6a中显示为水平阴影线区域)。然后，通过组合两个相邻像素，创建第二降采样像素，其SNR值高出倍(请参见图6b)。以相同的方式，创建了第三和第四降采样像素。结果，可以生成具有SNR值SNR₀、 和2SNR₀的四个降采样帧F₁₁、F₁₂、F₁₃、F₁₄(分别参见图6a、6b、6c和6d)。此外，通过分箱对共焦帧进行降采样，以创建具有信噪比2SNR₀的降采样共焦帧F₀′。

基于降采样共焦帧和四个降采样STED帧，根据对于不同的SNR值的四个估计可以根据等式(8)实现：

σ＝[σ_Δ,1,σ_Δ,2,σ_Δ,3,σ_Δ,4] (8)

可以根据等式(9)通过最小二乘最小化来获得宽度的经噪声校正的估计：

其中ζ(x)＝η₀+η₁/(x+η₂)，η₁＝β₁/SNR₀以及η₂＝β₂/SNR₀。然后，通过σ_Δ,corr＝η₀来给出经噪声校正的差分辨率。

因此，针对多个降采样帧中的每一个执行STED分辨率的估计，并且基于针对所有降采样帧估计的多个STED分辨率来确定经SNR校正的STED分辨率。

校正后，估计的噪声依赖性变得很小，如图7中所示，针对差宽度σ_Δ，比较经校正的估计和未校正的估计。在图7中，曲线C_uncorr示出了未校正的估计，并且曲线C_corr示出了经校正的估计。

基于估计的分辨率模拟STED点扩散函数f的合适方法是根据等式(10)假设高斯PSF：

尽管根据等式(10)的近似被认为是很好的近似，但是也可以采用更复杂的PSF模型。例如，可以应用荧光团的两级模型。在这种情况下，必须估计两个未知参数，即饱和因数ζ和荧光团的寿命τ。饱和因数ζ可以基于等式(11)从共焦分辨率和STED分辨率直接计算得出：

荧光团的寿命τ可以例如通过荧光寿命成像显微术(FLIM)确定。

图8(从图8a桥接到图8b)示出了说明方法的具体实施方式的流程图，方法尤其包括上述噪声校正。然而，尽管上面的解释提到其中激发光源106和损耗光源110均由脉冲激光源形成的示例，但是可以将图8的实施例修改为有利地适用于损耗光源110是连续发射而不是以光脉冲形式发射损耗光L2的CW激光的情况。通过使用CW激光损耗，方法可以应用于通过时间选通检测创建的多个STED帧，时间选通检测在激发光源106发射的激发脉冲之后使用多个时间选通器。

图8中所示的方法开始于步骤S10，在步骤S10中，激活荧光显微镜以进行成像。在步骤S12中，表示例如共焦图像的第一帧以及N个STED帧从同一个视场中生成。在此特定示例中，共焦帧可以是在将激发脉冲应用到样本之后不久被检测到的帧。这样的帧基本上还没有受到损耗光的影响，并且因此可以被认为表示共焦图像。在步骤S14中，将共焦帧和N个STED帧存储在存储器中，其中在图8中，共焦帧由F0指定，并且STED帧由F1至FN指定。

在步骤S16中，共焦帧F0和STED帧F1至FN中的每一个被降采样。具体地，以上参考图6说明的降采样过程被应用于STED帧F1至FN中的每个。例如，通过对STED帧F1进行降采样，多个具有信噪比SNR₀、和2SNR₀的降采样帧F11至F14被创建。以相同的方式，针对STED帧F2至FN获得具有不同SNR的降采样帧。注意，图8通过示例的方式示出了用于每个STED帧F1至FN的四个降采样帧的数量。然而，由于用于从给定像素全体中选择一个或多个像素的可能组合的数量，可以考虑多于四个帧。例如，有4种可能性(从4种可能性中选择1种)从SNR₀中进行选择，有6种可能性(从4种可能性中选择2种)从中进行选择，有4种可能性(从4种中选择3种)从中进行选择，有一种可能性(选择全部4种)从2SNR₀进行中选择。在步骤S18中，将降采样帧存储在存储器中。

在步骤S20中，通过基于等式(12)应用最小二乘最小化，为第k个STED帧(k＝1，…，N)和第j个降采样帧估计差宽度σ_Δkj：

最小化可以例如通过Levenberg-Marquardt算法实施。注意，对于仅考虑一个STED帧的情况，等式(12)对应于上述等式(2)。在步骤S22中存储差宽度σ_Δkj。

在步骤S24中，如以上参考等式(9)所说明的，基于差宽度σ_Δkj对每个STED帧F1至FN执行噪声校正。结果，获得了每个STED帧的差宽度σ_Δk。

在步骤S26中，如以上参考等式(3)所说明的，针对每个STED帧F1至FN估计STED分辨率。

在步骤S28中，基于假设高斯PSF的等式(10)，针对每个STED帧F1至FN计算STED点扩散函数。

在步骤S30中，可以基于针对多个STED帧F1至FN确定的PSF来执行多图像去卷积。

最后，在步骤S32中，可以将在步骤30中通过多图像去卷积获得的结果合并为单个去卷积结果F_decon。

如本文所使用的，术语“和/或”包括一个或多个相关列出的项目的任何和所有组合，并且可以缩写为“/”。

尽管已经在装置的上下文中描述了一些方面，但是很明显，这些方面也表示了对相应方法的描述，其中块或设备对应于方法步骤或方法步骤的特征。类似地，在方法步骤的上下文中描述的方面也表示对相应装置的相应块或项目或特征的描述。方法步骤中的一些或全部可以通过(或使用)硬件装置，例如，处理器、微处理器、可编程计算机或电子电路来执行。在一些实施例中，这种装置可以执行最重要的方法步骤中的一个或多个。

取决于特定实施要求，本发明的实施例可以以硬件或软件来实现。可以使用非暂时性存储介质，例如数字存储介质，例如软盘、DVD、蓝光、CD、ROM、PROM和EPROM、EEPROM或FLASH存储器执行上述实现，非暂时性存储介质上存储有电子可读控制信号，该电子可读控制信号与可编程计算机系统协作(或能够协作)，从而执行相应的方法。因此，数字存储介质可以是计算机可读的。

根据本发明的一些实施例包括具有电子可读控制信号的数据载体，电子可读控制信号能够与可编程计算机系统协作，从而执行本文描述的方法之一。

通常，本发明的实施例可以被实现为具有程序代码的计算机程序产品，当计算机程序产品在计算机上运行时，该程序代码可操作用于执行一种方法。程序代码可以例如被存储在机器可读载体上。

其他实施例包括存储在机器可读载体上的，用于执行本文描述的方法之一的计算机程序。

换句话说，因此，本发明的实施例是一种计算机程序，其具有当计算机程序在计算机上运行时用于执行本文描述的方法之一的程序代码。

因此，本发明的另一个实施例是存储介质(或数据载体，或计算机可读介质)包括存储在其上的计算机程序，该计算机程序用于在由处理器执行时执行本文所述的方法之一。数据载体，数字存储介质或记录介质通常是有形的和/或非过渡的。本发明的另一个实施例是如本文所述的装置，其包括处理器和存储介质。

因此，本发明的另一实施例是表示用于执行本文描述的方法之一的计算机程序的数据流或信号序列。数据流或信号序列可以例如被配置为经由数据通信连接，例如经由互联网来传送。

另一实施例包括处理装置，例如计算机或可编程逻辑器件，其被配置为或适于执行本文描述的方法之一。

另一实施例包括一种计算机，该计算机上安装了用于执行本文描述的方法之一的计算机程序。

根据本发明的另一实施例包括一种装置或系统，此装置或系统被配置为(例如，以电子方式或光学方式)将用于执行本文描述的方法之一的计算机程序传送给接收器。接收器可以是例如计算机、移动设备、存储设备等。此装置或系统可以例如包括用于将计算机程序传送到接收器的文件服务器。

在一些实施例中，可编程逻辑器件(例如，现场可编程门阵列)可以用于执行本文描述的方法的一些或全部功能。在一些实施例中，现场可编程门阵列可以与微处理器协作以便执行本文描述的方法之一。通常，该方法优选地由任何硬件装置执行。

附图标记列表

100 荧光显微镜

102 成像单元

104 处理器

106 激发光源

108 样本

110 损耗光源

114、124 镜

116、118 分束器

120 扫描设备

122 相位掩膜

126 物镜

128 检测器

L1 激发光

L2 损耗光

L3 荧光