阅读说明：本技术 真皮再生片用生物墨水组合物、利用其的定制型真皮再生片的制造方法以及利用所述制造方法制造的定制型真皮再生片 (Bio-ink composition for dermal regeneration sheet, method for producing customized dermal regeneration sheet using same, and customized dermal regeneration sheet produced by said production method ) 是由 柳石焕 于 2018-10-19 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种真皮再生片用生物墨水组合物(adipose tissue derived stromal vascular fraction)以及利用其的定制型真皮再生片的制造方法,所述真皮再生片用生物墨水组合物包括：包含脂肪组织源性基质血管组分、细胞外基质及纤维蛋白原的第一液；以及包含凝血酶的第二液。(The present invention relates to a bio-ink composition for a regenerated dermis (induced structural vacuum fraction) comprising: a first fluid comprising adipose tissue-derived stromal vascular fraction, extracellular matrix, and fibrinogen; and a second liquid comprising thrombin.)

真皮再生片用生物墨水组合物、利用其的定制型真皮再生片 的制造方法以及利用所述制造方法制造的定制型真皮再生片

技术领域

本说明书要求于2018年1月31日向韩国专利局提交的韩国专利申请第10-2018-0012220号的申请日的权益，其全部内容包含于本说明书。

本发明涉及一种真皮再生片用生物墨水组合物、利用其的定制型真皮再生片的制造方法以及利用所述制造方法制造的定制型真皮再生片。

背景技术

本说明主张2018年1月31日向韩国专利厅提交的韩国专利申请第10-2018-0012220号的申请日的利益，其内容全部包含于本说明。

本发明涉及一种真皮再生片用生物墨水组合物、利用其的定制型真皮再生片的制造方法及利用所述制造方法制造的定制型真皮再生片。

作为发明背景的技术

皮肤作为覆盖人体整个表面的最大器官，执行防止体液流失、阻止有害物质和微生物从外部侵入、保护我们身体免受物理刺激、放射线和紫外线等的功能。皮肤具有毛囊、毛发、汗腺、皮脂腺等多个附属器官，是除保护膜功能之外还执行多种不同功能的重要的综合性器官。皮肤大致分为表皮层(epidermis)、真皮层(dermis)及皮下组织(subcutaneoustissue、hypodermis)。

真皮层作为位于表皮之下的层，是提供基质以支撑血管、神经等多种不同结构物的层，由胶原蛋白、弹性纤维及细胞外基质(extracellular matrix)组成。真皮层大致由上层部的成纤维细胞(fibroblast)丰富且有毛细血管分布的***层(papillary layer)和厚胶原纤维丰富的网状***(reticular connective tissue)组成。

皮肤组织中，组织的一部分可因烧伤、外伤及皮肤疾病等而受损，此时，为了治愈受损的组织或为了再造整形，使用移植本人皮肤组织的自体移植(autograft)、移植他人皮肤的同种移植(homograft、allograft)、移植动物皮肤的异种移植(heterograft、xenograft)方法。在这些方法中，自体移植最为理想，但是难度在于：当治疗部位是大范围时，能够确保组织的部位有限，且取皮部位会留下新的伤口部位。同种移植起到帮助伤口周边部细胞移动和治愈的作用，而不是帮助永久植活。

人工皮肤(skin equivalent或reconstructed skin)是利用皮肤细胞和作为皮肤组成物质的胶原蛋白、弹性蛋白等的三维重建皮肤，由于是由活成纤维细胞与角质形成细胞组成的，并表现出与实际皮肤类似的形态学、生理学特性，因而称为仿生皮肤(skinequivalent或reconstructed skin)。人工皮肤研发于1980年，旨在治疗需要进行皮肤移植，却由于烧伤程度过重或是患部过大而无法仅凭自身皮肤进行移植的重度烧伤患者，通过持续的改良与研究，目前应用于皮肤生理研究、皮肤刺激评价、皮肤功效评价等多种不同领域。但是，原有的人工皮肤在制造方法方面，问题在于，在组织培养中出现真皮逐渐收缩的现象，且在真皮收缩严重时，人工皮肤整体形态发生变形。

原有的细胞治疗剂采用了利用同种细胞进行移植或是移植自体细胞的方法。同种细胞的移植虽然具有旁分泌(paracrine)效应，但问题在于，其会被身体视作异物(foreignbody)而最终消失。此外，在通过注射注入方法来移植自体细胞时，如果细胞没有生长所需的环境(例如，支架)，则消失的概率高，终将难以看到注入的细胞所带来的效果。

此外，将自体组织取一部分进行增殖培养的自体移植，问题在于，有供区发生疤痕的可能性、当移植部位大时，供区不足等；同种移植及异种移植，问题在于，有免疫排斥反应或引发炎症等。因此，实情是，需要开发一种方法，能够用于替代或再生受损的皮肤，并将如上所述副作用最小化。

[现有技术文献]

[专利文献]

韩国授权专利公报：10-1710615

发明内容

发明所要解决的技术问题

本发明旨在提供一种能够将移植排斥反应最小化、并能够用于制造患者定制型真皮再生片的真皮再生片用生物墨水组合物、利用其的定制型真皮再生片的制造方法以及真皮再生片。

解决技术问题的技术手段

本发明的一种实施状态提供一种真皮再生片用生物墨水组合物，包括：包含脂肪组织源性基质血管组分、细胞外基质及纤维蛋白原的第一液；以及包含凝血酶的第二液。

本发明的另一实施状态提供一种定制型真皮再生片的制造方法，包括：a)利用3D扫描仪来获取缺损的真皮部位的三维数据的步骤；b)利用包含脂肪组织源性基质血管组分、细胞外基质及纤维蛋白原的第一液，形成与所述获取的三维数据的形状对应的第一层的步骤；c)将包含凝血酶的第二液涂布于所述第一层上而形成第二层的步骤；以及d)所述第一层及所述第二层进行反应而形成真皮再生片的步骤。

本发明的又一实施状态提供一种利用所述制造方法制造的定制型真皮再生片。

发明的效果

根据本发明的真皮再生片用生物墨水组合物以及利用其的定制型真皮再生片的制造方法，优点在于，能够制造适合患者受损的皮肤组织的真皮再生片。具体地，本发明的定制型真皮再生片的制造方法能够3D扫描患部的准确形态，制造形状与患部一致的真皮再生片。

根据本发明的真皮再生片，优点在于，能够无免疫排斥反应地进行移植，此外，能够在短时间内制造，因此能够将健康的细胞移植到患部。

附图说明

图1示出了为制造根据本发明的定制型真皮再生片而分别制备第一液及第二液的过程。

图2显示了对根据实验例1的定制型真皮再生片的细胞存活能力进行确认的照片。

图3显示了用来实现实验例2的动物实验中，去除皮肤的照片。

图4显示了根据实验例2制造的对照组以及实施例的定制型真皮再生片。

图5显示了根据实验例2的定制型真皮再生片的移植过程。

图6显示了实验例2的动物实验中的马松三色染色结果。

图7是利用CD31染色观察的根据实验例2的动物实验结果——移植部位形成血管与否。

具体实施方式

在本说明书中，当提到某构件位于另一构件“之上”时，这不仅仅涉及某构件与另一构件接触的情形，还包括还有其他构件存在于两构件之间的情形。

在本说明书中，当提到某部分“包括”某组成要素时，只要没有特别记载相反的情况，这并不意味着排除其他组成要素，而是意味着还可包括其他组成要素。

以下对本发明进行详细说明。

本发明的一种实施状态提供一种真皮再生片用生物墨水组合物，包括：包含脂肪组织源性基质血管组分(adipose tissue derived stromal vascular fraction)、细胞外基质及纤维蛋白原的第一液；以及包含凝血酶的第二液。

本发明的真皮再生片用生物墨水组合物为二液型，所述第一液与所述第二液在依次涂布后，能够反应而形成真皮再生片。具体地，所述第二液中的凝血酶与所述第一液中的纤维蛋白原能够反应而形成纤维蛋白网络，这能够起到充分固定所述脂肪组织源性基质血管组分以及细胞外基质的作用。

所述脂肪组织源性基质血管组分(adipose tissue derived stromal vascularfraction)包括脂肪组织源性干细胞(adipose derived stem cells)。优选地，所述脂肪组织源性基质血管组分实质上可以不包含除脂肪组织源性干细胞之外的其他细胞(例如，脂肪细胞、红血球细胞及其他基质细胞等)以及细胞外基质物质，更优选地，可以完全不包含其他细胞及细胞外基质物质。

所述脂肪组织源性基质血管组分可以从同种动物或异种动物的脂肪组织提取。优选地，所述脂肪组织源性基质血管组分可以从自体脂肪组织提取。更具体地，所述脂肪组织源性基质血管组分可以利用手术对象患者或动物的脂肪组织来进行提取。所述脂肪组织源性基质血管组分可以从脂肪组织中以微簇体(微或纳米SVF/ECM簇，micro or nano SVF/ECM Cluster)形态提取脂肪组织源性基质血管组分(SVF)和细胞外基质(ECM)等而获取，还可以根据需要单独分离使用纯脂肪组织源性基质血管组分(SVF)和细胞外基质(ECM)。作为一例，可以利用Tiss'you公司的Lipocell试剂盒，从脂肪组织提取。只是，并非限定于此，所述脂肪组织源性基质血管组分可以利用本行业所知的方法及提取试剂盒等获取。

根据本发明的一种实施状态，所述第一液中的脂肪组织源性基质血管组分的浓度可以为10⁵个/ml至10⁷个/ml。当所述脂肪组织源性基质血管组分的浓度在所述范围内时，所制造的定制型真皮再生片能够在移植部位有效执行向真皮细胞的分化。

所述脂肪组织源性基质血管组分的含量越高，则效果越提高，然而当其含量过高时，细胞外基质及纤维蛋白原等所带来的效果则难以显现。因此，所述脂肪组织源性基质血管组分的含量可以是第一液中的其他组成成分含量的余量。

将所述脂肪组织源性基质血管组分与脂肪组织源性细胞外基质合用，能够促进向真皮细胞的分化。具体地，所述脂肪组织源性细胞外基质具有供治愈患部伤口所必需的细胞生长分化所需的生化因子，能够提供脂肪组织源性基质血管组分分化为真皮细胞后可以固定的物理环境。

根据本发明的一种实施状态，所述细胞外基质可以从同种或异种动物的脂肪组织(或细胞)提取。此外，所述细胞外基质可以从同种或异种动物的纤维化组织(或细胞)提取。具体地，所述细胞外基质可以从自体脂肪组织(或细胞)提取，或者是自体纤维化组织(或细胞)。更具体地，所述细胞外基质可以利用手术对象患者或动物的脂肪细胞来进行提取。

根据本发明的一种实施状态，所述细胞外基质可以是脱细胞的。

根据本发明的一种实施状态，所述细胞外基质可以为直径5μm至100μm的颗粒。具体地，所述细胞外基质可以以物理方法脱细胞并粉碎为颗粒状备用。进而，所述细胞外基质可以利用本行业所知的方法获取。

通过所述第一液的纤维蛋白原和所述第二液的凝血酶的反应而得的纤维蛋白基质，能够起到固定所述脂肪组织源性基质血管组分和所述细胞外基质的作用。

根据本发明的一种实施状态，所述第一液中的细胞外基质的含量可以为20wt％至60wt％。具体地，所述第一液中的细胞外基质的含量可以为20wt％至50wt％。当所述细胞外基质的含量在所述范围内时，分化为真皮细胞的细胞的存活率提高，能够有效实现缺损的真皮部位的再生。当所述细胞外基质的含量过高时，用于制造真皮再生片的纤维蛋白原与凝血酶的含量相对减少，从而产生所制造的真皮再生片的形态难以保持的问题。此外，当所述细胞外基质的含量过少时，用于制造真皮再生片的纤维蛋白原与凝血酶的含量过高，致使所制造的真皮再生片过于坚实而产生细胞外基质所带来的效果难以预期的问题。因此，优选将所述细胞外基质的含量调节为所述范围，从而使分化为真皮细胞的细胞的存活率提高，进而使真皮再生片的形状也容易保持。

根据本发明的一种实施状态，所述第一液中的纤维蛋白原的浓度可以为4㎎/ml至50㎎/ml。此外，所述第一液中的纤维蛋白原的浓度可以为5㎎/ml至40㎎/ml，或者是7㎎/ml至30㎎/ml。

根据本发明的一种实施状态，所述第二液中的凝血酶的浓度可以为30IU/ml至250IU/ml。此外，所述第二液中的凝血酶的浓度可以为40IU/ml至250IU/ml，40IU/ml至100IU/ml，或者是45IU/ml至80IU/ml。

当所述纤维蛋白原及所述凝血酶的浓度在所述范围内时，能够确保固化速度适当，并使所述脂肪组织源性基质血管组分的分布保持均匀。由此，能够在所制造的定制型真皮再生片中，使细胞分布保持均匀，并在移植定制型真皮再生片之后，使细胞分化能力得以有效实现。此外，当所述纤维蛋白原及所述凝血酶的浓度在所述范围内时，优点在于，能够很好地保持所制造的真皮再生片的形态，并且能够保持适当的硬度，因此移植能够适合患部。

根据本发明的一种实施状态，所述第一液还可以包含抑肽酶。所述抑肽酶(aprotinin)作为胰腺分泌的蛋白酶的抑制剂，是由总共58个氨基酸组成的多肽。据悉，主要从牛肺提取，在血液中阻止纤维蛋白分解，从而起到止血作用。

根据本发明的一种实施状态，每1ml第一液可以包含所述抑肽酶900KIU至1,100KIU(kininogen Inactivator Unit，激肽原灭活剂单位)，具体可以包含1000KIU。

根据本发明一种实施状态，所述第二液可以是分散于氯化钙溶液中的凝血酶。具体地，所述第二液可以每1ml包含40IU至250IU的凝血酶、5㎎至6.5㎎的氯化钙。

所述第一液及第二液的溶剂可以为水，具体可以为生理盐水。此外，所述第一液中的纤维蛋白原与所述第二液中的凝血酶可以通过商用的纤维蛋白胶试剂盒购入。

所述第一液与第二液在10分钟以内，优选地，在5分钟以内完成反应，因而所述真皮再生片用生物墨水组合物，优点在于，可以在手术现场利用3D打印机当场制造真皮再生片。

本发明将由纤维蛋白原及纤维蛋白组成的纤维蛋白胶用作粘合剂，这能够确保高于透明质酸粘合剂或胶原蛋白粘合剂的粘性，因而所述定制型真皮再生片具有与患部的优秀粘合力，进而能够保持高强度。

本发明的另一实施状态提供一种定制型真皮再生片的制造方法，包括：a)利用3D扫描仪来获取缺损的真皮部位的三维数据的步骤；b)利用包含脂肪组织源性基质血管组分、细胞外基质及纤维蛋白原的第一液，形成与所述获取的三维数据的形状对应的第一层的步骤；c)将包含凝血酶的第二液涂布于所述第一层上而形成第二层的步骤；以及d)所述第一层及所述第二层进行反应而形成真皮再生片的步骤。

此外，根据本发明的一种实施状态，还可以包括：a1)利用3D打印机制造与所获取的三维数据的形状对应的模具的步骤；在步骤b)中，可以在所述模具内涂布所述第一液。

步骤a)可以利用本行业所知的3D扫描仪装备或3D打印装备。此外，步骤a1)可以利用本行业所知的3D打印装备。所述模具能够起到在涂布所述第一液及第二液时能够固定立体形态的作用。所述模具可以在形成所述定制型真皮再生片后去除。所述模具可以利用本行业一般使用的生物相容性高分子形成。

根据本发明的一种实施状态，步骤b)及步骤c)可以利用喷墨打印或3D打印执行。具体地，步骤b)及步骤c)可以利用本行业所知的具有2个以上喷嘴的打印装置，各个喷嘴可以分别吐出所述第一液及第二液而制作立体形状。进而，在形成所述第一层时，可以利用3D打印机或喷墨打印机，使具有均匀的细胞分布，防止所述定制型真皮再生片内的细胞成团现象等。

根据本发明的一种实施状态，步骤b)及步骤c)可以交替重复执行2次以上。具体地，当需要形成体积大的真皮再生片时，可以交替执行步骤b)及步骤c)，从而以如同“第一层/第二层/第一层/第二层”的方式层叠后，进行凝固而形成真皮再生片。

根据本发明的一种实施状态，步骤d)可以在10分钟以内完成，优选地，可以在5分钟以内完成。具体地，步骤d)可以为，反应3分钟至7分钟、所述第一层及所述第二层进行反应而形成定制型真皮再生片。

在本发明的定制型真皮再生片的制造方法中，所述脂肪组织源性基质血管组分及细胞外基质可以从患者或动物的脂肪组织提取以备用，无需额外的培养步骤。在利用其制造所述第一液后，能够在短时间内制造所述定制型真皮再生片并移植到患部，因此能够将细胞活性最大化。

此外，所述定制型真皮再生片的制造方法能够制造与患部形状相同的真皮再生片，因而可以将移植部位与真皮再生片之间的间隙最小化，从而在恢复后呈现自然的状态。

本发明的又一实施状态提供一种利用所述制造方法制造的定制型真皮再生片。

所述定制型真皮再生片，如前所述，能够利用患者或动物的脂肪组织，在短时间内制造成适合患部的形状后，进行移植。所述真皮再生片能够移植到患部，通过敷料保护患部，以求受损的皮肤恢复。所述定制型真皮再生片在移植后，脂肪组织源性基质血管组分分化为真皮细胞，分化的真皮细胞固定于所述脂肪组织源性细胞外基质及纤维蛋白基质内，能够使受损的皮肤得以恢复。

以下，为了具体说明本发明，举实施例进行详细说明。但是，根据本发明的实施例可以变形为其他各种形态，本发明的范围不被解释为限定于以下所叙述的实施例。提供本说明书的实施例，是旨在向本行业普通技术人员更完整地说明本发明。

脂肪组织源性基质血管组分(SVF)

脂肪组织源性基质血管组分(SVF)细胞通过下述步骤获取。

1.在无菌手术室中，在医生主导下实施吸脂术，提取约60cc的脂肪组织，按与之相同的量，添加0.075％的胶原酶(collagenase)，在37℃温度下，通过230rpm的振荡培养，使其反应30分钟。

2.如上所述进行反应后，将反应物在25℃下，以420g[相对离心力(RelativeCentrifugal Force，RCF)]速度离心分离10分钟，离心分离结果，分成了SVF团粒层、胶原酶层以及油层3个层。

3.去除除SVF团粒层之外的上部液，将SVF团粒层用磷酸盐缓冲盐水(PhosphateBuffered Saline，PBS)进行再悬浮后，利用100μm的尼龙过滤器(Cell strainer)去除经再悬浮的SVF层的纤维质以及残留的杂质。

4.将经过滤的包含SVF的溶液再悬浮，进行3次离心分离后，进行去除而只留下最下层的团粒后，利用细胞计数器计算有核细胞的结果，能够确认：获取了每1ml为0.26×106个至2.2×106个的SVF。

细胞外基质(ECM；extracellular matrix)

在无菌手术室中，在医生主导下实施吸脂术，提取脂肪组织后，将其混入生理盐水中。并且，利用12,000rpm至20,000rpm条件的均质器，以机械方式从脂肪组织分离ECM后，对其进行离心分离。将把离心分离后的沉淀物再次离心分离的过程重复3次至5次之后，最终获取ECM。

实验例1–用于确认定制型真皮再生片内的细胞存活能力的体外实验

图1示出了为了制造本发明的定制型真皮再生片而分别制备第一液及第二液的过程。具体地，利用混合注射器(mix syringe)将所述获取的SVF和ECM混合后，利用混合注射器(mix syringe)，与混合了4.5㎎/ml纤维蛋白原的抑肽酶液1ml混合而制造了第一液。此时，将第一液中的ECM含量如图2所示调节为10wt％或20wt％。

进而，制备了与所制造的第一液相同体积的、分散有凝血酶的氯化钙溶液。此时，将第二液中的凝血酶的浓度如图2所示调节为7.8IU/ml至250IU/ml。

涂布所制备的第一液而形成第一层后，在第一层上涂布所制备的第二液而制造了定制型真皮再生片。

图2显示了对根据实验例1的定制型真皮再生片的细胞存活能力进行确认的照片。具体地，图2是针对定制型真皮再生片进行用于确认活细胞的绿色荧光calcein-AM(钙黄绿素AM)染色以及用于确认质膜损失与否的红色荧光ethidium homodimer-1(溴乙啡锭二聚体1，EthD-1)染色后，利用共焦显微镜[Confocal microscope(leica、TCS SP5)]确认了细胞存活能力。根据图2，能够确认，当ECM的含量为20wt％时，SVF与ECM之间的相互作用(interaction)提高，细胞增殖变得活跃，进而能够确认，当凝血酶浓度为50IU/ml以上时，细胞的增殖更活跃。

实验例2–用于确认定制型真皮再生片的功效的动物实验(体内实验)

为了验证根据本发明的真皮再生片的功效，将4月龄猪的皮肤以2.5㎝×2.5㎝大小去除后，如前述方法，从猪的脂肪组织获取SVF及ECM。图3显示了用来呈现实验例2的动物实验中，去除皮肤的照片。

进而，利用混合注射器(mix syringe)将所述获取的SVF和ECM混合后，利用混合注射器(mix syringe)，与混合有9㎎/ml纤维蛋白原的抑肽酶液1ml混合而制造了第一液。此时，第一液中的ECM的含量为20wt％，SVF的浓度为6.25×106个/ml。此外，制备了包含50IU/ml浓度的凝血酶的第二液。

并且，利用3D扫描仪，扫描去除的皮肤区域后，使用3D Bio 3D打印机(INVIVO、ROKIT)，依次涂布所制备的第一液及第二液后，固化5分钟，制造了定制型真皮再生用片。将如此制造的真皮再生用片移植到去除的皮肤区域后进行敷料处理，对皮肤的恢复程度观察了14日。

作为对照组，在第一液中不包含ECM，以相同方法制造定制型真皮再生片，移植于去除的皮肤区域后进行敷料处理，对皮肤的恢复程度观察了14日。

图4显示了根据实验例2制造的对照组以及实施例的定制型真皮再生片。

图5显示了根据实验例2的定制型真皮再生片的移植过程。具体地，图5显示了将根据对照组(仅SVF)以及实施例(SVF+ECM)的定制型真皮再生片进行移植的照片，显示了从移植当日(零日)至14日后的经过。

图6显示了实验例2的动物实验中的马松三色染色结果。具体地，图6对于无受损的皮肤(正常)区域、去除皮肤的区域(仅缺陷)以及在去除皮肤的区域移植了根据实施例的定制型真皮再生片(SVF+ECM)的区域，分别在去除皮肤后经过14日后进行马松三色染色并观察。根据图6，能够确认，当去除皮肤后放置14日时(仅缺陷)，胶原复合体在真皮层以很低的浓度形成。与此相反，当移植根据实施例的定制型真皮再生片(SVF+ECM)时，能够确认，真皮层染色成鲜明的蓝色，胶原复合体在真皮层以高密度形成，且表皮层染色成鲜明的红色，能够确认，作为表皮层组成成分的角蛋白、细胞质等形成。

图7是利用CD31染色观察的根据实验例2的动物实验结果——移植部位形成血管与否。具体地，图7对于无受损的皮肤(正常)区域、去除皮肤的区域(仅缺陷)以及在去除皮肤的区域移植了根据实施例的定制型真皮再生片(SVF+ECM)的区域，分别在去除皮肤后经过14日后进行CD31染色并观察血管再生与否。根据图7，能够确认，当去除皮肤后放置14日时(仅缺陷)，染色成褐色的血管区域呈现为很零星和很窄。与此相反，能够确认，当移植根据实施例的定制型真皮再生片(SVF+ECM)时，染色成褐色的血管生成区域以大片、多数存在。

根据实验例2的各项实验结果可知，当把根据本发明的定制型真皮再生片移植于皮肤时，能够促进皮肤再生，进而还能够促进皮肤内的血管生成，从而能够恢复至类似于原本的皮肤。