阅读说明：本技术 一种新型人工皮肤及其制备方法 (Novel artificial skin and preparation method thereof ) 是由 高秀岩 曲梁静 姜红 于 2020-03-20 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种新型人工皮肤及其制备方法。该新型人工皮肤制备方法具体如下：取新鲜动物离体皮肤,通过氢氧化钠、DNA酶、胰蛋白酶、十二烷基硫酸钠、过氧乙酸、PBS等一系列处理后获得脱细胞真皮基质,超声混合将氧化石墨烯与脱细胞真皮基质溶液混匀,再通过富集处理后得到一种新型人工皮肤。本发明能够生产成分均一、稳定的脱细胞真皮基质,添加氧化石墨烯增加了基质物理强度,富集处理为表皮干细胞的黏附、爬行及生长提供了优良环境,对创面愈合具有显著效果。该新型人工皮肤的应用,不仅能阻止细菌对受损创面的入侵、破坏,防止创面感染,而且能有选择性的诱导干细胞向皮肤细胞分化,促进创面皮肤再生,提高移植成功率。(The invention provides a novel artificial skin and a preparation method thereof. The preparation method of the novel artificial skin comprises the following steps: taking fresh animal in-vitro skin, carrying out a series of treatments such as sodium hydroxide, DNA enzyme, trypsin, sodium dodecyl sulfate, peracetic acid, PBS and the like to obtain an acellular dermal matrix, carrying out ultrasonic mixing to uniformly mix graphene oxide and an acellular dermal matrix solution, and carrying out enrichment treatment to obtain the novel artificial skin. The invention can produce the acellular dermal matrix with uniform and stable components, the addition of the graphene oxide increases the physical strength of the matrix, the enrichment treatment provides excellent environment for the adhesion, crawling and growth of epidermal stem cells, and the invention has obvious effect on wound healing. The application of the novel artificial skin can not only prevent bacteria from invading and damaging the damaged wound surface and prevent wound surface infection, but also selectively induce stem cells to differentiate towards skin cells, promote the regeneration of the wound surface skin and improve the success rate of transplantation.)

一种新型人工皮肤及其制备方法

技术领域

本发明属于组织工程生物材料领域，具体涉及一种新型人工皮肤及其制备方法。

背景技术

皮肤是覆盖和保护体表的重要组织器官，由于炎症、溃疡、烧伤、先天性畸形等原因造成的皮肤缺损和异常在临床中是常见现象。对于这种组织缺损目前多采用自体皮肤移植的方法，但是自体皮肤的来源极为有限且取材时会对患者造成二次伤害，影响治疗进程。鉴于此，组织工程皮肤是最具潜力的治疗方法，而脱细胞真皮基质作为一种天然细胞外基质材料，具备良好的机械特性、组织相容性和较低的免疫原性，是用于组织修复重建的良好基质，也是组织工程研究常用的天然支架材料，已经广泛用作皮肤及软组织创面修复。

氧化石墨烯是一种性能优异的新型碳材料，其结构跨越了一半化学和材料科学的典型尺度，可视为一种非传统型态的软性材料，具有聚合物、胶体、薄膜，以及两性分子的特性。①含氧活性基团的引入使氧化石墨烯具有很强的表面活性和润湿性，能够在常用溶剂中形成稳定的分散溶液；②良好的亲水性、分散性以及相容性，又可作为补强填充材料，避免了使用化学交联试剂，这一系列优良的性能决定了氧化石墨烯具有很高的使用价值；③大量研究结果表明，GO 对多种常见细菌均显示出优异的抗菌活性，适宜的作用时间和浓度以及与纳米复合物的结合可以让GO的抗菌能力得到很好的利用；④同时GO生物安全性高，具有很强的表面吸附能力，吸附血清蛋白形成蛋白包裹体，对细胞呈现很低的细胞毒性，表面经聚乙二醇、壳聚糖、透明质酸等多聚物修饰、功能化的GO几乎没有细胞毒性。脱细胞真皮基质力学强度不足、降解快，氧化石墨烯具有良好的力学性能，但缺乏促进细胞黏附、生长的功能；二者的有效结合既增加了材料强度，也更有利于促进干细胞的黏附、爬行及生长，加快创面损伤的修复。

细胞生长因子是一种多功能强力细胞因子，对促进成纤维细胞的代谢和胶原蛋白的形成发挥着重要功能。细胞生长因子通过与细胞表面特异受体结合，调控皮肤上皮，内皮和基质细胞的分裂、繁殖和生长分化，能促进与皮肤损伤有关细胞的迅速生长繁殖，并调节细胞间基质的合成、分泌及分解，促进角质层细胞的再生，加速皮肤角质层和基质层的修复，促进人体皮肤细胞的生长。富集技术通过基质材料适当的网孔结构和良好的表面黏附性能，材料黏附时选择性滞留有利于皮肤再生的细胞生长因子等成分，促进创周细胞的长入和血管的生成，诱导干细胞向皮肤细胞分化，对创面愈合具有促进作用。

专利（CN201910132697.0）公开了一种胶原蛋白-氧化石墨烯-脂肪脱细胞基质微载体的制备方法，用α-淀粉酶水溶液和醋酸匀浆得到脂肪脱细胞基质溶液，并与胶原蛋白-氧化石墨烯溶液混合作为分散相通入微流控芯片，将含有span-80的正癸醇作为连续相通入微流控芯片，获得包裹有正癸醇的脱细胞基质-胶原蛋白-氧化石墨烯液滴，并通过交联液交联得到所述微载体。该方法虽能生产成分较均一的脱细胞基质微载体，但添加的化学试剂多，交联液使用EDC/NHS较难去除干净，后续产品使用过程中安全隐患多。专利（CN201510508880.8）公开了一种脱细胞真皮基质及其制备方法，对真皮层皮片分别进行脱脂处理、病毒灭活处理和去除免疫原性处理以及脱水、冻干和定型，得到脱细胞真皮基质。但方法中脱脂步骤使用的有机溶剂如正己烷、异丙醇均有毒，丙酮更为易制毒化学品，虽脱脂处理较完善，但试剂残留难去除，增加了产品安全隐患，不利于后续产品的临床使用。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型人工皮肤及其制备方法，通过将同种或异种动物皮肤进行一系列处理后，获得含有促进皮肤再生的丰富的结构蛋白、多糖、粘连蛋白及生长因子的新型人工皮肤。该人工皮肤的应用，不仅能阻止细菌对受损创面的入侵、破坏，防止创面感染，而且富集的细胞生长因子能有选择性的诱导干细胞向皮肤细胞分化，促进创面皮肤再生，提高移植成功率。

本发明提供的技术方案为：所述一种新型人工皮肤的制备方法，具体步骤如下：

1、脱细胞真皮基质的制备包括以下步骤：

a.取新鲜的动物离体皮肤，氢氧化钠溶液浸泡，去离子水冲洗干净，刮除多余的体毛及皮下附带的脂肪组织；

b.将得到的表皮组织机械粉碎成小块，去离子水振荡冲洗3~5次，沥干水分；

c.依次用DNA酶、胰蛋白酶-EDTA、十二烷基硫酸钠、过氧乙酸振荡处理步骤b中得到的组织，去离子水漂洗干净；

d.用PBS溶液振荡处理表皮组织，去离子水漂洗干净，沥干水分，冷冻干燥；

2、脱细胞真皮基质溶液的制备：将步骤1得到的脱细胞真皮基质溶于胃蛋白酶溶液中，37℃振荡处理，得到脱细胞真皮基质溶液；一边振荡一边滴加氢氧化钠适量调节溶液pH至中性；

3、氧化石墨烯-脱细胞真皮基质溶液的制备：将氧化石墨烯粉末与步骤2得到的脱细胞真皮基质溶液用超声细胞破碎仪在冰浴条件下进行超声混匀，得到均匀的氧化石墨烯-脱细胞真皮基质溶液；

4、新型人工皮肤的制备：

a.将上述处理过的氧化石墨烯-脱细胞真皮基质溶液倒入光滑的平底模具中，冷冻干燥，得到一种疏松多孔的脱细胞真皮基质；

b.将上述脱细胞真皮基质进行富集处理：取废弃包皮组织或皮肤皮片标本，用无钙镁的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）浸泡3次，除去皮下脂肪并剪成约0.5×1cm²的片状，再用PBS清洗，然后放入0.25%胰蛋白酶溶液中，于4℃消化18~22h后取出，从真皮上揭下表皮，置于盛有5mL国产DMEM培养液的小瓶内，用滴管轻轻吹打培养液，使表皮细胞离散到培养液中，用滤网过滤，弃去残余的表皮，获得表皮细胞的培养液。通过负压吸引装置，使含表皮细胞的培养液反复流经上述制备好的脱细胞真皮基质，使细胞生长因子高效富集于基质材料内部，低温烘干后得到一种新型人工皮肤。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤1a所述动物离体皮肤来源于哺乳动物例如人、猪、兔、牛、羊、鼠等的表皮；所述氢氧化钠溶液的浓度为0.05-0.5mol/L，浸泡时间5-10h。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤1c中使用的DNA酶浓度为40-60U/mL；胰蛋白酶溶液为包含0.05~0.5%w/v的胰蛋白酶和0.05~0.25%w/v的EDTA混合溶液，振荡处理时间为1~6h。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤1c中使用的十二烷基硫酸钠浓度为0.02~0.5%w/v，振荡处理时间为1~6h；所述过氧乙酸体积分数为0.2~1.0%，振荡处理时间为0.5~2h。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤1d中使用的PBS溶液振荡处理1-2h，重复3-5次。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤2中使用的胃蛋白酶溶液浓度为0.2~0.8mg/mL，振荡处理时间为22~30h；所述中性为pH值6.8-7.5，需边振荡边加入氢氧化钠。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤3中使用的氧化石墨烯质量分数为0.25~0.5%；超声细胞破碎仪工作条件为25%强度、超声时间2min、间隔时间4s，冰浴条件下进行。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤4b所述低温烘干的温度为28-32℃。

作为本发明的一种优选技术方案，所述一种新型人工皮肤，在使用前用少量患者自身新鲜血液或体液浸润，可减少使用过程中引起的免疫排斥反应，其使用效果要优于去离子水或生理盐水。

作为本发明的一种优选技术方案，所述一种新型人工皮肤采用如上任一项所述的新型人工皮肤的制备方法制备得到。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

（1）本发明通过先粉碎再脱细胞的方式去除皮肤组织中的免疫原性物质，既能完整的保留皮肤组织细胞外基质成分，又能达到优良的脱细胞效果，且在脱细胞过程中使用的都是性质较温和的试剂，最大程度的保留了皮肤细胞外基质的活性成分；

（2）将天然的材料脱去细胞后，在经一定的交联剂处理使其具备良好的机械特性、良好的三维结构、较好组织相容性和较低的免疫原性，是组织工程研究常用的方法。但是目前这些方法存在一定的问题，化学交联剂的使用会对环境造成一定污染，后续处理增加成本，试剂残留还会造成严重的细胞毒性，极大的影响临床使用。脱细胞真皮基质是组织工程中常用的可降解材料，但其力学强度不足、降解快；氧化石墨烯具有良好的力学性能，但缺乏附近细胞黏附、生长的功能；二者的有效结合能够生产出成分均一、性能优良的脱细胞真皮基质，既增加了材料强度，也更有利于促进干细胞的黏附、爬行及生长，加快创面损伤的修复。氧化石墨烯是一种性能优异的新型碳材料，其结构跨越了一半化学和材料科学的典型尺度，可视为一种非传统型态的软性材料，具有聚合物、胶体、薄膜，以及两性分子的特性。含氧活性基团的引入使氧化石墨烯具有很强的表面活性和润湿性，能够在常用溶剂中形成稳定的分散溶液，良好的亲水性、分散性以及相容性，又可作为补强填充材料，这一系列优良的性能决定了氧化石墨烯具有很高的使用价值；

（3）富集处理技术利用基质材料疏松多孔的结构和良好的表面黏附性能，材料黏附时选择性滞留有利于皮肤再生的细胞生长因子等成分，促进创周细胞的长入和血管的生成，诱导干细胞向皮肤细胞分化，促进与皮肤损伤有关细胞的迅速生长繁殖，并调节细胞间基质的合成、分泌及分解，加速皮肤角质层和基质层的修复，促进人体皮肤细胞的生长，对创面愈合具有特异性促进作用。

具体实施方式

实施例1：

（1）取新鲜的猪离体头层中厚皮500g，加入1000mL浓度为0.5mol/L的氢氧化钠溶液浸泡10h，去离子水冲洗干净，沥干水分。刮除多余的体毛及皮下附带的脂肪组织，将得到的真皮剪碎成0.3cm的小块，去离子水振荡冲洗5次，每次20min；

（2）依次用60U/mL的DNA酶、0.25%w/v胰蛋白酶溶液（含0.1%w/vEDTA）振荡处理2h，0.3%十二烷基硫酸钠振荡处理1.5h，0.4%过氧乙酸溶液振荡处理1h，PBS溶液振荡处理1h，每一步骤结束都用去离子水漂洗干净，沥干水分。将得到的脱细胞真皮基质冷冻干燥；

（3）取步骤（2）制得的脱细胞真皮基质20g溶于400mL浓度为0.5mg/mL的胃蛋白酶溶液中，37℃振荡处理25h，得到脱细胞真皮基质溶液。一边振荡一边向该基质溶液中滴加适量氢氧化钠溶液，调节pH值为7.4；

（4）将1.2g氧化石墨烯粉末与步骤（3）中获得的脱细胞真皮基质溶液混合，用超声细胞破碎仪以25%强度、超声时间2min、间隔时间4s在冰浴条件下进行超声混匀，得到均匀的氧化石墨烯-脱细胞真皮基质溶液；

（5）将步骤（4）中获得的氧化石墨烯-脱细胞真皮基质溶液倒入光滑的平底模具中，冷冻干燥，得到一种疏松多孔的脱细胞真皮基质；

（6）取废弃的人包皮组织标本，用无钙镁的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）浸泡3次，除去皮下脂肪并剪成约0.5×1cm²的片状，再用PBS清洗，然后放入0.25%胰蛋白酶溶液中，于4℃消化18~22h后取出，从真皮上揭下表皮，置于盛有5mL国产DMEM培养液的小瓶内，用滴管轻轻吹打培养液，使表皮细胞离散到培养液中，用滤网过滤，弃去残余的表皮，获得表皮细胞的培养液。通过负压吸引装置，使含表层细胞的培养液反复流经上述制备好的脱细胞真皮基质，使细胞生长因子高效富集于基质材料内部，32℃烘干后得到一种新型人工皮肤。

实施例2：

（1）取新鲜的兔离体皮肤600g，加入1200mL浓度为0.05mol/L的氢氧化钠溶液浸泡6h，去离子水冲洗干净，沥干水分。刮除多余的体毛及皮下附带的脂肪组织，将得到的真皮剪碎成0.5cm的小块，去离子水振荡冲洗3次，每次10min；

（2）依次用40U/mL的DNA酶、0.1%w/v胰蛋白酶溶液（含0.05%w/vEDTA）振荡处理1h，0.2%十二烷基硫酸钠振荡处理1h，0.2%过氧乙酸振荡处理1h，PBS溶液振荡处理1h，每一步骤结束都用去离子水漂洗干净，沥干水分。将得到的脱细胞真皮基质冷冻干燥；

（3）取步骤（2）制得的脱细胞真皮基质40g溶于800mL浓度为0.2mg/mL的胃蛋白酶溶液中，37℃振荡处理22h，得到脱细胞真皮基质溶液。一边振荡一边向该基质溶液中滴加适量氢氧化钠溶液，调节pH值为7.0；

（4）将2g氧化石墨烯粉末与步骤（3）中获得的脱细胞真皮基质溶液混合，用超声细胞破碎仪以25%强度、超声时间2min、间隔时间4s在冰浴条件下进行超声混匀，得到均匀的氧化石墨烯-脱细胞真皮基质溶液；

（5）将步骤（4）中获得的氧化石墨烯-脱细胞真皮基质溶液倒入光滑的平底模具中，冷冻干燥，得到一种疏松多孔的脱细胞真皮基质；

（6）取猪皮肤标本，用无钙镁的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）浸泡3次，除去皮下脂肪并剪成约0.5×1cm²的皮片，再用PBS清洗，然后放入0.25%胰蛋白酶溶液中，于4℃消化18~22h后取出，从真皮上揭下表皮，置于盛有5mL国产DMEM培养液的小瓶内，用滴管轻轻吹打培养液，使表皮细胞离散到培养液中，用滤网过滤，弃去残余的表皮，获得表皮细胞的培养液。通过负压吸引装置，使含细胞生长因子的培养液反复流经上述制备好的脱细胞真皮基质，使细胞生长因子高效富集于基质材料内部，28℃烘干后得到一种新型人工皮肤。

实施例3：

（1）取18只相同环境下生长的成年小白鼠，雌雄各半分成3组，分别命名为实验组1、实验组2和对照组并编号，适应性饲养1周后用于实验；

（2）将18只小鼠背部同一位置剃毛，消毒处理后人为造成小面积的表层皮肤缺损性创伤；

（3）实验组1中6只小鼠分成两组，A组3只用实施例1中制得的猪源人工皮肤修补创面，使用前用少量小鼠血液浸润人工皮肤材料；B组3只用实施例1中制得的猪源人工皮肤修补创面，使用前用少量生理盐水浸润人工皮肤材料；

（4）实验组2中6只小鼠分成两组，C组3只用实施例2中制得的兔源人工皮肤修补创面，使用前用少量小鼠血液浸润人工皮肤材料；D组3只用实施例2中制得的兔源人工皮肤修补创面，使用前用少量生理盐水浸润人工皮肤材料；

（5）对照组中6只小鼠分成两组，均不使用人工皮肤修补创面，E组直接进行创面缝合，F组裸露创面伤口；

（6）将术后所有小白鼠分笼饲养，定期观察小鼠的精神状态、进食情况以及伤口愈合程度并形成记录。观察发现，两个实验组的小鼠伤口愈合状况均良好，A组和C组炎症反应轻于B组和D组；对照组E组和F组均出现轻重不一的红肿现象，创面处有瘢痕组织形成，伤口愈合缓慢；

（7）实验表明，该专利方法制备的新型人工皮肤用于皮肤创面修复具有良好的效果。该人工皮肤的应用，不仅能阻止细菌对受损创面的入侵、破坏，防止创面感染，而且富集的细胞生长因子能有选择性的诱导干细胞向皮肤细胞分化，促进创面皮肤再生，提高移植成功率。

对所公开的实施例的上述说明，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他实施例，都属于本发明保护的范围。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其他实施例中实现。