阅读说明：本技术 一种构建皮肤组织的纳米纤维凝胶复合基质的制备方法 (Preparation method of nanofiber gel composite matrix for constructing skin tissue ) 是由 陈苏 崔婷婷 余加飞 王格飞 于 2019-11-18 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种构建皮肤组织的纳米纤维凝胶复合基质的制备方法,将猪源纤维蛋白粘合剂中的主体胶溶解液注入主体胶冻干粉中,得到纤维蛋白溶液；将聚己内酯和丝素蛋白加入到含有甲酸的容器中得到PCL/SF的纺丝液；将PCL/SF纺丝液作为内相,纤维蛋白溶液作为外相,进行纺丝,得到由纤维蛋白包覆的PCL/SF核-壳纳米纤维组成的纳米织物；将冻干粉催化剂溶液喷在得到的纳米织物上形成凝胶,得到构建皮肤组织的纳米纤维凝胶复合基质。该方法易于操作和通用,使腹部全层厚度皮肤缺损处可以实现大面积皮肤再生。(The invention relates to a preparation method of a nanofiber gel composite matrix for constructing skin tissues, which comprises the steps of injecting a main body gel dissolving solution in a porcine fibrin adhesive into main body gel lyophilized powder to obtain a fibrin solution; adding polycaprolactone and silk fibroin into a container containing formic acid to obtain a PCL/SF spinning solution; taking the PCL/SF spinning solution as an internal phase and the fibrin solution as an external phase, and spinning to obtain a nano fabric consisting of the PCL/SF core-shell nano fibers coated by fibrin; and spraying the freeze-dried powder catalyst solution on the obtained nano fabric to form gel, thereby obtaining the nano fiber gel composite matrix for constructing the skin tissue. The method is easy to operate and universal, and can realize large-area skin regeneration at the skin defect part with the full thickness of the abdomen.)

一种构建皮肤组织的纳米纤维凝胶复合基质的制备方法

技术领域

本发明涉及一种纳米织物的制备方法，尤其涉及一种构建皮肤组织的纳米纤维凝胶复合基质的制备方法。

背景技术

在自然界中，人类避免外界的侵扰主要依赖于皮肤。皮肤，作为身体的外部上皮，维持机体的内环境平衡，并在一生中修复损伤。模仿皮肤来获得具有先进潜力的人工材料是非常可取的。为此目的，已经开发了许多技术(如皮肤移植、伤口常驻细胞的重新编程)和材料(如多孔泡沫塑料、生物相容膜、生物材料和功能凝胶)。然而，对于大面积烧伤甚至肠道暴露修复腹部的研究进展是低效的，而且这确实是该领域的一大挑战。为了快速构建患者的皮肤组织实现再生，必须开发更快速和有效的皮肤再生方法和新的人造材料，尤其是具有优异的生物相容性、组织再生和非手术干预有关的人造材料，否则人造材料永远无法与人类皮肤相媲美。

纳米织物提供了一个细胞外的类皮肤基质，可以更好地补充细胞且能容易地结合生物活性分子，增强营养物质和氧气的渗透。因此，大规模制备超薄直径、高渗透性、良好的互连孔结构和生物相容性的超细纳米纤维薄膜作为生物材料具有重要意义。然而，基于目前的纤维纺丝技术:静电纺丝、微流控纺丝和溶液气喷纺丝，制备大面积纳米纤维支架材料似乎还很不容易。同时，纳米纤维支架密封胶的可用性，以确保湿润的皮肤愈合环境和皮肤组织再生仍然是一个屏障。密封剂与织物支架同步耦合是非常理想的，这将使成纤维细胞很容易与纳米纤维支架结合，加快组织再生，同时消除炎症和毒性作用。因此，利用简易有效、低成本的方法快速制备纳米凝胶复合基质可以结合纤维基质(强机械性能)和凝胶(保持湿润的伤口愈合环境)的优点。

发明内容

本发明的目的在于为了改进现有技术的不足而提供了一种构建皮肤组织的纳米纤维凝胶复合基质的制备方法，该方法易于操作和通用，使腹部全层厚度皮肤缺损处可以实现大面积皮肤再生。

本发明的技术方案为：一种构建皮肤组织的纳米纤维凝胶复合基质的制备方法，其具体步骤如下：

a.将猪源纤维蛋白粘合剂中的主体胶溶解液注入主体胶冻干粉中，得到纤维蛋白溶液；将聚己内酯PCL和丝素蛋白SF加入到含有甲酸FA的容器中在室温下搅拌至溶液状态，从而得到PCL/SF的纺丝液；

b.将步骤a得到的PCL/SF纺丝液作为内相，纤维蛋白溶液作为外相，进行纺丝，在纺丝过程中，设置一定的空气压力，纳米纤维收集在尼龙66筛网上，得到由纤维蛋白包覆的PCL/SF核-壳纳米纤维组成的纳米纤维膜，筛网距注射器喷嘴一定的距离；然后将纳米纤维膜在室温下真空干燥，去除残余FA；得到由纤维蛋白包覆的PCL/SF核-壳纳米纤维组成的纳米织物；

c.将猪源纤维蛋白粘合剂中的催化剂溶液注入催化剂冻干粉中，得到冻干粉催化剂溶液，将冻干粉催化剂溶液喷在步骤b得到的纳米织物上形成凝胶，得到构建皮肤组织的纳米纤维凝胶复合基质。

优选步骤a中所述的纤维蛋白溶液中的主体胶冻干粉的质量浓度为1.9-4.8％。

优选步骤a中所述的的甲酸溶液的质量浓度为85-95％。

优选步骤a中所述的PCL/SF纺丝液的质量浓度为14-25％；其中PCL和SF的质量比为0.25-2.5。

优选步骤b中所述的空气压力范围为0.01-0.5MPa；步骤b中所述的筛网距注射器喷嘴的距离范围为23-37cm；步骤b中内、外相的流速均为0.1-5mL/h。

优选步骤b中所述的纳米织物的纤维直径为44-250nm。

优选步骤b中所述的纳米织物的面积为4×4-40×140cm²。

优选步骤b中真空干燥的温度为25-35℃；真空干燥时间为6-12h。

优选步骤b中纳米织物的拉伸强度范围在2.3-6.2MPa。

优选步骤c中得到的纳米纤维凝胶复合基质的拉伸强度为6.8-8.2MPa。

优选本发明所述的聚己内酯PCL的重均分子量为80000；步骤c中得到冻干粉催化剂溶液中催化剂冻干粉的浓度优选为0.06-0.1g/ml(催化剂冻干粉的质量与冻干粉催化剂溶液的体积比)。

我们开发了一种微流控气喷纺丝工艺，首次实现了可降解的纤维蛋白包覆的聚己内酯/丝素蛋白(PCL/SF)大面积纳米织物(40×140cm²)，纤维直径最小可达到44nm。制备的纳米絮凝剂由PCL、SF、纤维蛋白等生物可降解、生物相容性好、易与纤维蛋白胶结合的材料制成。而且该纳米纤维织物凝胶复合基质成功地实现了腹部皮肤组织的再生，经历了三个阶段:纳米织物的制备、皮肤组织的重建和人造皮肤的形成。这种人造皮肤是基于纤维蛋白催化剂与纳米纤维蛋白的反应，最终获得的产物可以作为密封剂，在皮肤组织再生过程中，能维持湿润的伤口愈合环境和一定的组织黏附力。

有益效果：

1、本发明制备的纳米凝胶复合基质定义为人造皮肤的纳米织物的纤维具有直径大小可调，形貌可控的特点。

2、本发明制备的纳米凝胶复合基质定义为人造皮肤的纳米织物的制备方法设备简单，操作方便，且能够实现大规模制备。

3、本发明制备的纳米凝胶复合基质定义为人造皮肤的纳米织物的拉伸强度可以通过PCL和SF的比例进行调控。

4、本发明制备的纳米凝胶复合基质可以结合纤维基质(强机械性能)和凝胶(保持湿润的伤口愈合环境)的优点。

5、本发明制备的纳米凝胶复合基质具有优良的生物相容性和组织相容性。

6、本发明制备的纳米凝胶复合基质中的纳米织物具有丰富的多孔结构和高表面积，可以促进细胞的招募。

7、本发明制备的纳米凝胶复合基质中的人造皮肤可以促进血管生成、胶原沉积和肉芽组织的形成，有效预防全层皮肤缺损创面感染。

附图说明

图1为实施例1制备的纳米凝胶复合基质的纳米织物的SEM图；

图2为实施例1制备的纳米凝胶复合基质的纳米织物的粒径分布图；

图3为实施例1制备的纳米凝胶复合基质的大面积纳米织物实物图；

图4为实施例1制备的纳米凝胶复合基质用于验证其细胞相容性定量分析图。

具体实施方式

以下通过具体实施例说明本发明，但本发明并不仅限于以下实例，以下实施例中所述的猪源纤维蛋白粘合剂从***总医院购买。

实施例1

将猪源纤维蛋白粘合剂中15g的主体胶溶解液注入0.3g主体胶冻干粉中，得到1.96wt％的纤维蛋白溶液。然后将0.5g PCL(重均分子量80000)、2.0g干的SF溶于到含有15g甲酸(甲酸溶液的质量浓度为85％)溶液中，使其在室温下充分搅拌6h制得质量分数为14.2wt％的PCL/SF纺丝溶液(PCL与SF的质量比为0.25)。将得到PCL/SF纺丝液作为内相，纤维蛋白溶液作为外相，两种溶液作为前驱体的储集器中，装入注射器中。这两个注射器分别连接到T型微流控芯片的两个入口，作为制备纤维蛋白包覆PCL/SF纳米纤维的反应器。采用不锈钢钝化针(24G)固定进给速率(内、外分别为0.1mL/h、0.5mL/h)，对制备好的纺丝溶液进行进给。在MBS过程中，空气压力保持在0.01MPa。纳米纤维收集在尼龙66筛网上，筛网距离注射器喷嘴23厘米。制备了一种由纤维蛋白包覆的PCL/SF核-壳纳米纤维膜，并在25摄氏度下真空干燥6h，去除残余FA，得到纳米织物，这种纳米织物的纤维直径在44-96nm之间，如图1所示的纳米织物的SEM图和图2所示粒径图的纳米织物；所获得的纳米织物的拉伸强度在2.3MP，纳米织物面积大小为40×140cm²。最后，将猪源纤维蛋白粘合剂中的催化剂溶液注入催化剂冻干粉中，得到催化剂冻干粉浓度为0.06g/mL的冻干粉催化剂溶液，我们将冻干粉催化剂溶液喷在纳米织物上通过气体喷射使壳层纤维蛋白与其催化剂发生凝胶化反应从而制备出纤维凝胶复合基质作为人造皮肤。所制备的纳米凝胶复合基质的大面积纳米织物实物图如图3所示。所获得纤维-凝胶复合基质的拉伸强度为8.2MPa。然后通过细胞实验验证人造皮肤材料的生物相容性和无毒性质。最后通过体内活死染色实验验证人造皮肤的组织相容性如图4所示，在第3天纳米纤维凝胶复合膜表面细胞活性可达90％，具有良好的细胞相容性和无毒性。从而能促进皮肤再生的一系列功能，如能促进血管生成、胶原沉积和肉芽组织的形成，可以有效预防全层皮肤缺损创面感染。

实施例2

将猪源纤维蛋白粘合剂中15g的主体胶溶解液注入0.5g主体胶冻干粉中，得到3.33wt％的纤维蛋白溶液。然后将0.9g PCL(重均分子量80000)、2.1g干的SF溶于到含有15g甲酸中，使其在室温下充分搅拌6h制得质量分数为16.7％wt％的PCL/SF纺丝溶液(0.428,w/w)。将得到PCL/SF纺丝液作为内相，纤维蛋白溶液作为外相，两种溶液作为前驱体的储集器中，装入注射器中。这两个注射器分别连接到T型微流控芯片的两个入口，作为制备纤维蛋白包覆PCL/SF纳米纤维的反应器。采用不锈钢钝化针(24G)固定进给速率(内、外分别为1.5mL/h、5mL/h)，对制备好的纺丝溶液进行进给。在MBS过程中，空气压力保持在0.35MPa。纳米纤维收集在尼龙66筛网上，筛网距离注射器喷嘴30厘米。制备了一种由纤维蛋白包覆的PCL/SF核-壳纳米纤维组成的纳米织物，这种纳米织物的纤维直径在60-160nm之间。所获得的纳米织物的拉伸强度在5.5MPa，纳米织物面积大小为4×4cm²。并在30摄氏度下真空干燥8h，去除残余FA。最后，将猪源纤维蛋白粘合剂中的催化剂溶液注入催化剂冻干粉中，得到催化剂冻干粉浓度为0.08g/ml的冻干粉催化剂溶液，我们将冻干粉催化剂溶液喷在纳米织物上通过气体喷射使壳层纤维蛋白与其催化剂发生凝胶化反应从而制备出纤维凝胶复合基质作为人造皮肤。所获得纤维-凝胶复合基质的拉伸强度为7.1MPa。然后同样通过细胞实验验证人造皮肤材料的生物相容性和无毒性质。最后通过体内活死染色实验表明人造皮肤具有优异的组织相容性，而且纳米纤维凝胶复合膜表面细胞活性可达85％，具有良好的细胞相容性和无毒性。从而能促进皮肤再生的一系列功能，如能促进血管生成、胶原沉积和肉芽组织的形成，可以有效预防全层皮肤缺损创面感染。

实施例3

将猪源纤维蛋白粘合剂中15g的主体胶溶解液注入0.75g主体胶冻干粉中，得到4.76wt％的纤维蛋白溶液。然后将3.5g PCL(重均分子量80000)、1.5g干的SF溶于到含有15g甲酸的25mL烧杯中，使其在室温下充分搅拌6h制得质量分数为25wt％的PCL/SF纺丝溶液(2.33,w/w)。将得到PCL/SF纺丝液作为内相，纤维蛋白溶液作为外相，两种溶液作为前驱体的储集器中，装入注射器中。这两个注射器分别连接到T型微流控芯片的两个入口，作为制备纤维蛋白包覆PCL/SF纳米纤维的反应器。采用不锈钢钝化针(24G)固定进给速率(内、外分别为5mL/h、0.1mL/h)，对制备好的纺丝溶液进行进给。在MBS过程中，空气压力保持在0.5MPa。纳米纤维收集在尼龙66筛网上，筛网距离注射器喷嘴37厘米。制备了一种由纤维蛋白包覆的PCL/SF核-壳纳米纤维组成的纳米织物，这种纳米织物的纤维直径在150nm-250nm之间。所获得的纳米织物的拉伸强度在6.2MPa，纳米织物面积大小为10×40cm²。并在35摄氏度下真空干燥12h，去除残余FA。最后，将猪源纤维蛋白粘合剂中的催化剂溶液注入催化剂冻干粉中，得到催化剂冻干粉浓度为0.1g/ml的冻干粉催化剂溶液，我们将冻干粉催化剂溶液喷在纳米织物上通过气体喷射使壳层纤维蛋白与其催化剂发生凝胶化反应从而制备出纤维凝胶复合基质作为人造皮肤。所获得纤维-凝胶复合基质的拉伸强度为6.8MPa。然后通过细胞实验验证人造皮肤材料的生物相容性和无毒性质。最后通过体内活死染色实验表明人造皮肤具有优异的组织相容性，而且纳米纤维凝胶复合膜表面细胞活性可达80％，具有良好的细胞相容性和无毒性。从而能促进皮肤再生的一系列功能，如能促进血管生成、胶原沉积和肉芽组织的形成，可以有效预防全层皮肤缺损创面感染。