阅读说明：本技术 一种用于3d打印人工皮肤的生物墨水 (Biological ink for 3D printing of artificial skin ) 是由 刘雨辰 谢文韬 李晓茹 杨慧洁 谢媛媛 于 2019-11-04 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种用于3D打印人工皮肤的生物墨水,属于组织工程技术领域,包括用于构建表皮层的A组分、用于构建真皮层的B组分和用于构建脱细胞基质支架的C组分,其中,A组分包括第一种子细胞、第一载体水凝胶、含有中药成分的第一生长因子缓释凝胶,所述第一载体水凝胶和第一生长因子缓释凝胶的质量比为(60：1)-(60：8)；B组分包括第二种子细胞、第二载体水凝胶和第二生长因子缓释凝胶。其中添加有血竭、白蔹等中药成分和生长因子缓释凝胶,并从患者自身皮肤中提取种子细胞。本发明生物相容性较好,可以有效的促进细胞增殖再生和创面的愈合,并具有良好的力学和流体学性能,可用于3D打印皮肤等相关领域。(The invention relates to biological ink for 3D printing of artificial skin, which belongs to the technical field of tissue engineering and comprises a component A for constructing an epidermal layer, a component B for constructing a dermal layer and a component C for constructing an acellular matrix scaffold, wherein the component A comprises first seed cells, first carrier hydrogel and first growth factor slow-release gel containing traditional Chinese medicine components, and the mass ratio of the first carrier hydrogel to the first growth factor slow-release gel is (60: 1) - (60: 8); the component B comprises a second seed cell, a second carrier hydrogel and a second growth factor slow-release gel. The gel is added with Chinese medicinal components such as dragon's blood, ampelopsis japonica and the like and growth factor sustained-release gel, and seed cells are extracted from the skin of a patient. The invention has good biocompatibility, can effectively promote cell proliferation and regeneration and wound healing, has good mechanical and hydrodynamic properties, and can be used in the related fields of 3D printed skin and the like.)

一种用于3D打印人工皮肤的生物墨水

技术领域

本发明涉及一种用于3D打印人工皮肤的生物墨水。

背景技术

在中国每年有2600万人发生不同程度的烧烫伤，烧伤的患者中，49％出现残疾，8％终身残疾。对于一般Ⅰ，Ⅱ度烧伤的治疗方法，以涂抹烫伤膏，服用抗生素类药物为主。但是对于创面不能自愈的Ⅲ度烧伤病人和深Ⅱ度烧伤病人，则需要进行植皮手术。据统计，每年需要进行皮肤移植的患者在320万例以上，约20万例需大面积使用皮肤替代材料，按国际统计平均每人5000cm²计算，总需要量近109cm²。而由于医疗技术有限，植皮面积大，价格昂贵等原因限制，自体移植无法满足病人需求，且治疗周期长，严重影响患者的日常生活。而近年来3D生物打印的发展，为皮肤移植提供了新的思路，为皮肤病患者以及皮肤相关行业带来了曙光。

3D打印技术是基于计算机三维数字成像技术及多层次连续打印的一种新型数字化成型技术。3D生物打印技术则是在3D打印的基础上，以活细胞为原料打印活体组织的一种技术，可实现精确控制、以活细胞为原料逐层打印，体外构建皮肤模型用于皮肤病的研究、治疗或皮肤外用药物的研发。生物3D打印提供了一种高效的、自动化的打印分层结构皮肤的方法，可以控制打印皮肤的层数、细胞密度并精准地放置细胞和材料，建立细胞间连接，促进打印组织内细胞间旁分泌效应和细胞间的相互作用，而且打印本身不影响细胞的生物学行为。通过3D打印人工皮肤，不仅可以减少皮肤培养时间和成本，而且通过三维扫描，人工皮肤较传统自体移植与伤口的契合度更高，能够提高伤口愈合的速度，缩短治疗周期。并且如果以患者自体细胞打印，将大大降低机体发生免疫排斥的风险。

3D打印皮肤最重要的就是用于3D生物打印的原材料，即生物墨水。生物墨水多使用胶原蛋白为原料生产的水凝胶。虽然随着3D打印皮肤技术不断的发展，3D打印皮肤的材料也越来越广泛，国内也存在大量有关3D打印人工皮肤的生物墨水的论文和专利，但现有的生物墨水还不能完全满足使用需要。比如：(1)发明专利“一种生物打印全定制皮肤及其制备方法”(公开号CNIO8392676A)中提及的皮肤干细胞提取技术和三维扫描建模技术。虽然通过三维扫描，可以打印出符合人体特定部位，特定三维特征的全定制皮肤，提高了人造皮肤与伤口的贴合性和成功率，但其干细胞提取时，没有考虑到免疫排斥、外源干细胞并不能完全分化等问题。(2)发明专利“一种基于生物3D打印构建皮肤组织的方法”(公开号CN106860918A)中提及的利用胶原海绵结构人造皮肤，虽然可以缩短伤口愈合周期，增强创面愈合后皮肤弹性，但在打印过程中存在细菌污染的情况。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种用于3D打印人工皮肤的生物墨水及，以提高人工皮肤的打印效率和质量。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

一种用于3D打印人工皮肤的生物墨水，包括用于构建表皮层的A组分、用于构建真皮层的B组分和用于构建脱细胞基质支架的C组分，其中，A组分包括含有第一种子细胞的第一载体水凝胶、含有中药成分的第一生长因子缓释凝胶，所述第一载体水凝胶和第一生长因子缓释凝胶的质量比为(60：1)-(60：8)；B组分包括第二生长因子缓释凝胶、含有第二种子细胞的第二载体水凝胶，所述第二载体水凝胶和第二生长因子缓释凝胶的质量比为(30：1)-(30：4)。

进一步地，第一种子细胞为取自自体皮肤组织的干细胞，选取自体表皮干细胞可大大减小移植过程中的免疫排斥反应。

进一步地，所述第二种子细胞包括取自自体皮肤组织的表皮间充质干细胞、脂肪干细胞和毛囊干细胞，选取自体的干细胞可大大减小移植过程中的免疫排斥反应。

一般的，载体水凝胶包含但不限于纤维蛋白、胶原、丝素蛋白、透明质酸、壳聚糖、脱细胞外基质、聚己内酯、聚乙二醇、聚乳酸-羟基乙酸共聚物等，对比来看，纤维蛋白虽然具有良好的生物相容性和黏着细胞能力，但是其结构强度较低，缺乏长期稳定性；胶原免疫原性低，生物相容性较好，可被体内组织降解，可结合整合素以加强细胞黏附性和增殖能力，但是力学性质较差，须经化学修饰或与其他材料交联；丝素蛋白具有良好的生物相容性和力学性能，但是在生物体内降解速率慢，影响皮肤的再生恢复；透明质酸与其他材料交联使用可以提升材料性能，但是本身力学性能较差；聚己内酯具有很好的拉伸硬度、生物相容性和稳定性，但是弹性较差，流变学性能不强；聚乳酸-羟基乙酸共聚物材料本身及其降解产物的生物相容性良好，但是细胞黏附力较差，影响干细胞的增殖再生。综上所述，从可降解性及其降解速率、生物相容性、力学性能及流变学性能考虑，综合支架材料的交联方式、交联位点和密度，材料与组织细胞构成的水凝胶的孔隙率、孔径大小、溶胀比等影响因素，优选胶原和脱细胞基质材料。

胶原是人体细胞外基质最主要的材料，Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ型胶原在人体皮肤中常见。胶原蛋白中氨基酸主要是由α-氨基酸组成，甘氨酸含量为34wt％，羟脯氨酸约10wt％，脯氨酸约12wt％。上述所需的胶原必须为无菌状态，且考虑到经过物理或化学方式灭菌后的胶原会出现变性的情况，故优选Ⅰ型胶原蛋白。进一步地，考虑到提升胶原的力学性质，由于海藻酸钠生物相容性较好、来源广泛及可置换二价离子和凝胶性能，优选Ⅰ型胶原蛋白混合海藻酸钠溶液和脱细胞基质的组合。

进一步地，载体水凝胶主要由Ⅰ型胶原蛋白溶液、海藻酸钠溶液、脱细胞皮肤基质溶液按(18-22)：(18-22)：1的体积比混合而成。

进一步地，所述Ⅰ型胶原蛋白溶液的浓度为0.4-0.5wt％，海藻酸钠溶液的浓度为2-3wt％，脱细胞皮肤基质溶液的浓度为28-32wt％。

优选地，所述Ⅰ型胶原蛋白溶液的浓度为0.4wt％，海藻酸钠溶液的浓度为2wt％，脱细胞皮肤基质溶液的浓度为30wt％。

优选地，对第二载体水凝胶，所述Ⅰ型胶原蛋白溶液的浓度为0.5wt％，海藻酸钠溶液的浓度为3wt％，脱细胞皮肤基质溶液的浓度为30wt％。

进一步地，生长因子缓释凝胶包括缓释凝胶载体和生长因子两部分。进一步的，缓释凝胶载体包括但不限于聚羟基乙酸PGA、聚乳酸PLA、聚乳酸和聚羟基乙酸的共聚物PLGA、聚乙内酯PCL、聚丙交酯、胶原、明胶、壳聚糖和透明质酸等中的一种或几种，其中聚羟基乙酸PGA、聚乳酸PLA、聚乳酸和聚羟基乙酸的共聚物PLGA是FDA最早认证的同意应用于人体的合成可降解的生物高分子材料，均可以作为生长因子的载体材料，而且成球性能良好。PLGA共聚物是由聚羟基乙酸PGA、聚乳酸PLA各50％的比例混合，结合了两者的优点，能够完全降解，但强度较高，降解时间延长；可精确调节降解时间，但是存在生物相容性差的缺点。胶原等天然材料生物相容性好，无抗原性，能促进细胞黏附和增殖，且可根据需要制成不同的形状。其中，胶原蛋白来源丰富，且具有低免疫原性，良好的生物相容性、可降解性、可参与组织修复重建等优越性。

微球缓释系统具有比传统缓释载体材料更优良的性能，微球结构可以保护药物免受外界环境的破坏而性能稳定，因此更能延长缓释作用时间。综上所述，优选PLGA微球和胶原蛋白的组合作为缓释凝胶载体的构成。

进一步地，生长因子缓释凝胶包括PLGA微球、胶原蛋白和生长因子，所述生长因子为EGF、KGF-2、VEGF、PDGF、TGF-β、bFGF中的一种或几种。

进一步地，对于第一生长因子缓释凝胶，所述生长因子包括表皮细胞生长因子EGF和角质化细胞生长因子KGF-2。EGF可作为趋化因子产生趋化信号，使细胞和蛋白基质聚集创面，使创伤修复，还可以促进相关细胞的有丝***、增殖等。EGF还是成纤维细胞和血管内皮细胞的有丝***原，可促进胶原蛋白，纤维蛋白等基质内成分的合成，加速创面愈合。KGF-2能特异性地加速创面组织细胞的基因转录、基因复制和蛋白质的合成，从而促进上皮细胞的有丝***、增殖分化和迁移等。

进一步的，对于第二生长因子缓释凝胶，生长因子包括血管内皮生长因子VEGF、血小板衍化内皮细胞生长因子PDGF、转化生长因子β(TGF-β)和碱性成纤维细胞生长因子bFGF。VEGF具有促进血管内皮增殖和干细胞分化的作用，可以促进血管通透性增加。PDGF具有多种生物功能，可刺激各种类型细胞***、增殖和细胞外基质的产生，是多种细胞的有丝***原和趋化因子。TGF-β可以促进成纤维细胞、成骨细胞和施万细胞的生长，还可以促进细胞外基质如胶原蛋白、纤粘连蛋白的表达和抑制降解，能加速创伤愈合，有利于细胞修复。bFGF具有促进血管生成的作用，还可以能促使成纤维细胞等细胞向创面趋化、聚集，从而促进创面的肉芽生长，血管形成，加速细胞的***增殖，缩短创面愈合时间；还能加速创面组织细胞的基因转录、基因复制和蛋白质的合成，促进纤维母细胞以及上皮细胞的有丝***、增殖和分化；可促使巨噬细胞、***、内皮细胞、成纤维细胞等向创伤部位迁移。

进一步地，所述中药成分包含但不限于血竭、白蔹、党参、茯苓、白芍、地榆、炉甘石、黄柏、蛇床子、荜茇、轻粉等，从药效和成本等方面考虑，优选血竭和白蔹。

血竭外用可止血生肌、敛疮，主治症瘕痞块，跌打损伤，淤血肿痛，外伤出血，溃疡不敛等证。研究发现，血竭还有促进毛囊干细胞进行分化的作用。张东萍，曹建春，鞠上等的研究发现，血竭生肌膏可通过升高糖尿病大鼠溃疡创面VEGF的表达，促进新生血管形成和肉芽组织生长，改善局部营养状态，从而促进溃疡创面的愈合。并且还对创面组织细胞的增殖有明显的促进作用，能加快创面再上皮化，促进创面愈合。白蔹具有清热解毒、消痈散结、敛疮生肌的功效，主治痈疽发背、疔疮、烧烫伤等证。研究证明，白蔹还对白色念球菌、金黄色葡萄球菌等具有抑制作用。

进一步地，所述中药成分包括血竭和白蔹，其质量比为3：5。

进一步地，载体水凝胶的制备方法包括如下步骤：

取浓度为0.4-0.5wt％Ⅰ型胶原蛋白溶液和浓度为2-3wt％的海藻酸钠溶液，混合均匀，并控制溶液PH为6-7.45，调制成胶原-海藻生物凝胶；

将浓度为28-32wt％的脱细胞皮肤基质溶液和种子细胞加入所述胶原-海藻生物凝胶中，混合均匀，使种子细胞浓度为1×10⁵-1×10⁷个/ml，制得载体水凝胶。

进一步地，第一生长因子缓释凝胶的制备方法包括如下步骤：

①以0.001-0.002wt％EGF溶液、0.00001-0.001wt％KGF-2溶液作为内水相，20-70wt％PLGA的二氯甲烷溶液作为油相，将两者通过复乳法制得EGF-KGF-2-PLGA溶液，除去有机溶剂后进行离心，沉淀，再经过冷冻干燥，得到EGF-KGF-2-PLGA微球；

其中，离心过程中，转速为900-1100r/min，离心时间为4-6min；

②在浓度为0.1-0.3wt％乙酸溶液中加入I型胶原蛋白，搅拌均匀，获得胶原蛋白溶液；

③将第①步制备的EGF-KGF-2-PLGA微球和中药成分加入到胶原蛋白溶液中，搅拌均匀后，于-70℃进行预冻8h-30h，然后进行冷冻干燥，使用浓度为60-90％的乙醇溶液进行固化20min-40min后，再次进行冷冻干燥，即得包埋EGF-KGF-2-PLGA微球的第一生长因子缓释凝胶。

进一步地，第二生长因子缓释凝胶的制备方法包括如下步骤：

①0.001-0.002wt％VEGF溶液，0.0001-0.001wt％PDGF溶液，0.00001-0.001wt％TGF-β溶液，0.0001-0.001wt％bFGF溶液作为内水相，20-70wt％PLGA二氯甲烷溶液作为油相，两者通过复乳法得到VEGF-PDGF-TGF-β-bFGF-PLGA溶液，除去有机溶剂后进行离心，沉淀，之后再经过冷冻干燥得到VEGF-PDGF-TGF-β-bFGF-PLGA微球；

②在0.1-0.3wt％乙酸溶液中加入I型胶原蛋白，搅拌均匀，制备成胶原蛋白溶液；

③将第①步制备的VEGF-PDGF-TGF-β-bFGF-PLGA微球加入到胶原蛋白溶液中，搅拌均匀，-70℃进行预冻8h-30h，然后进行冷冻干燥，使用60-90wt％的乙醇进行固化20min-40min后，再次进行冷冻干燥，即得包埋VEGF-PDGF-TGF-β-bFGF-PLGA微球的第二生长因子缓释凝胶。

从材料的机械强度，孔隙率，促细胞增殖能力，较低浓度下材料的性能变化等方面考虑，C组分包括sigma胶原、海藻酸钠和明胶。选取胶原蛋白、海藻酸钠与明胶在一定条件下进行交联处理。制备的凝胶再经过流体力学测试和细胞毒性测试应该具有以下特点：很好的生物相容性和生物降解性。可与多种生长因子结合，从而促进周围细胞的增殖与分化过程；与细胞的黏附度高；力学强度适中，具有一定的抗压能力；具有较好的弹性；打印过程形成脱细胞基质支架的过程中，不易出现坍塌。

进一步地，C组分的制备方法包括如下步骤：

将明胶、海藻酸钠溶于PBS缓冲液中，获得浓度为10wt％的明胶溶液；

将海藻酸钠溶于PBS缓冲液中，获得浓度为2wt％的海藻酸钠溶液；

分别调节所述明胶溶液、海藻酸钠溶液的PH值到7.2，然后进行灭菌处理，备用；

称量Ⅰ型Sigma胶原粉末，加入到醋酸中，获得终浓度为30mg/mL的胶原蛋白溶液，搅拌后放入4℃冰箱，过夜，备用；

将所述明胶溶液、胶原蛋白溶液、海藻酸钠溶液按1：1：3-5的质量比混合均匀，灭菌后，获得C组分。

本发明中，在生物墨水中加入血竭、白蔹等中药成分提升伤口愈合修复能力；采用微球结构的生长因子缓释凝胶促进皮肤的融合、生长和修复，延长缓释作用时间；从患者自身皮肤提取种子细胞，大大减小了移植过程中患者自身的免疫排斥反应，有利于移植皮肤处的创口恢复和相关组织的再生；添加提升力学性能的凝胶成分如海藻酸钠、胶原蛋白和明胶等，使打印过程中不易出现坍塌。通过本发明的生物墨水，可以大大提高人工皮肤的打印效率和质量，减少患者移植皮肤周期，在皮肤病的研究和治疗，美容等皮肤相关行业的产品研发有重要意义。

本发明的用于3D打印人工皮肤的生物墨水，其具有适中力学性能和生物相容性，可减小移植过程中的免疫排斥反应，还可提升伤口愈合修复能力、促进皮肤融合生长，并具有良好的力学和流体学性能，在3D打印皮肤等相关领域具有推广意义。

附图说明

图1为实施例1-3制得的脱细胞载体凝胶，在质量比不同的情况下，其压缩模量的关系变化图。

图2为实施例1-3制得的脱细胞载体凝胶，在质量比不同的情况下，其第15天降解率的关系变化图。

图3为实施例1，4和5制得的脱细胞载体凝胶，在用不同浓度CaCl₂溶液进行交联的情况下，其断裂强度的关系变化图。

具体实施方式

以下说明描述了本发明的可选实施方式以教导本领域普通技术人员如何实施和再现本明。为了教导本发明技术方案，已简化或省略了一些常规方面。若无特殊说明，百分数一般应理解为质量百分数。

一种用于3D打印人工皮肤的生物墨水的制备方法，具有以下步骤：

S1：酶解液配置：以D-Hanks液配制2g/L中性蛋白酶溶液、质量分数为0.25％的胰蛋白酶和质量分数为0.02％的EDTA，过滤灭菌后于4℃保存备用。

S2：Ⅳ型胶原蛋白培养瓶制备：将人Ⅳ型胶原溶于体积分数为0.1％的醋酸液中，滤过除菌，4℃保存备用。用配制好的Ⅳ型胶原1-2ml平铺于培养瓶中，过夜，弃上清液，然后用浓度为0.01mol/L的PBS溶液漂洗3-4次，40℃干燥箱烘干，紫外线照射2h消毒备用。

S3：表皮干细胞的提取：取自体正常皮片，用含有双抗生素(青霉素、链霉素)的PBS溶液冲洗5-6次，无菌条件下剔除皮下组织。将皮片剪成1.0cm×1.0cm大小，置于含中性蛋白水解酶的低糖DMEM/F12培养基中，4℃消化14-16h，弃上清液，分离表皮和真皮层。剪碎表皮，用0.25％胰蛋白酶37℃消化15min，加入含有10％胎牛血清或人自体血清的DMEM终止消化，吹打后用200目筛网研磨滤过。滤液经离心(1000r/min)5min后收集细胞。弃上清液，加入表皮干细胞培养基并轻柔吹打制成单细胞悬液，以适当密度接种于预先铺有Ⅳ型胶原的培养瓶，37℃孵育15min后，吸出培养液及未贴壁细胞，弃未贴壁细胞成分，D-Hanks液洗2次，加入适量表皮干细胞培养基，置于37℃、体积分数为5％二氧化碳培养箱中培养。24h后吸出培养液，PBS冲洗1次，再加皮表皮干细胞培养基，置于37℃、体积分数为5％二氧化碳培养箱中继续培养。之后每48h换液1次，光镜下观察细胞生长情况。

S4：表皮干细胞的鉴定：取部分细胞，PBS冲洗3次，4％多聚甲醛室温固定30min，二步免疫组化检测法分别行细胞K19和β1整合素免疫细胞化学染色；同时用PBS代替一抗作空白对照。以上各步骤尽量避光。

S5：第一载体水凝胶的制备：于室温下取浓度为0.4％Ⅰ型胶原蛋白溶液和浓度为2％的海藻酸钠溶液，以体积比1：1混合均匀，并控制溶液PH为6-7.45，调制成胶原-海藻生物凝胶。将浓度为30％的脱细胞皮肤基质溶液和S3获得的种子细胞加入胶原-海藻生物凝胶中，其中胶原-海藻生物凝胶和脱细胞皮肤基质溶液以为20：1体积比充分混合，搅拌均匀，使种子细胞浓度为1×10⁵-1×10⁷个/ml，制得表皮层载体水凝胶。

S6:将血竭、白蔹研末，血竭：白蔹＝3：5的比例(质量比)，获得中药成分；

S7:表皮层生长因子缓释凝胶(第一生长因子缓释凝胶)的制备:

①0.001％-0.002％EGF溶液，0.00001％-0.001％KGF-2溶液作为内水相，20％-70％PLGA二氯甲烷溶液作为油相，两者通过复乳法得到EGF-KGF-2-PLGA溶液，除去有机溶剂后进行离心(1000r/min)5min，沉淀，之后再经过冷冻干燥得到EGF-KGF-2-PLGA微球。

②在0.1％-0.3％乙酸溶液中加入I型胶原蛋白，搅拌均匀，制备成胶原蛋白溶液。

③将第①步制备的微球和S6得到的中药成分加入到胶原蛋白溶液中，搅拌均匀，-70℃进行预冻8h-30h，然后进行冷冻干燥，使用60％-90％的乙醇进行固化20min-40min后，再次进行冷冻干燥，即得包埋EGF-KGF-2-PLGA微球的胶原载体。

S8:真皮间充质干细胞的提取：取自体正常皮片，用含有双抗生素(青霉素、链霉素)的PBS溶液冲洗5-6次，无菌条件下剔除皮下组织。将皮片剪成1.0cm×1.0cm大小，置于含中性蛋白水解酶的低糖DMEM/F12培养基中，4℃消化14-16h，弃上清液，分离表皮和真皮层。真皮层用PBS漂洗2次，剪碎后用含有1％胎牛血清或人自体血清和0.1％Ⅰ型胶原酶的低糖DMEM/F12培养基，置于37℃、体积分数为5％二氧化碳培养箱中培养，10h后加入含2％胎牛血清或人自体血清的PBS终止消化，吹打后用200目和350目筛网分别研磨滤过。滤液经离心(1500r/min)5min后收集细胞。弃上清液，加入含有10％胎牛血清或人自体血清的DMEM/F12培养基并轻柔吹打制成单细胞悬液，以适当密度接种于培养瓶中培养，每48h换液1次，当细胞达到80-90％融合时，用酶解液消化，分离的细胞接种于新培养瓶中继续培养，之后每60h换液1次。

S9：真皮间充质干细胞的鉴定：取生长良好的第3代单层培养扩增的真皮源性细胞，用4％多聚甲醛固定10min。此后，滴加0.2％Triton X-100，25℃孵育10min，再用PBS冲洗。以10％胎牛血清或人自体血清封闭1h后，滴加CD90、CD105抗体和波形蛋白，4℃过夜。24h后滴加羊抗小鼠IgG FITC或IgG-Texas Red，室温孵育1h，再以DAPI染细胞核，置于荧光显微镜下观察。

S10：毛囊干细胞的提取：在无菌室中，从自体后脑部表皮中提取毛囊干细胞。将毛囊干细胞接种至DMEM/F12培养基中，置于37℃、体积分数为5％二氧化碳培养箱中培养。

S11：脂肪干细胞的提取：无菌条件下取脂肪组织，用4℃含有双抗生素(青霉素、链霉素)的PBS溶液冲洗5-6次，无菌条件下剔除血管及***。在培养皿中将脂肪组织剪成0.2cm×0.2cm大小的小块，用0.2％Ⅰ型胶原蛋白酶37℃消化15min，加入等体积含有10％胎牛血清或人自体血清的低糖DMEM/F12培养基终止消化，吹打后用200目筛网研磨滤过。滤液经离心(1000r/min)5min后收集细胞。弃上清后加入3mL红细胞裂解液吹打5min，离心(1000r/min)5min后弃上清，PBS反复冲洗后在含10％胎牛血清的DMEM培养液中重悬细胞，接种至培养皿中，置于37℃、体积分数为5％二氧化碳培养箱中培养。每48h换液1次，细胞生长至75％-90％融合时，用酶解液消化，分离的细胞接种于新培养瓶中继续培养，之后每72h换液1次。

S12：脂肪干细胞的鉴定：取生长良好的第3代细胞，以适当密度接种于24孔板，24后取生长良好的4孔细胞，2孔作实验组，2孔作对照组。弃去培养基，PBS冲洗2-3遍，用4％的多聚甲醛固定20min，然后用PBS冲洗3遍，实验组分别加入异硫氰酸荧光素FITC标记的CD34、CD44抗体，4℃避光孵育2h，用PBS清洗后，置于荧光显微镜下观察。

S13：载体水凝胶的制备：于室温下取浓度为0.5％Ⅰ型胶原蛋白溶液和浓度为3％的海藻酸钠溶液，以体积比1：1混合均匀，并控制溶液PH为6-7.45，调制成胶原-海藻生物凝胶。将浓度为30％的脱细胞皮肤基质溶液和S8-12中获得的相关种子细胞加入胶原-海藻生物凝胶中，其中胶原-海藻生物凝胶和脱细胞皮肤基质溶液以为20：1体积比充分混合，搅拌均匀，使种子细胞浓度为1×10⁵-1×10⁷个/ml，制得真皮层载体水凝胶(第二载体水凝胶)。

S14：真皮层生长因子缓释凝胶(第二生长因子缓释凝胶)的制备：

①0.001％-0.002％VEGF溶液，0.0001％-0.001％PDGF溶液，0.00001％-0.001％TGF-β溶液，0.0001％-0.001％bFGF溶液作为内水相，20％-70％PLGA二氯甲烷溶液作为油相，两者通过复乳法得到VEGF-PDGF-TGF-β-bFGF-PLGA溶液，除去有机溶剂后进行离心(1000r/min)5min，沉淀，之后再经过冷冻干燥得到VEGF-PDGF-TGF-β-bFGF-PLGA微球。

②在0.1％-0.3％乙酸溶液中加入I型胶原蛋白，搅拌均匀，制备成胶原蛋白溶液。

③将第①步制备的微球加入到胶原蛋白溶液中，搅拌均匀，-70℃进行预冻8h-30h，然后进行冷冻干燥，使用60％-90％的乙醇进行固化20min-40min后，再次进行冷冻干燥，即得包埋VEGF-PDGF-TGF-β-bFGF-PLGA微球的胶原载体。

A组分中按配比添加有第一载体水凝胶、第一生长因子缓释凝胶；B组分中按配比添加有第二生长因子缓释凝胶和第二载体水凝胶。通过喷墨式生物打印技术进行皮肤打印时，A组分添加于表皮层墨盒中，B组分添加于真皮层墨盒中。

S15：脱细胞基质凝胶的制备：

①将明胶溶于PBS缓冲液中，形成10％的溶液，将海藻酸钠溶于PBS缓冲液中，形成2％溶液，分别用NaOH中和残余醋酸，调节PH值到7.2，60℃烘箱中间歇式灭菌。

②称量一定质量Ⅰ型Sigma胶原粉末，加入醋酸，终浓度为30mg/mL，进行搅拌，搅拌后放入4℃冰箱，过夜。

③按照明胶溶液：胶原蛋白溶液：海藻酸钠溶液质量比为1：1：4混合均匀，进行高温灭菌。

④将构建的三维模型用三维建模软件进行图像重建生成STL文件，导入3D生物打印机中进行分层以及打印参数的设置，然后开始打印。

⑤模型打印结束后，在支架表面滴加适量5％CaCl₂溶液，交联作用30s。待模型完全成形，吸走多余的CaCl₂溶液，并用PBS缓冲液反复冲洗支架三遍，加入适量PBS溶液，并放入二氧化碳培养箱中。

实施例1

一种用于3D打印人工皮肤的生物墨水，其C组分及脱细胞基质支架的制备包括以下步骤：

①将明胶溶于PBS缓冲液中形成10wt％的溶液；将海藻酸钠溶于PBS缓冲液中形成2wt％溶液；分别用NaOH中和残余醋酸，调节PH值到7.2，60℃烘箱中间歇式灭菌。

②称量一定质量Ⅰ型Sigma胶原粉末，加入醋酸，终浓度为30mg/mL，进行搅拌，搅拌后放入4℃冰箱，过夜。

③按照明胶溶液：胶原蛋白溶液：海藻酸钠溶液质量比为1：1：2混合均匀，进行高温灭菌。

④将构建的三维模型用三维建模软件进行图像重建生成STL文件，导入3D生物打印机中进行分层以及打印参数的设置，然后开始打印。

⑤模型打印结束后，在支架表面滴加适量5％CaCl₂溶液，交联作用30s。待模型完全成形，吸走多余的CaCl₂溶液，并用PBS缓冲液反复冲洗支架三遍，加入适量PBS溶液，并放入二氧化碳培养箱中。

实施例2

一种用于3D打印人工皮肤的生物墨水，其C组分及脱细胞基质支架的制备包括以下步骤：

①将明胶溶于PBS缓冲液中形成10％的溶液，将海藻酸钠溶于PBS缓冲液中形成2％溶液，分别用NaOH中和残余醋酸，调节PH值到7.2，60℃烘箱中间歇式灭菌。

②称量一定质量Ⅰ型Sigma胶原粉末，加入醋酸，终浓度为30mg/mL，进行搅拌，搅拌后放入4℃冰箱，过夜。

③按照明胶溶液：胶原蛋白溶液：海藻酸钠溶液质量比为1：1：4混合均匀，进行高温灭菌。

④将构建的三维模型用三维建模软件进行图像重建生成STL文件，导入3D生物打印机中进行分层以及打印参数的设置，然后开始打印。

⑤模型打印结束后，在支架表面滴加适量5％CaCl₂溶液，交联作用30s。待模型完全成形，吸走多余的CaCl₂溶液，并用PBS缓冲液反复冲洗支架三遍，加入适量PBS溶液，并放入二氧化碳培养箱中。

实施例3

一种用于3D打印人工皮肤的生物墨水，其C组分及脱细胞基质支架的制备包括以下步骤：

①将明胶溶于PBS缓冲液中形成10％的溶液，将海藻酸钠溶于PBS缓冲液中形成2％溶液，分别用NaOH中和残余醋酸，调节PH值到7.2，60℃烘箱中间歇式灭菌。

②称量一定质量Ⅰ型Sigma胶原粉末，加入醋酸，终浓度为30mg/mL，进行搅拌，搅拌后放入4℃冰箱，过夜。

③按照明胶溶液：胶原蛋白溶液：海藻酸钠溶液质量比为1：1：8混合均匀，进行高温灭菌。

④将构建的三维模型用三维建模软件进行图像重建生成STL文件，导入3D生物打印机中进行分层以及打印参数的设置，然后开始打印。

⑤模型打印结束后，在支架表面滴加适量5％CaCl₂溶液，交联作用30s。待模型完全成形，吸走多余的CaCl₂溶液，并用PBS缓冲液反复冲洗支架三遍，加入适量PBS溶液，并放入二氧化碳培养箱中。

实施例4

一种用于3D打印人工皮肤的生物墨水，其C组分及脱细胞基质支架的制备包括以下步骤：

①将明胶溶于PBS缓冲液中形成10％的溶液，将海藻酸钠溶于PBS缓冲液中形成2％溶液，分别用NaOH中和残余醋酸，调节PH值到7.2，60℃烘箱中间歇式灭菌。

②称量一定质量Ⅰ型Sigma胶原粉末，加入醋酸，终浓度为30mg/mL，进行搅拌，搅拌后放入4℃冰箱，过夜。

③按照明胶溶液：胶原蛋白溶液：海藻酸钠溶液质量比为1：1：4混合均匀，进行高温灭菌。

④将构建的三维模型用三维建模软件进行图像重建生成STL文件，导入3D生物打印机中进行分层以及打印参数的设置，然后开始打印。

⑤模型打印结束后，在支架表面滴加适量2％CaCl₂溶液，交联作用30s。待模型完全成形，吸走多余的CaCl₂溶液，并用PBS缓冲液反复冲洗支架三遍，加入适量PBS溶液，并放入二氧化碳培养箱中。

实施例5

一种用于3D打印人工皮肤的生物墨水，其C组分及脱细胞基质支架的制备包括以下步骤：

①将明胶溶于PBS缓冲液中形成10％的溶液，将海藻酸钠溶于PBS缓冲液中形成2％溶液，分别用NaOH中和残余醋酸，调节PH值到7.2，60℃烘箱中间歇式灭菌。

②称量一定质量Ⅰ型Sigma胶原粉末，加入醋酸，终浓度为30mg/mL，进行搅拌，搅拌后放入4℃冰箱，过夜。

③按照明胶溶液：胶原蛋白溶液：海藻酸钠溶液质量比为1：1：4混合均匀，进行高温灭菌。

④将构建的三维模型用三维建模软件进行图像重建生成STL文件，导入3D生物打印机中进行分层以及打印参数的设置，然后开始打印。

⑤模型打印结束后，在支架表面滴加适量8％CaCl₂溶液，交联作用30s。待模型完全成形，吸走多余的CaCl₂溶液，并用PBS缓冲液反复冲洗支架三遍，加入适量PBS溶液，并放入二氧化碳培养箱中。

将实施例1-3所制得的脱细胞基质凝胶在37℃的环境下，对压缩模量进行测试，结果如图1所示，对其降解率进行测试，结果如图2所示。

将实施例1，4和5所制得的脱细胞基质凝胶在37℃的环境下，对断裂强度进行测试，结果如图3所示。

上述实施例阐明的内容应当理解为这些实施例仅用于更清楚地说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落入本申请所附权利要求所限定的范围。