阅读说明：本技术 一种可视化成像检测基因毒素Colibactin荧光分子探针及其制备方法和应用 (Fluorescent molecular probe for detecting genotoxin Colibactin through visual imaging as well as preparation method and application of fluorescent molecular probe ) 是由 吴萃艳 李海涛 李雅倩 卢求钧 张友玉 于 2020-06-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种可视化成像检测基因毒素Colibactin荧光分子探针及其制备方法和应用,该探针的结构式如(1)所示：<Image he="494" wi="700" file="DDA0002549964760000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>本发明设计合成了一种基于分子内电荷转移的小分子荧光探针,能够专一性检测识别产基因毒素Colibactin大肠杆菌,不受其他生物分子、离子、细菌等干扰。同时,本探针具有近红外荧光发射,能够应用于产基因毒素Colibactin大肠杆菌的激光共聚焦成像。(The invention discloses a fluorescent molecular probe for detecting a gene toxin Colibactin through visual imaging, a preparation method and application thereof, wherein the structural formula of the probe is shown as (1): the invention designs and synthesizes a micromolecular fluorescent probe based on intramolecular charge transfer, can specifically detect and identify escherichia coli producing genotoxin Colibactin, and is not interfered by other biomolecules, ions, bacteria and the like. Meanwhile, the probe has near-infrared fluorescence emission and can be applied to laser confocal of escherichia coli producing genotoxin ColibactinLike this.)

一种可视化成像检测基因毒素Colibactin荧光分子探针及其 制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种可视化成像检测基因毒素Colibactin荧光分子探针的制备方法和应用。

背景技术

肠道菌群作为人体肠道的正常微生物菌群，能合成多种人体生长发育必须的维生素，能利用蛋白质残渣合成必需氨基酸，并参与糖类和蛋白质的代谢，同时还能促进铁、镁、锌等矿物元素的吸收。另一方面，肠道菌群也作为肿瘤微环境的一部分，参与大部分消化道恶性肿瘤的发生、发展。研究表明，大肠杆菌中产生的一种名为Colibactin的基因毒素可通过破坏肠上皮细胞的DNA而导致肿瘤，从而大大增加了结直肠癌的发病率(Science, 2006,313(5788):848-851；Science,2018,359(6375):592-597)。因此，对Colibactin进行检测对结直肠癌的相关研究具有重要意义和实际价值。

由于Colibactin的结构复杂，迄今为止，尚无办法纯化Colibactin和确定其确切的结构，结果导致了其检测受到诸多限制。另一方面，参与Colibactin生物合成的肽酶ClbP是稳定存在的，其通过水解联接有保护基团N-肉豆蔻酰基D-天冬酰胺且无生物活性的Colibactin前体化合物而最终生产产生Colibactin(Journal of the American ChemicalSociety, 2013,135(9):3359-3362)。因此，通过ClbP能催化水解N-肉豆蔻酰基D-天冬酰胺的特性并结合“前药策略”建立一种灵敏、简单、选择性好的方法对ClbP进行检测或者在线监测，从而实现Colibactin的快速检测及其相关的研究是可行的。

发明内容

本发明旨在提供一种具有选择性好、灵敏度高、响应速度快的可视化成像检测基因毒素Colibactin的荧光分子探针的制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种可视化成像检测基因毒素Colibactin荧光分子探针，其特征在于，所述分子探针具有如下化学结构式：

本发明还提供了所述荧光分子探针在制备基因毒素Colibactin及其上游肽酶ClbP检测试剂中的应用。

优选的，所述检测试剂是将荧光分子探针溶解到混合溶剂中制备得到的检测试剂，所述混合溶剂是体积比N,N-二甲基甲酰胺：4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸＝2:(7-9)的混合溶剂。

优选的，所述检测试剂中荧光分子探针的浓度为4-6μM。进一步优先的浓度为5μM。

本发明还提供了所述荧光分子探针在制备可视化成像试剂中的应用，所述可视化成像试剂包括活体、组织、细胞和细菌的可视化成像试剂。

本发明还提供了所述可视化成像检测基因毒素Colibactin荧光分子探针的制备方法，所述荧光分子探针的制备方法包括以下步骤：

(1)原料a：N-Boc-D-天冬酰胺，原料b：(E)-2-(3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯-1-基)丙二腈，原料c：2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐和催化量的4-二甲氨基吡啶在无水吡啶溶液在室温下搅拌6-8小时，通过加入饱和碳酸氢钠水溶液淬灭反应混合物后用乙酸乙酯萃取，将合并的萃取液干燥并真空浓缩，得到粗品，纯化粗产物，得到中间体1：叔丁基(S,E)-(3-氰基-1-((4-(2-(3-(二氰基亚甲基) -5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)苯基)氨基)-1-氧丙烷-2-基)氨基甲酸酯；

(2)将中间体1溶于CH₂Cl₂和三氟乙酸中，室温搅拌0.5-3h，加水除去三氟乙酸用乙酸乙酯萃取，有机相再用大量水洗，将有机相减压旋蒸除去后通过SiO₂硅胶柱纯化，提纯时间为1-6小时，得到中间体2：(S,E)-2-氨基-3-氰基-N-(4-(2-(3-(二氰基亚甲基) -5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)苯基)丙酰胺；

(3)将中间体2、肉豆蔻酸和原料c在吡啶中的溶液在室温搅拌5-7小时，停止反应后将反应液倒入大量饱和碳酸氢钠水溶液中有固体产生，抽滤后滤渣用乙酸乙酯溶解用Na₂SO₄干燥并真空浓缩，得到粗品，通过SiO₂柱色谱纯化粗产物，得中间体3：(S,E) -N-(3-氰基-1-((4-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)苯基)氨基)-1-氧丙烷-2-基)十四烷酰胺；

(4)将中间体3溶于乙酸中，加入TiCl₄和H₂O，在室温下搅拌1-3小时，通入饱和碳酸氢钠水溶液淬灭反应混合物后用乙酸乙酯萃取，将合并的萃取液干燥并真空浓缩，得到粗品，纯化粗产物，得到荧光分子探针(S,E)-N1-(4-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)苯基)-2-十四碳酰胺基琥珀酰胺。

优选的，步骤(1)中原料a:原料b:原料c的摩尔比为：2:(1～3):(1～6)；所述催化量的4-二甲氨基吡啶为10mg-100mg。

优选的，步骤(2)中CH₂Cl₂和三氟乙酸中的体积比为1:(1～2)，进一步优选的方案为1:(0.8-1.2)。中间体1的摩尔质量与该混合溶剂的体积比为：1mM:(10～12mL)。反应时间进一步优选为为0.8-1.2h，提纯时间优选为1-3h。

优选的，步骤(3)中中间体2与肉豆蔻酸和原料c的摩尔比为：中间体2:肉豆蔻酸:原料c＝1:(1～3):(1～6)。进一步优选的，步骤(3)中中间体2与肉豆蔻酸和原料c的摩尔比为：中间体2:肉豆蔻酸:原料c＝1:(1～2):(3～5)。

优选的，步骤(4)将中间体3溶于5mL-20mL乙酸中，加入TiCl₄和20μL-200μLH₂O，其中中间体3与TiCl₄的摩尔比值为1:(1.2～5)。进一步优选的，中间体3与TiCl₄的摩尔比为1:(2～3)。

说明书中所述的室温是20℃-30℃。

本发明的检测基因毒素Colibactin荧光分子探针具有选择性好、灵敏度高、响应速度快等特点，并且由于发射处于近红外区域，可避免生物自发荧光的干扰，能良好的应用于生物体内基因毒素Colibactin的可视化成像分析。

附图说明

图1为本发明的荧光分子探针的合成示意图；

图2为本发明的荧光分子探针的核磁共振氢谱；

图3为本发明的荧光分子探针加入目标细菌裂解液后的荧光光谱变化图；

图4为本发明的荧光分子探针对不同细菌裂解液的检测选择性图，图中横坐标数字 1-8代表的物质如下：1.大肠杆菌(BL21)，2.鼠伤寒沙门氏菌，3.甲型副伤寒沙门氏菌，4.铜绿假单胞菌，5.金黄色葡萄球菌，6.大肠杆菌(K88)，7.肠炎沙门氏菌，8.猪霍乱沙门氏菌；

图5为本发明的荧光分子探针对常见小分子(A)、离子的选择性图(B)，(A)图横坐标数字1-28代表的物质如下：1.ClbP,2.K⁺,3.Na⁺,4.Mn²⁺,5.Fe³⁺,6.Ba²⁺,7.Cu²⁺,8. Zn²⁺,9.Al³⁺,10.Cd²⁺,11.Co²⁺,12.Mg²⁺,13.NH₄ ⁺,14.F^-,15.Cl^-,16.Br^-,17.I^-,18.NO₃ ^-,19. NO₂ ^-,20.S₂O₃ ^-,21.SO₃ ^2-,22.SO₄ ^2-,23.HCO₃ ^-,24.CO₃ ^2-,25.N₃ ^-,26.HSO₃ ^-,27.S^2-,28. CH₃COO^-.

(B)图横坐标数字1-30代表的物质如下：1.ClbP,2.甘氨酸Gly,3.组氨酸His,4.甲硫氨酸Met,5.天冬氨酸Asp,6.苏氨酸Thr,7.赖氨酸Lys,8.酪氨酸Try,9.谷氨酸Glu, 10.半胱氨酸Cys,11.同型半胱氨酸Hcy,12.谷胱甘肽GSH,13.ClO^-,14.叔丁基过氧化氢TBHP,15.¹O₂,16.ONOO^-,17.·OH,18.氧叔丁基·OtBu,19.O₂ ^-,20.尿素urea,21.H₂O₂, 22.酸性磷酸酶ACP,23.胆碱氧化酶ChOD,24.β-半乳糖苷酶β-Gal,25.磷酸二酯酶 PDE,26.胰蛋白酶Trypsin,27.辣根过氧化物酶HRP,28.葡萄糖氧化酶GOD,29.乙酰胆碱酯酶AchE,30.碱性磷酸酶ALP；

图6为本发明的荧光分子探针对目标细菌的荧光共聚焦成像图。

具体实施方式

以下将结合附图和具体实施例来进一步阐述本发明。这些实施例仅用于解释和说明本发明，而并非限制本发明的范围。

名称符号解释：

HATU：2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐；

DMAP：4-二甲氨基吡啶；

HEPES：4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸

实施例1：中间体1的制备

(1)N-Boc-D-天冬酰胺(140mg，600μmol)，(E)-2-(3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5- 二甲基环己-2-烯-1-基)丙二腈(127mg，300μmol)，HATU(457mg，1.2mmol)和催化量的4-二甲氨基吡啶(30mg,250μmol)在无水吡啶(0.5mL)溶液在25℃下搅拌7 小时。通过加入饱和碳酸氢钠水溶液(10mL)淬灭反应混合物。用乙酸乙酯(10mL×3) 萃取所得混合物。将合并的萃取液用Na₂SO₄干燥并真空浓缩，得到粗品。通过SiO₂柱色谱纯化粗产物，得到中间体1，产率为54％。

实施例2：中间体2的制备

中间体1(291mg，600μmol)溶于3mL CH₂Cl₂和3mL三氟乙酸中。25℃搅拌1h，加水除去三氟乙酸用乙酸乙酯萃取，有机相再用大量水洗，将有机相减压旋蒸除去后快速通过柱层析方法提纯，时间为2小时。得到中间体2，产率为67％。

实施例3：中间体2的制备

中间体1(291mg，600μmol)溶于3mL CH₂Cl₂和3mL三氟乙酸中。25℃搅拌4h，加水除去三氟乙酸用乙酸乙酯萃取，有机相再用大量水洗，将有机相减压旋蒸除去后快速通过柱层析方法提纯，时间为2小时。没有得到目标产率，可能由于反应时间过长导致目标产物分解。

实施例4：中间体2的制备

中间体1(291mg，600μmol)溶于3mL CH₂Cl₂和6mL三氟乙酸中。25℃搅拌1h，加水除去三氟乙酸用乙酸乙酯萃取，有机相再用大量水洗，将有机相减压旋蒸除去后快速通过柱层析方法提纯，时间为2小时。得到中间体2，产率为20％。

实施例5：中间体2的制备

中间体1(291mg，600μmol)溶于6mL CH₂Cl₂和3mL三氟乙酸中。25℃搅拌1h，加水除去三氟乙酸用乙酸乙酯萃取，有机相再用大量水洗，将有机相减压旋蒸除去后快速通过柱层析方法提纯，时间为2小时。得到中间体2，产率为25％。

实施例6：中间体2的制备

中间体1(291mg，600μmol)溶于3mL CH₂Cl₂和3mL三氟乙酸中。25℃搅拌1h，加水除去三氟乙酸用乙酸乙酯萃取，有机相再用大量水洗，将有机相减压旋蒸除去后通过柱层析方法提纯，时间为6小时。得到中间体2，产率为30％。

实施例7：中间体3的制备

将中间体2(231mg，600μmol)、肉豆蔻酸(205mg，900μmol)和HATU(608mg，1.6mmol)在吡啶(5mL)中的溶液在25℃搅拌6小时。停止反应后将反应液倒入大量饱和碳酸氢钠水溶液中有固体产生，抽滤后滤渣用乙酸乙酯溶解用Na₂SO₄干燥并真空浓缩，得到粗品。通过SiO₂柱色谱纯化粗产物，得到中间体3，产率为43％。

实施例8：探针的制备

将中间体3(595mg，1mmol)溶于5mL乙酸中，加入TiCl₄(187mg，1mmol)和 50μL H₂O。在25℃下搅拌2小时，通入饱和碳酸氢钠水溶液淬灭反应混合物后用乙酸乙酯萃取，将合并的萃取液干燥并真空浓缩，得到粗品，通过柱层析方法纯化粗产物，得到荧光分子探针，产率为43％。

实施例9：探针的制备

将中间体3(595mg，1mmol)溶于5mL乙酸中，加入TiCl₄(374mg，2mmol)和 50μL H₂O。在25℃下搅拌2小时，通入饱和碳酸氢钠水溶液淬灭反应混合物后用乙酸乙酯萃取，将合并的萃取液干燥并真空浓缩，得到粗品，通过柱层析方法纯化粗产物，得到荧光分子探针，产率为68％。

实施例10：探针的制备

将中间体3(595mg，1mmol)溶于5mL乙酸中，加入TiCl₄(561mg，3mmol)和 50μL H₂O。在25℃下搅拌2小时，通入饱和碳酸氢钠水溶液淬灭反应混合物后用乙酸乙酯萃取，将合并的萃取液干燥并真空浓缩，得到粗品，通过柱层析方法纯化粗产物，得到荧光分子探针，产率为84％。

实施例11：探针的制备

将中间体3(595mg，1mmol)溶于5mL乙酸中，加入TiCl₄(935mg，5mmol)和 50μL H₂O。在25℃下搅拌2小时，通入饱和碳酸氢钠水溶液淬灭反应混合物后用乙酸乙酯萃取，将合并的萃取液干燥并真空浓缩，得到粗品，通过柱层析方法纯化粗产物，得到荧光分子探针，产率为53％。

实施例12

将该分子荧光探针溶于DMF中，配置成1mmol/L的探针溶液；取探针溶液加入相应的DMF和HEPES(pH＝7.4)缓冲液，配置成10μM(有机相:HEPES水相＝2:8,v/v) 的溶液，分别加入10μL，50μL，100μL和200μL有ClbP表达的细菌裂解液，37℃下孵育1h后，以470nm作为激发波长，测试其荧光光谱变化情况。图2表明探针分子在 660nm处的荧光强度随着ClbP含量的增加而增强。

实施例13：

将该分子荧光探针溶于DMF中,配置成1mmol/L的探针溶液；取探针溶液加入相应的DMF和HEPES(pH＝7.4)缓冲液，配置成10μM(有机相:HEPES水相＝2:8,v/v)的溶液，分别加入不同种类的细菌裂解液，37℃下孵育1h后，以470nm作为激发波长，测试其荧光光谱变化情况。图3表明探针对检测能表达ClbP的细菌具有很好的选择性。

实施例14：

将该分子荧光探针溶于DMF中,配置成1mmol/L的探针溶液；取探针溶液加入相应的DMF和HEPES(pH＝7.4)缓冲液，配置成10μM(有机相:HEPES水相＝2:8,v/v)的溶液，分别加入常见小分子、离子，37℃下孵育1h后，以470nm作为激发波长，测试其荧光光谱变化情况。图4表明探针对检测能表达ClbP的细菌具有很好的选择性。

实施例15：

将该分子探针加入到细胞培养基中与能表达ClbP的细菌共培养2小时，随后进行荧光共聚焦成像。图5可以看出，加入本探针的细菌呈现出红色荧光，表明本探针可以用于细菌成像鉴定。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细的介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围因由所附的权利要求来限定。