一种黄曲霉毒素电化学传感器的制备方法及应用
阅读说明：本技术 一种黄曲霉毒素电化学传感器的制备方法及应用 (Preparation method and application of aflatoxin electrochemical sensor ) 是由 李月云 禹晓东 李新进 徐振 张津津 霍之林 于 2020-06-17 设计创作，主要内容包括：本发明属于免疫分析和生物传感技术领域,提供了一种黄曲霉毒素电化学传感器的制备方法及应用。本发明使用AuPt纳米粒子作为基底材料,其优良的导电性可以有效减小背景信号,同时具有大的表面积可以负载足量的抗体；利用Au/Cu<Sub>x</Sub>O@CeO<Sub>2</Sub>与检测抗体孵化作为信号标记以进一步增强电化学传感器的催化性能、放大信号,实现了对黄曲霉毒素的定量检测,具有检测限低,灵敏度高,重复性、选择性和稳定性好等优势,对黄曲霉毒素的检测具有重要的科学意义和应用价值。(The invention belongs to the technical field of immunoassay and biosensing, and provides a preparation method and application of an aflatoxin electrochemical sensor. According to the invention, AuPt nanoparticles are used as a substrate material, the excellent conductivity of the AuPt nanoparticles can effectively reduce background signals, and meanwhile, the AuPt nanoparticles have large surface area and can load sufficient antibodies; using Au/Cu x O@CeO 2 Incubation with a detection antibody is used as a signal marker to further enhance the catalytic performance of the electrochemical sensor and amplify signals, so that quantitative detection of aflatoxin is realized, and the method has the advantages of low detection limit, high sensitivity, good repeatability, selectivity and stability and the like, and has important scientific significance and application value for detection of aflatoxin.)
技术领域
本发明属于免疫分析、纳米材料和生物传感技术领域，提出了一种黄曲霉毒素电化学传感器的制备方法及应用。
背景技术
黄曲霉毒素具有强烈的生物毒性和致癌能力，温暖潮湿环境中的粮食和饲料，凡被黄曲霉菌和寄生曲霉菌污染都可能会产生黄曲霉毒素，并进一步通过食物链污染奶、蛋、肉等动物源食品，间接的进入人体内，最终造成肝肾损伤、繁殖障碍、免疫抑制、致癌致畸等严重后果。
目前黄曲霉毒素的检测方法有薄层层析法、液相色谱法、放射免疫分析法、酶联免疫法、亲和层析法、微柱筛选法、金标试纸法等。这些方法或多或少都具有不足之处，比如操作过程繁琐、复杂、耗时长、劳动量大；仪器设备昂贵、体积大、操作复杂，难以实现现场快速分析；灵敏度和重复性差。近些年发展的电化学免疫分析法开始广泛投入黄曲霉毒素的检测，其具有选择性高、响应快、操作简单、携带方便和适合于现场检测等优点，因此科研工作者正积极探索研制各种新型电化学传感器用于检测黄曲霉毒素。
本发明专利成功构建了一种黄曲霉毒素电化学传感器，该传感器基底材料为AuPt纳米粒子，其双金属结构具有良好的导电性，可以加速电子传输速率，凹凸不平的表面形貌使其具有较大的比表面积，可以更好的负载抗体Ab1。标记物Au/Cux[email protected]2为多刺核壳结构，多刺的表面形貌不仅增大了材料的比表面积，可以更好的固定抗体Ab2，同时具有优异的催化活性，可以实现检测信号的放大，进而增加免疫传感器的灵敏度。本发明采用AuPt纳米粒子作为基底材料，Au/Cux[email protected]2作为检测抗体标记物构建的电化学传感器，实现了对黄曲霉毒素的检测，具有低检测限，高灵敏度，可接受的重复性，选择性和稳定性，对黄曲霉毒素的检测具有重要的科学意义和应用价值。
发明内容
本发明提供了一种黄曲霉毒素电化学传感器的制备方法及应用，
实现了对黄曲霉毒素的灵敏检测。
本发明的目的之一是提供一种黄曲霉毒素电化学传感器的制备方法。
本发明的目的之二是将所制备的一种黄曲霉毒素电化学传感器应用于黄曲霉毒素的高灵敏、特异性检测。
本发明的技术方案，包括以下步骤。
1. 一种黄曲霉毒素电化学传感器的制备方法，步骤如下：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨成镜面，超纯水清洗干净；
（2）将6 µL、1.0 ~ 3.0 mg/mL的AuPt纳米粒子溶液滴涂于上述电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6 µL、8 ~ 12 µg/mL的黄曲霉毒素捕获抗体Ab1滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 °C冰箱中干燥；
（4）继续将3 µL、0.5 ~ 1.5 mg/mL、质量分数为1%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，以封闭电极表面上的非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，除去未结合的BSA，4°C冰箱中晾干；
（5）继续滴加6 µL、10 pg/mL ~ 60 ng/mL的一系列不同浓度的黄曲霉毒素抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4 °C冰箱中晾干；
（6）继续滴加6 µL、1.5 ~ 3.5 mg/mL的检测抗体孵化物Au/Cux[email protected]2-Ab2溶液于电极表面，置4 ℃冰箱中孵化40 min、超纯水冲洗、晾干，制得一种黄曲霉毒素电化学传感器。
2. AuPt纳米粒子溶液的制备，步骤如下：
（1）AuPt纳米粒子的制备
在1.0 mL超纯水中依次加入50 ~ 150 mg泊洛沙姆F127、20 ~ 40 mg碘化钾，搅拌均匀；加入0.8 mL、10 ~ 30 mmol/L氯铂酸、2.5 mL、10 ~ 30 mmol/L氯金酸，搅拌均匀；加入2.5 mL、0.05 ~ 0.15 mol/L抗坏血酸，90 ℃反应15 min；超纯水和乙醇分别离心清洗三次，60 ℃干燥12 h，制得AuPt纳米粒子；
（2）AuPt纳米粒子溶液的制备
将5 ~ 15 mg AuPt纳米粒子分散到在5 mL超纯水中，超声10 min，制得AuPt纳米粒子溶液。
3.检测抗体孵化物Au/Cux[email protected]2-Ab2溶液的制备，步骤如下：
（1）Au/Cux[email protected]2的制备
将100 mL、0.01 mol/L氯化铜溶液，置于55 ℃水浴中；加入10 mL、2 mol/L氢氧化钠溶液，反应30 min；再加入10 mL、0.6 mol/L抗坏血酸，反应3 h；超纯水和乙醇分别离心清洗三次，60 ℃真空干燥5 h，制得Cu2O立方；
在30 mL超纯水中加入20 ~ 40 mg Cu2O立方，搅拌均匀，加入500 ~ 700 μL、0.1 mol/L 硝酸铈，加热至60 ℃；加入3.0 ~ 4.0 mL、0.15 mol/L氨水，反应3 h；加入55 ~75 μL、20mmol/L氯金酸，反应15 min；加入65 μL、20 mmol/L柠檬酸钠，反应30 min；超纯水离心清洗三次，60 ℃真空干燥8~12 h，制得Au/Cux[email protected]2；
所述氯化铜溶液是在100 mL超纯水中加入0.14g氯化铜，搅拌5 min而制得；
（2）检测抗体孵化物Au/Cux[email protected]2-Ab2溶液的制备
将1.0 ~ 3.0 mL浓度为2 mg/mL的Au/Cux[email protected]2溶液加入到0.5 ~ 1.5 mL浓度为10 μg/mL的黄曲霉毒素检测抗体溶液Ab2中，4 ℃恒温振荡箱中震荡孵化12 h，离心洗涤，加入1.0 ~ 3.0 mL、pH = 7.38的磷酸缓冲溶液中，制得检测抗体孵化物Au/Cux[email protected]2-Ab2溶液，4 ℃下保存备用。
4.黄曲霉毒素的检测，步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、含10 mmol/L铁***溶液中进行测试；
（2）用计时电流法对黄曲霉毒素进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间300 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH = 7.38磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。
上述所述黄曲霉毒素选自下列之一：黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素G1。
本发明所用原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。
本发明的有益成果
（1）本发明使用的基底材料为AuPt纳米粒子，具有合成简易，稳定性好等优点，沟壑状的表面形貌使其具有更大的表面积，可以负载大量抗体Ab1，同时双金属结构也使其具有良好的导电性，可以实现信号的高效传导。Au/Cux[email protected]2作为检测抗体标记物，可以增加电化学传感器的灵敏度并提高其催化活性，实现检测信号的放大。Au/Cux[email protected]2为多刺核壳状结构，Cu2O和CuO的协同催化作用使其具有良好地催化活性，可以实现检测信号的放大，同时多刺形貌赋予其较大的比表面积，可以有效负载抗体Ab2。本发明采用AuPt纳米粒子作为基底材料，Au/Cux[email protected]2作为检测抗体标记物构建的电化学传感器，实现了对黄曲霉毒素的灵敏、快速检测。
（2）一种黄曲霉毒素电化学传感器实现了对黄曲霉毒素的检测，其中对黄曲霉毒素B1检测的线性范围为10 pg ~ 60 ng/mL，检测限为3.33 pg/mL，对黄曲霉毒素G1的检测，线性范围为10 pg ~ 60 ng/mL，检测限为3.33 pg/mL，表明此种基于Au/Cux[email protected]2的电化学传感器可以达到准确测定的目的。
具体实施方式
现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此。
实施例1 一种黄曲霉毒素电化学传感器的制备方法，步骤如下：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨成镜面，超纯水清洗干净；
（2）将6 µL、1.0 mg/mL的AuPt纳米粒子溶液滴涂于上述电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6 µL、8 µg/mL的黄曲霉毒素捕获抗体Ab1滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 °C冰箱中干燥；
（4）继续将3 µL、0.5 mg/mL、质量分数为1%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，以封闭电极表面上的非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，除去未结合的BSA，4 °C冰箱中晾干；
（5）继续滴加6 µL、10 pg/mL ~ 60 ng/mL的一系列不同浓度的黄曲霉毒素抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4 °C冰箱中晾干；
（6）继续滴加6 µL、1.5 mg/mL的检测抗体孵化物Au/Cux[email protected]2-Ab2溶液于电极表面，置4 ℃冰箱中孵化40 min、超纯水冲洗、晾干，制得一种黄曲霉毒素电化学传感器。
实施例2 一种黄曲霉毒素电化学传感器的制备方法，步骤如下：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨成镜面，超纯水清洗干净；
（2）将6 µL、2.0 mg/mL的AuPt纳米粒子溶液滴涂于上述电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6 µL、10 µg/mL的黄曲霉毒素捕获抗体Ab1滴加到电极表面，超纯水冲洗，4°C冰箱中干燥；
（4）继续将3 µL、1.0 mg/mL、质量分数为1%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，以封闭电极表面上的非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，除去未结合的BSA，4 °C冰箱中晾干；
（5）继续滴加6 µL、10 pg/mL ~ 60 ng/mL的一系列不同浓度的黄曲霉毒素抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4 °C冰箱中晾干；
（6）继续滴加6 µL、2.5 mg/mL的检测抗体孵化物Au/Cux[email protected]2-Ab2溶液于电极表面，置4 ℃冰箱中孵化40 min、超纯水冲洗、晾干，制得一种黄曲霉毒素电化学传感器。
实施例3 一种黄曲霉毒素电化学传感器的制备方法，步骤如下：
（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨成镜面，超纯水清洗干净；
（2）将6 µL、3.0 mg/mL的AuPt纳米粒子溶液滴涂于上述电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6 µL、12 µg/mL的黄曲霉毒素捕获抗体Ab1滴加到电极表面，超纯水冲洗，4°C冰箱中干燥；
（4）继续将3 µL、1.5 mg/mL、质量分数为1%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，以封闭电极表面上的非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，除去未结合的BSA，4 °C冰箱中晾干；
（5）继续滴加6 µL、10 pg/mL ~ 60 ng/mL的一系列不同浓度的黄曲霉毒素抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4 °C冰箱中晾干；
（6）继续滴加6 µL、3.5 mg/mL的检测抗体孵化物Au/Cux[email protected]2-Ab2溶液于电极表面，置4 ℃冰箱中孵化40 min、超纯水冲洗、晾干，制得一种黄曲霉毒素电化学传感器。
实施例4 AuPt纳米粒子溶液的制备，步骤如下：
（1）AuPt纳米粒子的制备
在1.0 mL超纯水中依次加入50 mg泊洛沙姆F127、20 mg碘化钾，搅拌均匀；加入0.8mL、10 mmol/L氯铂酸、2.5 mL、10 mmol/L氯金酸，搅拌均匀；加入2.5 mL、0.05 mol/L抗坏血酸，90 ℃反应15 min；超纯水和乙醇分别离心清洗三次，60 ℃干燥12 h，制得AuPt纳米粒子；
（2）AuPt纳米粒子溶液的制备
将5 mg AuPt纳米粒子分散到在5 mL超纯水中，超声10 min，制得AuPt纳米粒子溶液。
实施例5AuPt纳米粒子溶液的制备，步骤如下：
（1）AuPt纳米粒子的制备
在1.0 mL超纯水中依次加入100 mg泊洛沙姆F127、30 mg碘化钾，搅拌均匀；加入0.8mL、20 mmol/L氯铂酸、2.5 mL、20 mmol/L氯金酸，搅拌均匀；加入2.5 mL、0.10 mol/L抗坏血酸，90 ℃反应15 min；超纯水和乙醇分别离心清洗三次，60 ℃干燥12 h，制得AuPt纳米粒子；
（2）AuPt纳米粒子溶液的制备
将10 mg AuPt纳米粒子分散到在5 mL超纯水中，超声10 min，制得AuPt纳米粒子溶液。
实施例6AuPt纳米粒子溶液的制备，步骤如下：
（1）AuPt纳米粒子的制备
在1.0 mL超纯水中依次加入150 mg泊洛沙姆F127、40 mg碘化钾，搅拌均匀；加入0.8mL、30 mmol/L氯铂酸、2.5 mL、30 mmol/L氯金酸，搅拌均匀；加入2.5 mL、0.15 mol/L抗坏血酸，90 ℃反应15 min；超纯水和乙醇分别离心清洗三次，60 ℃干燥12 h，制得AuPt纳米粒子；
（2）AuPt纳米粒子溶液的制备
将15 mg AuPt纳米粒子分散到在5 mL超纯水中，超声10 min，制得AuPt纳米粒子溶液。
实施例7检测抗体孵化物Au/Cux[email protected]2-Ab2溶液的制备，步骤如下：
（1）Au/Cux[email protected]2的制备
将100 mL、0.01 mol/L氯化铜溶液，置于55 ℃水浴中；加入10 mL、2 mol/L氢氧化钠溶液，反应30 min；再加入10 mL、0.6 mol/L抗坏血酸，反应3 h；超纯水和乙醇分别离心清洗三次，60 ℃真空干燥5 h，制得Cu2O立方；
在30 mL超纯水中加入20 mg Cu2O立方，搅拌均匀，加入500μL、0.1 mol/L 硝酸铈，加热至60 ℃；加入3.0 mL、0.15 mol/L氨水，反应3 h；加入55 μL、20 mmol/L氯金酸，反应15min；加入65 μL、20 mmol/L柠檬酸钠，反应30 min；超纯水离心清洗三次，60 ℃真空干燥8h，制得Au/Cux[email protected]2；
所述氯化铜溶液是在100 mL超纯水中加入0.14g氯化铜，搅拌5 min而制得；
（2）检测抗体孵化物Au/Cux[email protected]2-Ab2溶液的制备
将1.0 mL浓度为2 mg/mL的Au/Cux[email protected]2溶液加入到0.5 mL浓度为10 μg/mL的黄曲霉毒素检测抗体溶液Ab2中，4 ℃恒温振荡箱中震荡孵化12 h，离心洗涤，加入1.0 mL、pH =7.38的磷酸缓冲溶液中，制得检测抗体孵化物Au/Cux[email protected]2-Ab2溶液，4 ℃下保存备用。
实施例8检测抗体孵化物Au/Cux[email protected]2-Ab2溶液的制备，步骤如下：
（1）Au/Cux[email protected]2的制备
将100 mL、0.01 mol/L氯化铜溶液，置于55 ℃水浴中；加入10 mL、2 mol/L氢氧化钠溶液，反应30 min；再加入10 mL、0.6 mol/L抗坏血酸，反应3 h；超纯水和乙醇分别离心清洗三次，60 ℃真空干燥5 h，制得Cu2O立方；
在30 mL超纯水中加入30 mg Cu2O立方，搅拌均匀，加入600 μL、0.1 mol/L 硝酸铈，加热至60 ℃；加入3.5 mL、0.15 mol/L氨水，反应3 h；加入65 μL、20 mmol/L氯金酸，反应15min；加入65 μL、20 mmol/L柠檬酸钠，反应30 min；超纯水离心清洗三次，60 ℃真空干燥10h，制得Au/Cux[email protected]2；
所述氯化铜溶液是在100 mL超纯水中加入0.14g氯化铜，搅拌5 min而制得；
（2）检测抗体孵化物Au/Cux[email protected]2-Ab2溶液的制备
将2.0 mL浓度为2 mg/mL的Au/Cux[email protected]2溶液加入到1.0 mL浓度为10 μg/mL的黄曲霉毒素检测抗体溶液Ab2中，4 ℃恒温振荡箱中震荡孵化12 h，离心洗涤，加入2.0 mL、pH =7.38的磷酸缓冲溶液中，制得检测抗体孵化物Au/Cux[email protected]2-Ab2溶液，4 ℃下保存备用。
实施例9检测抗体孵化物Au/Cux[email protected]2-Ab2溶液的制备，步骤如下：
（1）Au/Cux[email protected]2的制备
将100 mL、0.01 mol/L氯化铜溶液，置于55 ℃水浴中；加入10 mL、2 mol/L氢氧化钠溶液，反应30 min；再加入10 mL、0.6 mol/L抗坏血酸，反应3 h；超纯水和乙醇分别离心清洗三次，60 ℃真空干燥5 h，制得Cu2O立方；
在30 mL超纯水中加入40 mg Cu2O立方，搅拌均匀，加入700 μL、0.1 mol/L 硝酸铈，加热至60 ℃；加入4.0 mL、0.15 mol/L氨水，反应3 h；加入75 μL、20 mmol/L氯金酸，反应15min；加入65 μL、20 mmol/L柠檬酸钠，反应30 min；超纯水离心清洗三次，60 ℃真空干燥12h，制得Au/Cux[email protected]2；
所述氯化铜溶液是在100 mL超纯水中加入0.14g氯化铜，搅拌5 min而制得；
（2）检测抗体孵化物Au/Cux[email protected]2-Ab2溶液的制备
将3.0 mL浓度为2 mg/mL的Au/Cux[email protected]2溶液加入到1.5 mL浓度为10 μg/mL的黄曲霉毒素检测抗体溶液Ab2中，4 ℃恒温振荡箱中震荡孵化12 h，离心洗涤，加入3.0 mL、pH =7.38的磷酸缓冲溶液中，制得检测抗体孵化物Au/Cux[email protected]2-Ab2溶液，4 ℃下保存备用。
实施例10黄曲霉毒素B1的检测，步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、含10 mmol/L铁***溶液中进行测试；
（2）用计时电流法对黄曲霉毒素进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间300 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH = 7.38磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化；
（4）根据所得电流与黄曲霉毒素B1浓度之间的线性关系，绘制工作曲线，测得线性范围为10pg ~ 60 ng/mL，检测限最低3.33pg/mL。
实施例11黄曲霉毒素G1的检测
按照实施例10的方法对样品中黄曲霉毒素G1进行检测，其线性范围为10 pg ~ 60 ng/mL，检测限为3.33 pg/mL。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种超高灵敏度多巴胺生物传感器及其制备方法