多粘菌素衍生物、其制备方法和应用
阅读说明：本技术 多粘菌素衍生物、其制备方法和应用 (Polymyxin derivatives, preparation method and application thereof ) 是由 李亚利 戈梅 饶敏 夏兴 黄亚妮 蔡晓龙 于 2019-03-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了通式(Ⅰ)所示的多粘菌素衍生物及其药学可接受的盐和溶剂合物：<Image he="425" wi="700" file="DDA0001992713500000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>。本发明还提供了上述多粘菌素衍生物的药物组合物,制备方法和在制备预防或治疗细菌感染性疾病药物中的应用。本发明提供的多粘菌素衍生物具有良好的抗革兰氏阴性菌的抗菌活性,对于开发抗菌药物具有重要意义。(The invention discloses a polymyxin derivative shown as a general formula (I) and pharmaceutically acceptable salts and solvates thereof: . The invention also provides a pharmaceutical composition of the polymyxin derivative, a preparation method and application in preparing medicines for preventing or treating bacterial infectious diseases. The polymyxin derivative provided by the invention has good antibacterial activity against gram-negative bacteria, and has important significance for developing antibacterial drugs.)
技术领域
本发明属于药物化学合成技术领域，具体涉及一种多粘菌素衍生物、其制备方法和应用。
背景技术
近年来，革兰氏阴性菌引发的感染病例在增多，而临床上很多革兰氏阴性菌已经对广谱的抗生素产生耐药性，开发针对革兰氏阴性耐药菌的新型抗菌药物迫在眉睫。到目前为止，多粘菌素对多重耐药的革兰氏阴性菌感染的治疗有很好的效果，特别对铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌及肺炎克雷伯菌效果显著，由此，多粘菌素也被称为G-菌感染治疗的最后一道防线。多粘菌素是由多粘芽孢杆菌产生的一组由A、B、C、 D、E等组分的环肽类抗生素，最终仅多粘菌素B和多粘菌素E(又称粘菌素)因其良好的疗效和相对较高的安全性而用于临床。多粘菌素B为由30多种多肽形成的硫酸盐制剂，B1、B2为其主要部分，多以非肠道形式给药，用于治疗眼、耳部疾病，粘菌素则多为甲磺酸盐制剂，需在体内水解为粘菌素而发挥作用。
然而，多粘菌素在杀菌的同时存在较强的肾毒性(发病率为0-37％)和神经毒性(发病率为0-7％)，且呈剂量依赖性，使得多粘菌素药物在20世纪80年代对人类临床上的使用受限，仅作为兽药。随着革兰氏阴性菌的耐药性G-的不断出现，促使人们再次研发多粘菌素作为新型临床药物用于治疗革兰氏阴性菌。因此，迫切需要研发新型的多粘菌素类抗生素。
发明内容
本发明的发明人以多粘菌素为出发化合物，对其进行化学改造，获得了一系列改进的多粘菌素衍生物及其药学上可接受的盐和溶剂合物。经测试，该多粘菌素衍生物对于革兰氏阴性菌具有良好的抑菌活性，能够用于制备预防或治疗革兰氏阴性菌感染的药物。
本发明的第一个目的在于提供通式(Ⅰ)所示的多粘菌素衍生物及其药学可接受的盐和溶剂合物：
其中：
R1为CH(CH3)2或CH2C6H5；
n为0或1；
当n为0时：
R2为：
-Y-C7-14烷基、-Y-C3-10环烷基、-Y-C2-10杂环基、-Y-C6-12芳基、-Y-C5-12杂芳基；
-Y-C1-7烷基C3-10环烷基、-Y-C1-7烷基C2-10杂环基、-Y-C1-7烷基C6-12芳基、-Y-C1-7烷基C5-12杂芳基；
-Y-C3-10环烷基C1-7烷基、-Y-C2-10杂环基C1-7烷基、-Y-C6-12芳基C1-7烷基、 -Y-C5-12杂芳基C1-7烷基；
-Y-C1-7烷基-O-C1-10烷基、-Y-C1-7烷基-O-C3-10环烷基、-Y-C1-7烷基-O-C2-10杂环基、-Y-C1-7烷基-O-C6-12芳基、-Y-C1-7烷基-O-C5-12杂芳基；
-Y-C1-7烷基-NH-C1-10烷基、-Y-C1-7烷基-NH-C3-10环烷基、-Y-C1-7烷基-NH-C2-10杂环基、-Y-C1-7烷基-NH-C6-12芳基、-Y-C1-7烷基-NH-C5-12杂芳基；
Y为化学键、-C(O)-；
X-为化学键、-C(O)-、-NHC(O)-、-OC(O)-、-CH2-或-SO2-；
R5为：
-C3-10环烷基、-C2-10杂环基、-C6-12芳基、-C12-14联苯基、-C5-12杂芳基；
-C1-10烷基-Z-C1-10烷基、-C1-7烷基-Z-C3-10环烷基、-C1-7烷基-Z-C2-10杂环基、 -C1-7烷基-Z-C6-12芳基、-C1-7烷基-Z-C12-14联苯基、-C1-7烷基-Z-C5-12杂芳基；
-C3-10环烷基-Z-C1-7烷基、-C2-10杂环基-Z-C1-7烷基、-C6-12芳基-Z-C1-7烷基、 -C12-14联苯基-Z-C1-7烷基、-C5-12杂芳基-Z-C1-7烷基；
-C6-12-芳基-Z-C1-10烷基、-C6-12-芳基-Z-C3-10环烷基、-C6-12-芳基-Z-C2-10杂环基、-C6-12-芳基-Z-C6-12芳基、-C6-12-芳基-Z-C12-14联苯基、-C6-12-芳基-Z-C5-12杂芳基；
Z为共价键、-C1-3烷基-、-C(O)-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S(O2)O-、 -OS(O2)-；
R2、R5，其各自任选地被一个或多个-N(R6)-L-R7取代、0-3个-OR8取代或卤素取代；R6代表-H、-C1-10烷基、-C3-10环烷基、-C2-10杂环基、-C6-12芳基、-C12-14联苯基、-C5-12杂芳基；
且R7代表-H、-C1-10烷基、-C3-10环烷基、-C2-10杂环基、-C6-12芳基、-C12-14联苯基、-C5-12杂芳基；
R8代表-H、-C1-10烷基、-C3-10环烷基、-C2-10杂环基、-C6-12芳基、-C12-14联苯基、 -C5-12杂芳基。
当n为1时：
R2为H，
R3为CH2SH、CH2CH2SCH3、CH2OH、CH(CH3)OH、CH2CONH2、CH2CH2CONH2、 CH2C4H5N2、CH2C6H5OH、CH2C8H6N、CH2CH2CH2CH2NH2、CH2CH2NH2、 CH2CH2CH2CH4N3，
R4为：
-Y-C7-14烷基、-Y-C3-10环烷基、-Y-C2-10杂环基、-Y-C6-12芳基、-Y-C5-12杂芳基；
-Y-C1-7烷基C3-10环烷基、-Y-C1-7烷基C2-10杂环基、-Y-C1-7烷基C6-12芳基、-Y-C1-7烷基C5-12杂芳基；
-Y-C3-10环烷基C1-7烷基、-Y-C2-10杂环基C1-7烷基、-Y-C6-12芳基C1-7烷基、 -Y-C5-12杂芳基C1-7烷基；
-Y-C1-7烷基-O-C1-10烷基、-Y-C1-7烷基-O-C3-10环烷基、-Y-C1-7烷基-O-C2-10杂环基、-Y-C1-7烷基-O-C6-12芳基、-Y-C1-7烷基-O-C5-12杂芳基；
-Y-C1-7烷基-NH-C1-10烷基、-Y-C1-7烷基-NH-C3-10环烷基、-Y-C1-7烷基-NH-C2-10杂环基、-Y-C1-7烷基-NH-C6-12芳基、-Y-C1-7烷基-NH-C5-12杂芳基；
Y为化学键、-C(O)-；
X-为化学键、-C(O)-、-NHC(O)-、-OC(O)-、-CH2-或-SO2-；
R5为：
-C3-10环烷基、-C2-10杂环基、-C6-12芳基、-C12-14联苯基、-C5-12杂芳基；
-C1-10烷基-Z-C1-10烷基、-C1-7烷基-Z-C3-10环烷基、-C1-7烷基-Z-C2-10杂环基、 -C1-7烷基-Z-C6-12芳基、-C1-7烷基-Z-C12-14联苯基、-C1-7烷基-Z-C5-12杂芳基；
-C3-10环烷基-Z-C1-7烷基、-C2-10杂环基-Z-C1-7烷基、-C6-12芳基-Z-C1-7烷基、 -C12-14联苯基-Z-C1-7烷基、-C5-12杂芳基-Z-C1-7烷基；
-C6-12-芳基-Z-C1-10烷基、-C6-12-芳基-Z-C3-10环烷基、-C6-12-芳基-Z-C2-10杂环基、-C6-12-芳基-Z-C6-12芳基、-C6-12-芳基-Z-C12-14联苯基、-C6-12-芳基-Z-C5-12杂芳基；
Z为共价键、-C1-3烷基-、-C(O)-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S(O2)O-、 -OS(O2)-；
R2、R3、R4、R5，其各自任选地被一个或多个-N(R6)-L-R7取代、0-3个-OR8取代或卤素取代；
R6代表-H、-C1-10烷基、-C3-10环烷基、-C2-10杂环基、-C6-12芳基、-C12-14联苯基、 -C5-12杂芳基；
且R7代表-H、-C1-10烷基、-C3-10环烷基、-C2-10杂环基、-C6-12芳基、-C12-14联苯基、-C5-12杂芳基；
R8代表-H、-C1-10烷基、-C3-10环烷基、-C2-10杂环基、-C6-12芳基、-C12-14联苯基、 -C5-12杂芳基。
根据本发明的优选技术方案，所述药学上可接受的盐为所述通式(Ⅰ)所示的多粘菌素衍生物与酸形成的盐。
优选地，所述的酸选自盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、天冬氨酸或谷氨酸中的一种或多种。
优选地，所述溶剂化物中，所述溶剂不干扰溶质的生物活性。作为实例，溶剂可以为水、乙醇或乙酸，溶剂化的方法是本领域公知的方法。所述溶剂合物为水合物、乙醇合物或乙酸合物。
本发明的第二个目的在于提供一类药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的上述多黏菌素衍生物或其在药学上可接受的盐，及药学上可接受的载体。
本发明中，所述的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，如稀释剂，赋形剂(如水等)，粘合剂(如纤维素衍生物、明胶、聚乙烯吡咯烷酮等)，填充剂(如淀粉等)，崩裂剂(如碳酸钙、碳酸氢钠)。另外，还可以在所述药物组合物中加入其他辅助剂，如香味剂和甜味剂等。
本发明的药物组合物，可以通过静脉注射、皮下注射或口服的形式施加于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制备成常规的固体制剂如片剂、粉剂或胶囊等；用于注射时，可将其制备成注射液。本发明的药物组合物的各种剂型可以采用医学领域常规的方法进行制备，其中活性成分的含量为0.1％～99.5％(重量比)。制剂中，本发明的化合物的重量含量为0.1～99.9％，优选的含量为0.5～90％。
上述药物组合物施加于需要治疗的患者的一般剂量可以参照现有技术中多黏菌素的使用剂量。
本发明的第三个目的在于提供如上所述的多粘菌素衍生物的制备方法，所述方法包括：
方法(一)、当n＝1时，所述通式(Ⅰ)所示的多粘菌素衍生物的合成路线为：
；其中：
R1为CH(CH3)2或CH2C6H5，
R2为H，
R3为CH2SH、CH2CH2SCH3、CH2OH、CH(CH3)OH、CH2CONH2、CH2CH2CONH2、 CH2C4H5N2、CH2C6H5OH、CH2C8H6N、CH2CH2CH2CH2NH2、CH2CH2NH2、 CH2CH2CH2CH4N3，
R4为：
-Y-C7-14烷基、-Y-C3-10环烷基、-Y-C2-10杂环基、-Y-C6-12芳基、-Y-C5-12杂芳基；
-Y-C1-7烷基C3-10环烷基、-Y-C1-7烷基C2-10杂环基、-Y-C1-7烷基C6-12芳基、-Y-C1-7烷基C5-12杂芳基；
-Y-C3-10环烷基C1-7烷基、-Y-C2-10杂环基C1-7烷基、-Y-C6-12芳基C1-7烷基、 -Y-C5-12杂芳基C1-7烷基；
-Y-C1-7烷基-O-C1-10烷基、-Y-C1-7烷基-O-C3-10环烷基、-Y-C1-7烷基-O-C2-10杂环基、-Y-C1-7烷基-O-C6-12芳基、-Y-C1-7烷基-O-C5-12杂芳基；
-Y-C1-7烷基-NH-C1-10烷基、-Y-C1-7烷基-NH-C3-10环烷基、-Y-C1-7烷基-NH-C2-10杂环基、-Y-C1-7烷基-NH-C6-12芳基、-Y-C1-7烷基-NH-C5-12杂芳基；
Y为化学键、-C(O)-；
X-为化学键、-C(O)-、-NHC(O)-、-OC(O)-、-CH2-或-SO2-；
R5为：
-C3-10环烷基、-C2-10杂环基、-C6-12芳基、-C12-14联苯基、-C5-12杂芳基；
-C1-10烷基-Z-C1-10烷基、-C1-7烷基-Z-C3-10环烷基、-C1-7烷基-Z-C2-10杂环基、 -C1-7烷基-Z-C6-12芳基、-C1-7烷基-Z-C12-14联苯基、-C1-7烷基-Z-C5-12杂芳基；
-C3-10环烷基-Z-C1-7烷基、-C2-10杂环基-Z-C1-7烷基、-C6-12芳基-Z-C1-7烷基、 -C12-14联苯基-Z-C1-7烷基、-C5-12杂芳基-Z-C1-7烷基；
-C6-12-芳基-Z-C1-10烷基、-C6-12-芳基-Z-C3-10环烷基、-C6-12-芳基-Z-C2-10杂环基、-C6-12-芳基-Z-C6-12芳基、-C6-12-芳基-Z-C12-14联苯基、-C6-12-芳基-Z-C5-12杂芳基；
Z为共价键、-C1-3烷基-、-C(O)-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S(O2)O-、 -OS(O2)-；
R2、R3、R4、R5，其各自任选地被一个或多个-N(R6)-L-R7取代、0-3个-OR8取代或卤素取代；
R6代表-H、-C1-10烷基、-C3-10环烷基、-C2-10杂环基、-C6-12芳基、-C12-14联苯基、 -C5-12杂芳基；
且R7代表-H、-C1-10烷基、-C3-10环烷基、-C2-10杂环基、-C6-12芳基、-C12-14联苯基、-C5-12杂芳基；
R8代表-H、-C1-10烷基、-C3-10环烷基、-C2-10杂环基、-C6-12芳基、-C12-14联苯基、 -C5-12杂芳基。
方法(二)、当n＝0时，所述通式(Ⅰ)所示的多粘菌素衍生物的合成路线为：
；或者，
其中：
R1为CH(CH3)2或CH2C6H5；
R2为：
-Y-C7-14烷基、-Y-C3-10环烷基、-Y-C2-10杂环基、-Y-C6-12芳基、-Y-C5-12杂芳基；
-Y-C1-7烷基C3-10环烷基、-Y-C1-7烷基C2-10杂环基、-Y-C1-7烷基C6-12芳基、-Y-C1-7烷基C5-12杂芳基；
-Y-C3-10环烷基C1-7烷基、-Y-C2-10杂环基C1-7烷基、-Y-C6-12芳基C1-7烷基、 -Y-C5-12杂芳基C1-7烷基；
-Y-C1-7烷基-O-C1-10烷基、-Y-C1-7烷基-O-C3-10环烷基、-Y-C1-7烷基-O-C2-10杂环基、-Y-C1-7烷基-O-C6-12芳基、-Y-C1-7烷基-O-C5-12杂芳基；
-Y-C1-7烷基-NH-C1-10烷基、-Y-C1-7烷基-NH-C3-10环烷基、-Y-C1-7烷基-NH-C2-10杂环基、-Y-C1-7烷基-NH-C6-12芳基、-Y-C1-7烷基-NH-C5-12杂芳基；
Y为化学键、-C(O)-；
X-为化学键、-C(O)-、-NHC(O)-、-OC(O)-、-CH2-或-SO2-；
R5为：
-C3-10环烷基、-C2-10杂环基、-C6-12芳基、-C12-14联苯基、-C5-12杂芳基；
-C1-10烷基-Z-C1-10烷基、-C1-7烷基-Z-C3-10环烷基、-C1-7烷基-Z-C2-10杂环基、 -C1-7烷基-Z-C6-12芳基、-C1-7烷基-Z-C12-14联苯基、-C1-7烷基-Z-C5-12杂芳基；
-C3-10环烷基-Z-C1-7烷基、-C2-10杂环基-Z-C1-7烷基、-C6-12芳基-Z-C1-7烷基、 -C12-14联苯基-Z-C1-7烷基、-C5-12杂芳基-Z-C1-7烷基；
-C6-12-芳基-Z-C1-10烷基、-C6-12-芳基-Z-C3-10环烷基、-C6-12-芳基-Z-C2-10杂环基、-C6-12-芳基-Z-C6-12芳基、-C6-12-芳基-Z-C12-14联苯基、-C6-12-芳基-Z-C5-12杂芳基；
Z为共价键、-C1-3烷基-、-C(O)-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S(O2)O-、 -OS(O2)-；
R2、R5，其各自任选地被一个或多个-N(R6)-L-R7取代、0-3个-OR8取代或卤素取代；
R6代表-H、-C1-10烷基、-C3-10环烷基、-C2-10杂环基、-C6-12芳基、-C12-14联苯基、 -C5-12杂芳基；
且R7代表-H、-C1-10烷基、-C3-10环烷基、-C2-10杂环基、-C6-12芳基、-C12-14联苯基、-C5-12杂芳基；
R8代表-H、-C1-10烷基、-C3-10环烷基、-C2-10杂环基、-C6-12芳基、-C12-14联苯基、 -C5-12杂芳基。
上述方法中，化合物Ⅱ的制备方法详见中间体1和中间体3的制备方法。
本发明的第四个目的在于提供如上所述的多粘菌素衍生物在制备治疗细菌感染性疾病药物中的应用。
根据本发明的优选实施例，提供如上所述的多粘菌素衍生物在制备治疗革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。
优选地，所述的多粘菌素衍生物在制备预防或治疗多粘菌素耐药性革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。即所述革兰氏阴性菌是多粘菌素耐药性革兰氏阴性菌，例如：对多粘菌素耐药的鲍曼不动杆菌。
本发明的第五个目的在于提供预防或治疗革兰氏阴性菌感染的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的上述的多粘菌素衍生物及其药学上可接受的盐和溶剂化物。
与现有技术相比，本发明的多粘菌素衍生物的有益效果在于：
本发明的如通式(Ⅰ)所示的多粘菌素衍生物及其药学上可接受的盐和溶剂合物，具有良好的抗菌活性，尤其是抗革兰氏阴性菌活性，与现有的多粘菌素E或B相比，对于革兰氏阴性菌具有相当或改善的抑菌活性，能够应用于制备治疗细菌感染及革兰氏阴性菌感染的药物；且与多粘菌素E相比，对于耐药性的革兰氏阴性菌具有相当或改善的抑菌活性，能够应用于制备预防和治疗耐药性的细菌感染及耐药性的革兰氏阴性菌感染的药物。因此，对于新的抗菌药物的开发具有重要的意义。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
本发明中，下列缩写具有以下含义。未定义的缩写具有其普遍接受的含义，除非另外声明，所有室温均指温度20℃～30℃。
PMB 多粘菌素B
PMBN 多粘菌素B九肽
Boc-ON 2-(叔丁氧羰基氧亚氨基)-2-苯乙腈
PME 多粘菌素E
DCM 二氯甲烷
EDCI 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐
HOBt 1-羟基苯并***
LiOH-H2O 一水合氢氧化锂
TFA 三氟乙酸
HATU 2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
DIPEA N，N-二异丙基乙胺
MTBE 甲基叔丁基醚
PYBOP 1H-苯并***-1-基-氧三吡咯烷基六氟磷酸盐
MIC 最低抑菌浓度
以下实施例中，使用的洗脱溶液和预洗溶液的浓度百分比均为体积百分比，所述的收率是指摩尔收率。
以下实施例中，HPLC监测条件：
流动相：A.0.05％甲酸水 B.0.05％甲酸乙腈
色谱柱：Agilent Poroshell 120EC-C18(4.6mm×150mm，2.7μm)
柱温：45℃
检测波长：210，240，254，280，360nm
分析时间：50min
流速：0.7mL/min
HPLC梯度条件如表1所示：
表1、HPLC梯度条件
时间(min)
A％
B％
流速(ml/min)
0
95
5
0.7
10
85
15
0.7
15
75
25
0.7
25
45
55
0.7
30
5
95
0.7
50
5
95
0.7
PSN柱层析的条件为：
(一)、多粘菌素B九肽(中间体1)和多粘菌素E九肽(中间体3)的PSN柱层析条件：
(1)、柱体积：1L。上样液为待分离样品的水溶液，上样体积(ml)V上样＝20*m 上样量/g
(2)、上样后水洗4倍柱体积，分部收集，每瓶0.5倍柱体积。
(3)、水洗结束后用10％的乙腈酸洗(TFA0.05％)洗3倍柱体积，合并收集。
(4)、10％乙腈酸洗完后用20％乙腈酸洗3倍柱体积。合并收集。然后用50％乙醇酸冲洗柱子，最后用水平衡至中性。
(二)、四-(Boc)多粘菌素B九肽(中间体2)和四-(Boc)多粘菌素E九肽 (中间体4)的PSN柱层析条件：
柱体积1L。上样液为待分离样品的水溶液，上样体积V上样＝20*m上样量/g。上样后，先用50％的甲醇水洗4倍柱体积，合并收集，接着用70％的甲醇水分部收集，每0.5 倍柱体积收集一瓶，共洗4倍柱体积，接着再用75％的甲醇水洗脱，分部收集，每瓶 0.5倍柱体积，共洗4倍柱体积，最后用85％的甲醇水洗两倍柱体积，合并收集。
本发明提供一种通式(Ⅰ)所示的多粘菌素衍生物及其药学可接受的盐和溶剂合物：
以下实施例中涉及的通式(Ⅰ)的具体化合物的结构如表2所示。
表2、各化合物的结构
以下通过多个具体实施例制备表2中的化合物，作为示例。
实施例1、中间体1—多粘菌素B九肽的合成
(1)、将PMB(2.0g)超声溶解于磷酸钾缓冲液中(pH＝7.5,25ml)，在50℃搅拌下，加入木瓜蛋白酶(3.0U/mg)及在50℃进一步反应1h，HPLC监测反应进程。反应结束后，用甲醇淬灭反应体系，真空浓缩上清液，得到多粘菌素B九肽粗品。
(2)、使用PSN柱纯化步骤(1)的多粘菌素B九肽粗品，浓缩洗脱液得到白色固体产物，即得到中间体1—多粘菌素B九肽(简称PMBN)(0.5g，0.52mmol)， m/z 963.57[M+H]+。
本实施例的反应过程如下式所示。
实施例2、中间体2—四-(Boc)多粘菌素B九肽的合成
(1)、将实施例1制备的中间体1多粘菌素B九肽(1.0g，1.04mmol)悬浮于水(1.5ml)中，向悬浮体系中加入1,4-二氧六环(1.5ml)和三乙胺(1.5ml)，冰浴条件下体系搅拌10min，随后添加Boc-ON(1.08g，4.37mmol)，继续室温搅拌，HPLC 监测反应进程。反应结束后，体系中的有机相旋干，并进行PSN柱层析，得到白色固体，即为中间体2—四-(Boc)多粘菌素B九肽(0.9g，0.66mmol)，m/z 1363.78[M+H]+。
本实施例的反应过程如下式所示。
实施例3、中间体3—多粘菌素E九肽的合成
(1)、将PME(2.0g)超声溶解于磷酸钾缓冲液中(pH＝7.5,25ml)，在50℃搅拌下，加入木瓜蛋白酶(3.0U/mg)及在50℃进一步反应1h，HPLC监测反应进程。反应结束后，用甲醇淬灭反应体系，真空浓缩上清液，得到多粘菌素E九肽粗品。
(2)、使用PSN柱纯化步骤(1)制备得到的多粘菌素E九肽粗品，浓缩洗脱液得到白色固体产物，即为中间体3—多粘菌素E九肽(简称PMEN)(0.98g，10.55mmol)， m/z 929.58[M+H]+。
本实施例的反应过程如下式所示。
实施例4、中间体4—四-(Boc)多粘菌素E九肽的合成
将实施例3制备的中间体3多粘菌素E九肽(1.0g，1.08mmol)悬浮于水(1.5ml)，向悬浮体系中加入1,4-二氧六环(1.5ml)和三乙胺(1.5ml)，冰浴条件下体系搅拌 10min，随后添加Boc-ON(1.08g，4.37mmol)，继续室温搅拌，HPLC监测反应进程。反应结束后，体系中的有机相旋干并进行PSN柱层析，得到白色固体，即为中间体 4—4四-(Boc)多粘菌素E九肽(0.76g，0.57mmol)，m/z 1329.79[M+H]+。
本实施例的反应过程如下式所示。
实施例5、N-(([1,1’-联苯]-4-甲基)-[3-氨基十一烷酰]-多粘菌素B(化合物7)的 合成 (1)、将(S)-2-氨基-4-((叔丁氧羰基)氨基)丁酸甲酯(845mg，3.64mmol)溶于甲醇(10ml)中，体系中加入联苯甲醛(797mg，4.37mmol)，NaCNBN3(275mg，4.37mmol)，无水ZnCl2(496mg，3.64mmol)，体系在室温下搅拌过夜，HPLC监测反应进程。反应结束后，使用EA萃取体系，浓缩有机相并进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯 (15:1)为洗脱剂，得到白色固体产物，m/z 399.22[M+H]+，为中间体5(876mg， 2.2mmol)。
(2)、上步制备的中间体5(905mg，2.27mmol)溶于无水DCM(5ml)中，体系中加入3-((叔丁氧羰基)氨基)十一烷基酸(822mg，2.73mmol)，EDCI(523mg， 2.73mmol)，HOBt(369mg，2.73mmol)，N2保护条件下，室温反应，HPLC监测反应进程。反应结束后体系用EA萃取，有机相浓缩并进行柱层析，石油醚-乙酸乙酯 (10:1)为洗脱剂，产物为无色透明油状液体，m/z 682.44[M+H]+，为中间体6(1.04g， 1.53mmol)。
(3)、将上步制备的中间体6(2.26g，3.31mmol)超声悬浮于水(10ml)和甲醇(2.5ml)中，向体系中加入LiOH-H2O(835mg，19.88mmol)，室温搅拌，HPLC 监测反应进程。反应结束后，EA萃取，取水相，水相中加入柠檬酸溶液，EA萃取，浓缩即得产物，产物为淡黄色固体，m/z 668.42[M+H]+，为中间体7(1.84g，2.76mmol)。
(4)、实施例2制备的中间体2(0.6g，0.44mmol)溶于无水DCM(2ml)中，体系中加入上述中间体7(294mg，0.44mmol)，EDCI(102mg，0.53mmol)，HOBt (72mg，0.53mmol)，N2保护条件下，室温反应，HPLC监测反应进程。反应结束后体系用EA萃取，有机相浓缩并进行柱层析，石油醚-乙酸乙酯(5:1)为洗脱剂，产物为白色固体(0.3g，0.15mmol)，m/z 2013.18[M+H]+。
将所得的白色固体(0.3g，0.15mmol)溶于DCM(1ml)中，加入TFA(171mg， 110ul，1.5mmol)，室温反应，HPLC监测反应进程，反应结束后，旋干体系，并在 MTBE中重结晶，过滤得到终产物化合物7：N-(([1,1’-联苯]-4-甲基)-[3-氨基十一烷酰]- 多粘菌素B，m/z1412.87[M+H]+。
本实施例的反应过程如下式所示。
实施例6、N-正壬基-[4-甲基苯磺酰]-多粘菌素B(化合物5)的合成
(1)、将(S)-2-氨基-4-((叔丁氧羰基)氨基)丁酸甲酯(1g，3.84mmol)溶于甲醇(10ml) 中，体系中加入壬醛(601mg，4.23mmol)，NaCNBH3(266mg，4.23mmol)，无水 ZnCl2(523mg，3.84mg)，体系在室温下搅拌过夜，HPLC监测反应进程。反应结束后，使用EA萃取体系，浓缩有机相并进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯(15:1) 为洗脱剂，得到白色固体产物，m/z 387.28[M+H]+，为中间体8(1.11g，2.88mmol)。
(2)、上步的中间体8(1.11g，2.88mmol)溶于无水DCM(5ml)中，体系中加入对甲苯磺酰氯(604mg，3.17mmol)和三乙胺(437mg，4.32mmol)，室温反应， HPLC监测反应进程。反应结束后体系用EA萃取，有机相浓缩并进行柱层析，石油醚-乙酸乙酯(10:1)为洗脱剂，产物为无色透明油状液体，m/z 541.29[M+H]+，为中间体9(987mg，1.82mmol)。
(3)、将上一步的中间体9(987mg，1.82mmol)超声悬浮于水(10ml)和甲醇 (2.5ml)中，向体系中加入LiOH-H2O(458mg，10.92mmol)，室温搅拌，HPLC监测反应进程。反应结束后，EA萃取，取水相，水相中加入柠檬酸溶液，EA萃取，浓缩即得产物，产物为淡黄色固体，m/z 527.27[M+H]+，为中间体10(910mg， 1.73mmol)。
(4)、将中间体10(1.16g，2.2mmol)溶于无水DCM(2ml)中，体系中加入实施例2制备的中间体2(0.6g，0.44mmol)，HATU(837mg，2.2mmol)，DIPEA(284mg， 2.2mmol)，N2保护条件下，室温反应，HPLC监测反应进程。反应结束后体系用EA 萃取，有机相浓缩并进行柱层析，石油醚-乙酸乙酯(5:1)为洗脱剂，产物为白色固体。将所得的白色固体溶于DCM(1ml)中，加入TFA(0.15ml)，室温反应，HPLC 监测反应进程，反应结束后，旋干体系，并在MTBE中重结晶，过滤得到终产物， m/z 1343.78[M+H]+。获得化合物5：N-正壬基-[4-甲基苯磺酰]-多粘菌素B。
本实施例的反应过程如下式所示。
实施例7、N-苄基-N’-正辛基多粘菌素E(化合物8)的合成
(1)、将(S)-酪氨酸甲甲酯(5g，22.4mmol)溶于甲醇(20ml)中，体系中加入苯甲醛(2.6g，24.6mmol)，NaCNBH3(1.55g，24.6mmol)，无水ZnCl2(3.05g， 22.4mmol)，体系在室温下搅拌过夜，HPLC监测反应进程。反应结束后，使用EA 萃取体系，浓缩有机相并进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯(15:1)为洗脱剂，得到白色固体产物，m/z 314.13[M+H]+，为中间体11(5.12g，16.4mmol)。
(2)、上步中间体11(5.12g，16.4mmol)溶于无水甲醇(10ml)中，体系中加入正辛醛(2.3g，18mmol)，NaCNBH3(1.13g，18mmol)，无水ZnCl2(2.24g，16.4mmol)，体系在室温下搅拌过夜，HPLC监测反应进程。反应结束后，使用EA萃取体系，浓缩有机相并进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯(15:1)为洗脱剂，得到白色固体产物，m/z 426.26[M+H]+，为中间体12(4.6g，10.8mmol)。
(3)、将上一步中间体12(4.6g，10.8mmol)超声悬浮于水(20ml)和甲醇(5ml) 中，向体系中加入LiOH-H2O(1.36g，32.4mmol)，室温搅拌，HPLC监测反应进程。反应结束后，EA萃取，取水相，水相中加入柠檬酸溶液，EA萃取，浓缩即得产物，产物为淡黄色固体，m/z412.24[M+H]+，为中间体13。
(4)、将中间体13(905mg，2.2mmol)溶于无水DCM(2ml)中，体系中加入实施例4制备的中间体4(0.6g，0.44mmol)，HATU(837mg，2.2mmol)，DIPEA(284mg， 2.2mmol)，N2保护条件下，室温反应，HPLC监测反应进程。反应结束后体系用EA 萃取，有机相浓缩并进行柱层析，石油醚-乙酸乙酯(5:1)为洗脱剂，产物为白色固体。将所得的白色固体溶于DCM(1ml)中，加入TFA(0.15ml)，室温反应，HPLC 监测反应进程，反应结束后，旋干体系，并在MTBE中重结晶，过滤得到终产物， m/z 1294.82[M+H]+。获得化合物8：N-苄基-N’-正辛基多粘菌素E。
本实施例的反应过程如下式所示。
实施例8、N-(正辛基)-[2-氯苯氨酰]-多粘菌素E(化合物1)的合成
(1)、将(S)-天冬酰胺酸甲酯(5g，28.7mmol)溶于甲醇(20ml)中，体系中加入辛醛(4.05g，31.6mmol)，NaCNBH3(2.0g，31.6mmol)，无水ZnCl2(3.9g，28.7mmol)，体系在室温下搅拌过夜，HPLC监测反应进程。反应结束后，使用EA萃取体系，浓缩有机相并进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯(15:1)为洗脱剂，得到白色固体产物，m/z 287.19[M+H]+，为中间体14(4.1g，14.4mmol)。
(2)、将邻氯苯胺(3g，23.6mmol)溶于干燥的DCM(50ml)中，体系中加入 DIPEA(6.1g，47.2mmol)，并与条件下将三光气(2.33g，7.87mmol)的二氯甲烷(10ml) 溶液慢慢加入体系中，加毕，冰浴条件下继续反应3h，然后将上步的中间体14(6.75g，23.6mmol)的二氯甲烷溶液(5ml)加入体系中，室温反应过夜。次日，HPLC监测反应完全，将体系中的溶剂旋干，体系用EA/H2O萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，再用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩有机相得到中间体15的粗品，将粗品进行硅胶柱层析，得到呈白色粉末的中间体15(8.19g，18.6mmol)，m/z 440.19[M+H]+。
(3)、将上一步的中间体15(5g，11.38mmol)超声悬浮于水(10ml)和甲醇(2.5ml)中，向体系中加入LiOH-H2O(1.43g，34.15mmol)，室温搅拌，HPLC监测反应进程。反应结束后，EA萃取，取水相，水相中加入柠檬酸溶液，EA萃取，浓缩即得产物，产物为淡黄色固体，m/z 426.17[M+H]+，为中间体16(4.35g，10.24mmol)。
(4)、将中间体16(935mg，2.2mmol)溶于无水DCM(2ml)中，体系中加入中间体4(0.585g，0.44mmol)，HATU(837mg，2.2mmol)，DIPEA(284mg，2.2mmol)， N2保护条件下，室温反应，HPLC监测反应进程。反应结束后体系用EA萃取，有机相浓缩并进行柱层析，石油醚-乙酸乙酯(5:1)为洗脱剂，产物为白色固体。将所得的白色固体溶于DCM(1ml)中，加入TFA(0.2ml)，室温反应，HPLC监测反应进程，反应结束后，旋干体系，并在MTBE中重结晶，过滤得到终产物，m/z 1308.75[M+H]+。获得化合物1：N-(正辛基)-[2-氯苯氨酰]-多粘菌素E。
本实施例的反应过程如下式所示。
实施例9、N-(正辛基)-(Boc)4-PME的合成
将中间体4—四-(Boc)多粘菌素E九肽(0.585g，0.44mmol)溶于甲醇(5ml)中，体系中加入正辛醛(68mg，0.53mmol)，NaCNBH3(33mg，0.53mmol)，无水ZnCl2 (60mg，0.44mmol)，体系在室温下搅拌过夜，HPLC监测反应进程。反应结束后，使用EA萃取体系，浓缩有机相并进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯(15:1)为洗脱剂，得到白色固体产物中间体17，m/z1441.92[M+H]+，为N-(正辛基)-(Boc)4-PME。
本实施例的反应过程如下式所示。
实施例10、N-(正辛基)-[N,N-二甲基苯氨酰]-多粘菌素E(化合物18)的合成
将4-(二甲基氨基)苯胺(136mg，1mmol)溶于干燥的DCM(5ml)中，体系中加入DIPEA(260mg，2mmol)，并与条件下将三光气(99mg，0.33mmol)的二氯甲烷(1ml)溶液慢慢加入体系中，加毕，冰浴条件下继续反应3h，然后将中间体17 (1.44g，1mmol)的二氯甲烷溶液(5ml)加入体系中，室温反应过夜。次日，HPLC 监测反应完全，将体系中的溶剂旋干，体系用EA/H2O萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，再用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩有机相得到中间体18的粗品，将粗品进行硅胶柱层析，得到呈白色粉末的中间体18(1.04g，0.65mmol)，m/z1604.00[M+H]+。将上步骤得到的中间体18溶于适量DCM(5ml)中，加入TFA(0.5ml)，室温搅拌 2h，直接旋干体系，干燥，得到化合物18：N-(正辛基)-[N,N-二甲基苯氨酰]-多粘菌素E，m/z 1203.79[M+H]+。
本实施例的反应过程如下式所示。
实施例11、化合物12的合成
(1)、将中间体4(0.585g，0.44mmol)溶于甲醇(5ml)中，体系中加入2-吗啉乙醛(68mg，0.53mmol)，NaCNBH3(33mg，0.53mmol)，无水ZnCl2(60mg，0.44mmol)，体系在室温下搅拌过夜，HPLC监测反应进程。反应结束后，使用EA萃取体系，浓缩有机相并进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯(15:1)为洗脱剂，得到白色固体产物中间体19(380mg，0.26mmol)，m/z1442.88[M+H]+，为N-(2-吗啉乙基)-(Boc)4-PME。
(2)、将上一步中间体19(380mg，0.26mmol)溶于DCM(5ml)，向体系中加入N-Boc-苯丙氨酸(345mg，1.3mmol)，HATU(494mg，1.3mmol)，DIPEA(168mg， 1.3mmol)，室温反应过夜。次日，HPLC监测反应完全，将体系中的溶剂旋干，体系用EA/H2O萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，再用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩有机相得到中间体20的粗品，将粗品进行硅胶柱层析，得到呈白色粉末的中间体20 (264mg，0.156mmol)，m/z 1690.00[M+H]+。
(3)、将上步骤得到的中间体20溶于适量DCM(5ml)中，加入TFA(0.1ml)，室温搅拌2h，直接旋干体系，干燥，得到化合物12，m/z 1189.73[M+H]+。
本实施例的反应过程如下式所示。
实施例12、化合物15的合成
(1)、将实施例2制备的中间体2(0.6g，0.44mmol)溶于甲醇(5ml)中，体系中加入正癸醛(83mg，0.53mmol)，NaCNBH3(33mg，0.53mmol)，无水ZnCl2(60mg， 0.44mmol)，体系在室温下搅拌过夜，HPLC监测反应进程。反应结束后，使用EA 萃取体系，浓缩有机相并进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯(15:1)为洗脱剂，得到白色固体产物中间体21(463mg，0.31mmol)，m/z 1503.93[M+H]+。
(2)、将上一步中间体21溶于DCM(5ml)，向体系中加入溴化苄(64mg， 0.37mmol)，碳酸钾(86mg，0.62mmol)，体系在室温下搅拌过夜，HPLC监测反应进程。反应结束后，使用EA萃取体系，浓缩有机相并进行硅胶柱层析，用石油醚- 乙酸乙酯(15:1)为洗脱剂，得到白色固体产物中间体22(420mg，0.26mmol)，m/z 1593.98[M+H]+。
(3)、将上步骤得到的中间体22溶于适量DCM(5ml)中，加入TFA(0.1ml)，室温搅拌2h，直接旋干体系，干燥，得到化合物15，m/z 1193.77[M+H]+。
本实施例的反应过程如下式所示。
实施例13、化合物21的合成
(1)、将实施例2制备的中间体2(0.6g，0.44mmol)溶于甲醇(5ml)中，体系中加入呋喃甲醛(51mg，0.53mmol)，NaCNBH3(33mg，0.53mmol)，无水ZnCl2 (60mg，0.44mmol)，体系在室温下搅拌过夜，HPLC监测反应进程。反应结束后，使用EA萃取体系，浓缩有机相并进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯(15:1)为洗脱剂，得到白色固体产物中间体23(476mg，0.33mmol)，m/z 1443.80[M+H]+。
(2)、将上一步中间体23溶于DCM(5ml)，向体系中加入辛磺酰氯(84mg， 0.4mmol)，碳酸钾(91mg，0.66mmol)，体系在室温下搅拌过夜。次日，HPLC监测反应完全，将体系中的溶剂旋干，体系用EA/H2O萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，再用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩有机相得到中间体24的粗品，将粗品进行硅胶柱层析，得到呈白色粉末的中间体24(374mg，0.23mmol)，m/z 1619.89[M+H]+。
(3)、将上步骤得到的中间体24溶于适量DCM(5ml)中，加入TFA(0.1ml)，室温搅拌2h，直接旋干体系，干燥，得到化合物21，m/z 1219.68[M+H]+。
本实施例的反应过程如下式所示。
实施例14、化合物22的制备
(1)、(S)-缬氨酸甲酯盐酸盐(5g,30.0mmol)溶于甲醇(10ml)中，体系中加入辛醛(5.55ml,35.1mmol)，NaCNBH3(2.75g,35.1mmol)，体系在室温下搅拌过夜，HPLC监测反应进程。反应结束后，使用EA萃取体系，浓缩有机相并进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯(30:1)为洗脱剂，得到无色粘稠液体，m/z 244.32[M+H]+，为中间体 25(2.7g,11.09mmol)。
(2)、将中间体25((2.5g,10.27mmol))溶于DCM(10ml)中，将邻氯苯加酰氯(2.2g,12.57mmol)溶于体系中，体系中加入碳酸钾(1.5g,10.85mmol)，室温反应过夜。次日，HPLC检测反应完全，将体系中的溶剂旋干，体系用EA/H2O萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，再用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩有机相得到中间体26的粗品，将粗品进行硅胶柱层析，得到呈白色粉末的中间体26(2.3g,6.27mmol)，m/z 382.21 [M+H]+
(3)、将上一步中间体26(2.3g,6.27mmol)超声悬浮于水(5ml)和甲醇(5ml)中，向体系中加入LiOH-H2O(1.5g，37.6mmol)，室温搅拌，HPLC监测反应进程。反应结束后，EA萃取，取水相，水相中加入柠檬酸溶液，EA萃取，浓缩即得产物，产物为淡黄色固体，m/z368.19[M+H]+，为中间体27(2.0g,5.44mmol)。
(4)、上步的中间体27(86mg,0.226mmol)溶于无水DCM(2ml)中，体系中加入中间体4(100mg，0.075mmol)，PYBOP(118mg,0.226mmol)，DIPEA(40ul,0.226mmol)， N2保护条件下，室温反应，HPLC监测反应进程。反应结束后体系用EA萃取，有机相浓缩并进行柱层析，石油醚-乙酸乙酯(7：1)为洗脱剂，产物为白色固体，即为中间体28。将所得的中间体28溶于DCM(1ml)中，加入TFA(0.2ml)，室温反应，HPLC 监测反应进程，反应结束后，旋干体系，C18柱层析获得白色固体粉末，m/z 1278.76[M+H]+，即为化合物22。
本实施例的反应过程如下式所示。
实施例15、化合物23的制备
(1)、将癸酸(4.62g，27.24mmol)溶于DCM(10ml)中，将EDCI(5.22g， 27.24mmol)、HOBt(3.69g，27.24mmol)加入体系中，室温搅拌0.5h，将对氨基苯甲醛(3g，24.75mmol)加入到体系中，室温搅拌过夜，HPLC监测反应进程。反应结束后，使用EA萃取体系，浓缩有机相并进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯(20:1) 为洗脱剂，得到无色粘稠液体，m/z 276.19[M+H]+，为中间体29(1.45g,5.27mmol)。
(2)、(S)-缬氨酸甲酯盐酸盐(100mg,0.825mmol)溶于甲醇(2ml)中，体系中加入中间体29(250mg,0.908mmol)，NaCNBH3(56mg,0.908mmol)，体系在室温下搅拌过夜，HPLC监测反应进程。反应结束后，使用EA萃取体系，浓缩有机相并进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯(5:1)为洗脱剂，得到无色粘稠液体，m/z 391.29[M+H]+，为中间体30(285mg,0.73mmol)。
(3)、将上一步的中间体30((830mg,2.13mmol))溶于丙酮(20ml)中，将癸酰氯(526mg,2.77mmol)溶于体系中，体系中加入碳酸钾(588mg,4.26mmol)，室温反应过夜。次日，HPLC检测反应完全，将体系中的溶剂旋干，体系用EA/H2O萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，再用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩有机相得到中间体31的粗品，将粗品进行硅胶柱层析，得到呈白色粉末的中间体31(1.09g,2.0mmol)，m/z 545.42[M+H]+
(4)、将上一步中间体31(0.68g,1.25mmol)超声悬浮于水(5ml)和甲醇(5ml)中，向体系中加入LiOH-H2O(0.157g，3.75mmol)，室温搅拌，HPLC监测反应进程。反应结束后，EA萃取，取水相，水相中加入柠檬酸溶液，EA萃取，浓缩即得产物，产物为白色固体，m/z 531.41[M+H]+，为中间体32(0.2g,0.377mmol)。
(5)、将上一步的中间体32(40mg,0.077mmol)溶于无水DCM(2ml)中，体系中加入实施例4制备的中间体4(34mg，0.025mmol)，PYBOP(40mg,0.077mmol)， DIPEA(14ul,0.077mmol)，N2保护条件下，室温反应，HPLC监测反应进程。反应结束后体系用EA萃取，有机相浓缩并进行柱层析，石油醚-乙酸乙酯(5.5：1)为洗脱剂，产物为白色固体，即为中间体33。将所得的中间体33溶于DCM(1ml)中，加入 TFA(0.2ml)，室温反应，HPLC监测反应进程，反应结束后，旋干体系，C18柱层析获得白色固体粉末，m/z 1441.98[M+H]+，即为化合物23。
本实施例的反应过程如下式所示。
实施例16、化合物24的制备
(1)、将β-氨基丙酸甲酯盐酸盐(100mg，0.716mmol)溶于DCM(2ml)中，体系中加入三乙胺(217mg，2.148mmol)并进行冰浴，将联氯苯甲酰氯(171mg， 0.788mmol)加入到体系中，室温反应过夜，HPLC监测反应进程。反应结束后，体系旋干，在MeOH中打浆，得到白色固体，m/z 284.12[M+H]+，为中间体34(0.14g, 0.5mmol)。
(2)、将上一步的中间体34(0.1g，0.36mmol)悬浮于MeOH(5ml)和水(5ml) 中，加入LiOH·H2O(91mg，2.16mmol)，70℃加热3h，HPLC监测反应进程。反应结束后，体系中加入盐酸酸化，出现大量白色固体，m/z 270.11[M+H]+，即为中间体 35(81mg，0.3mmol)。
(3)、N’-叔丁氧羰基-L-2,4-二氨基丁酸甲酯盐酸盐(1g,3.72mmol)溶于甲醇(10ml) 中，体系中加入辛醛(570mg,4.47mmol)，NaCNBH3(890mg,11.6mmol)，体系在室温下搅拌过夜，HPLC监测反应进程。反应结束后，使用EA萃取体系，浓缩有机相并进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯(3:1)为洗脱剂，得到无色液体，m/z 345.27 [M+H]+，为中间体36(0.88g,2.56mmol)。
(4)、将中间体35(37mg，0.145mmol)加入到DMF中，将EDCI(31mg，0.16mmol)、 HOBt(22mg，0.16mmol)、三乙胺(44mg，0.435mmol)加入到体系中，室温搅拌 0.5h。将中间体36(50mg，0.145mmol)加入到体系中，室温搅拌，HPLC监测反应进程。当反应结束后，体系用EA/H2O萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，再用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩有机相得到中间体的粗品，将粗品进行硅胶柱层析，得到呈白色粉末的中间体37(0.488g,0.82mmol)，m/z596.36[M+H]+
(5)、将上一步的中间体37(0.2g,0.336mmol)超声悬浮于水(5ml)和甲醇(5ml)中，向体系中加入LiOH-H2O(42mg，1.0mmol)，室温搅拌，HPLC监测反应进程。反应结束后，EA萃取，取水相，水相中加入柠檬酸溶液酸化体系至pH＝2，EA萃取，浓缩即得产物，产物为淡黄色固体，m/z 582.35[M+H]+，为中间体38(174mg,0.3mmol)。
(6)、中间体38(38mg,0.086mmol)溶于无水DCM(2ml)中，体系中加入中间体4(50mg，0.027mmol)，PYBOP(70mg,0.135mmol)，DIPEA(28ul,0.162mmol)，N2保护条件下，室温反应，HPLC监测反应进程。反应结束后体系用EA萃取，有机相浓缩并进行柱层析，石油醚-乙酸乙酯(5：1)为洗脱剂，产物为白色固体，即为中间体39。将所得的中间体39溶于DCM(1ml)中，加入TFA(0.2ml)，室温反应，HPLC监测反应进程，反应结束后，旋干体系，C18柱层析获得白色固体粉末，m/z 1392.87[M+H]+，即为化合物24。
本实施例的反应过程如下式所示。
实施例17、化合物25的制备
(1)、将4-甲氧基联苯基-4-甲酸(1.0g，4.39mmol)DCM(10ml)中，体系中加入EDCI(924mg，4.82mmol)、HOBt(650mg，4.82mmol)、三乙胺(1.3g，13.13mmol)，室温搅拌0.5h。冰浴下将β-氨基丙酸甲酯盐酸盐(613mg，4.39mmol)加入到体系中，室温反应过夜，HPLC监测反应进程。反应结束后，体系用EA/H2O萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，再用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩有机相得到中间体的粗品，将粗品进行硅胶柱层析(PE：EA＝6:1)，得到白色固体，m/z 314.13[M+H]+，为中间体40(1.1g,3.5mmol)。
(2)、将中间体40(0.63g，2.01mmol)悬浮于MeOH(5ml)和水(5ml)中，加入LiOH·H2O(420mg，6.03mmol)，70℃加热3h，TLC监测反应进程。反应结束后，体系中加入盐酸酸化，出现大量白色固体，m/z 300.11[M+H]+，即为中间体41 (0.41g，1.37mmol)。
(3)、将中间体41(287mg，0.84mmol)加入到DMF中，将HATU(632mg，1.07mmol)、DIPEA(874mg，5.01mmol)加入到体系中，室温搅拌0.5h。将中间体 36(500mg，1.67mmol)加入到体系中，室温搅拌，HPLC监测反应进程。当反应结束后，体系用EA/H2O萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，再用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩有机相得到中间体的粗品，将粗品进行硅胶柱层析，得到呈白色粉末的中间体42(0.25g,0.4mmol)，m/z 626.37[M+H]+
(4)、将上一步中间体42(0.1g,0.16mmol)超声悬浮于水(5ml)和甲醇(5ml)中，向体系中加入LiOH-H2O(40mg，0.96mmol)，室温搅拌，HPLC监测反应进程。反应结束后，EA萃取，取水相，水相中加入柠檬酸溶液，EA萃取，浓缩即得产物，产物为淡黄色固体，m/z612.36[M+H]+，为中间体43(174mg,0.3mmol)。
(5)、中间体43(90mg,0.147mmol)溶于无水DCM(5ml)中，体系中加入中间体4(65mg，0.049mmol)，PYBOP(115mg,0.22mmol)，DIPEA(51ul,0.29mmol)，N2保护条件下，室温反应，HPLC监测反应进程。反应结束后体系用EA萃取，有机相浓缩并进行柱层析，石油醚-乙酸乙酯(5：1)为洗脱剂，产物为白色固体，即为中间体44。将所得的中间体44溶于DCM(1ml)中，加入TFA(0.2ml)，室温反应，HPLC监测反应进程，反应结束后，旋干体系，C18柱层析获得白色固体粉末，m/z 1422.88[M+H]+，即为化合物25。
本实施例的反应过程如下式所示。
实施例18、化合物26的制备
(1)、将β-氨基丙酸甲酯盐酸盐(200mg，2.245mmol)溶于DCM(5ml)中，体系中加入碳酸钾(465mg，3.368mmol)并进行冰浴，将邻氯苯甲酰氯(432mg， 2.47mmol)加入到体系中，室温反应过夜，HPLC监测反应进程。反应结束后，体系过滤，滤液旋干得到无色透明液体，m/z 242.05[M+H]+，为中间体46(0.482g,2.0mmol)。
(2)、将中间体46(0.25g，1.034mmol)悬浮于MeOH(5ml)和水(1ml)中，加入LiOH-·H2O(260mg，6.21mmol)，70℃加热3h，HPLC监测反应进程。反应结束后，体系中加入盐酸酸化，用EA-水萃取，有机相浓缩进行柱层析(DCM： MeOH＝20:1)，m/z 228.03[M+H]+，即为中间体47(204mg，0.9mmol)。
(3)、将中间体47(100mg，0.44mmol)加入到DCM中，将HATU(209mg， 0.55mmol)、DIPEA(213mg，1.65mmol)加入到体系中，室温搅拌0.5h。将中间体36(126mg，0.366mmol)加入到体系中，室温搅拌，HPLC监测反应进程。当反应结束后，体系用EA/H2O萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，再用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩有机相得到中间体的粗品，将粗品进行硅胶柱层析，得到呈白色粉末的中间体48(0.14g,0.25mmol)，m/z 554.29[M+H]+
(4)、将上一步中间体48(0.14g,0.253mmol)超声悬浮于水(5ml)和甲醇(1ml)中，向体系中加入LiOH-H2O(32mg，0.76mmol)，室温搅拌，HPLC监测反应进程。反应结束后，EA萃取，取水相，水相中加入柠檬酸溶液酸化体系至pH＝2，EA萃取，浓缩即得产物，产物为淡黄色固体，m/z 540.27[M+H]+，为中间体49(0.1g,0.185mmol)。
(5)、上一步的中间体49(40mg,0.072mmol)溶于无水DCM(2ml)中，体系中加入中间体4(64mg，0.048mmol)，PYBOP(50mg,0.096mmol)，DIPEA(25ul,0.144mmol)， N2保护条件下，室温反应，HPLC监测反应进程。反应结束后体系用EA萃取，有机相浓缩并进行柱层析，石油醚-乙酸乙酯(6：1)为洗脱剂，产物为白色固体，即为中间体50。将所得的中间体50溶于DCM(1ml)中，加入TFA(0.2ml)，室温反应，HPLC 监测反应进程，反应结束后，旋干体系，C18柱层析获得白色固体粉末，m/z 1350.80[M+H]+，即为化合物26。
本实施例的反应过程如下式所示。
实施例19、化合物的最小抑菌活性浓度的测定
对上述化合物进行体外抑菌活性测定，读取最低抑菌浓度值(MIC)，测定方法参考《中华人民共和国药典》(2015年版)中提供的方法。铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、克雷伯肺炎菌购自ATCC，以多黏菌素B和多黏菌素E为对照药，对比试验结果如表3所示。
表3化合物的MIC
由表3的对比试验结果可见，与多黏菌素E和多黏菌素B相比，所述示例性的化合物对于革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和克雷伯肺炎菌具有相当或改善的抑菌活性，能够应用于制备治疗细菌感染及革兰氏阴性菌感染的药物。
对化合物22-26进行MIC和MBC测定
(一)、实验材料
耐药受试菌(2株)：诱导耐药突变鲍曼不动杆菌：Ab-1，Ab-3(基于ATCC19606 的多粘菌素诱导耐药菌,参照文献方法获得：ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY,June2009,p.2298–2305)
敏感菌(2株)：铜绿假单胞菌HCCB20322(即ATCC 9029)，鲍曼不动杆菌：HCCB20325(复旦大学附属华山医院临床分离株，原始编号aba1604)
培养基：LB液体培养基(g/L)：胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，NaCl 10g， pH 7.4。
(二)、实验方法：
(1)、样品母液的制备
用分析天平精密称取5.12mg化合物样品于2mL无菌EP管中，加入无菌水1mL，获得浓度为5.12mg/mL的母液待用。
(2)、样品溶液(二倍稀释)的制备
取一无菌96孔板，将60μL 5.12mg/mL的母液加于第一孔中，第2-9孔加入30 μL无菌水。从第1孔取30μL加入第2孔，混匀。从第2孔取30μL加入第3 孔，混匀。依次重复至第9孔，取30μL丢弃，第10孔仅加入30μL的无菌水作为生长对照。由此，获得系列梯度浓度的待测样品溶液。
(3)、菌悬液的制备
分别取四种菌的甘油管接种于4mL LB培养基中，37℃振荡过夜培养，用新鲜 LB培养基，调整OD600＝0.4(约108CFU/mL)，再用LB将上述稳定期的菌悬液稀释10倍后(107CFU/mL)，然后以1％的接种量接种于LB培养基中，得到菌浓约105 CFU/mL的菌悬液。
(4)、MIC的测定与判读
取无菌96孔培养板，往各孔中加入按步骤(2)配制的、不同梯度浓度的样品溶液10μL，再分别加入90μL菌浓约105CFU/mL的四种菌的菌悬液，混匀后置37℃培养箱中，静置培养20h，判读结果。样品溶液的测试浓度分别为512、256、128、 64、32、16、8、4、2、1、0μg/mL，每个设5个重复。以培养20h后肉眼观察，菌体未生长的最低样品浓度即为MIC。
(5)、MBC的测定与判读
取一空白无菌培养板，每孔加入200uL LB液体培养基，然后吸取大于等于 1/2MIC浓度的MIC测定板孔中的菌悬液2uL(或者连续稀释100倍)，置于对应孔中，37℃培养箱中，静置培养20h，判读结果。菌体未生长的最低样品浓度即为 MBC。
(三)、实验结果
MIC和MBC的测定结果如表4所示。
表4、MIC和MBC的测定结果
由表4可知，与多粘菌素E相比，所述示例性的化合物22-26对于耐药受试菌 Ab-1、Ab-3，以及敏感菌：HCCB20322、HCCB 20325具有相当或改善的抑菌活性，能够应用于制备预防和治疗耐药性的细菌感染及耐药性的革兰氏阴性菌感染的药物。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
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