阅读说明：本技术 多粘菌素b相关化合物的环化制备方法 (Cyclization preparation method of polymyxin B related compound ) 是由 童巍 王洪飞 于 2020-04-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种多粘菌素B相关化合物的环化制备方法,本发明反应操作简单,后处理方便,收率高,对多粘菌素B的单一化合物B1、B1-I、B2、B3的合成有很高的参考价值。并且本发明通过对多粘菌素B各单一组成化合物的制备,对多粘菌素B进行效能科学评价、药理研究、药代动力学等提供了重要依据,便于其在人体内的代谢过程以及药物动力学进行更深入的研究,使其具有更好的药用前景。(The invention discloses a preparation method for the cyclization of polymyxin B related compounds, which has the advantages of simple reaction operation, convenient post-treatment and high yield, and has high reference value for the synthesis of single compounds B1, B1-I, B2 and B3 of polymyxin B. In addition, the invention provides important basis for carrying out scientific evaluation on the efficacy, pharmacological research, pharmacokinetics and the like of the polymyxin B by preparing each single component compound of the polymyxin B, facilitates the deeper research on the metabolic process and the pharmacokinetics of the polymyxin B in a human body and has better medicinal prospect.)

多粘菌素B相关化合物的环化制备方法

技术领域

本发明涉及一种多肽类抗生素的合成方法，具体涉及多粘菌素B相关化合物的环化制备方法。

技术背景

多粘菌素系由多粘芽胞杆菌(bacilluspolymyxa)产生的一组多肽类抗生素，英文名：Polymyxin，多粘菌素B主要组成为：B1、B1-I、B2、B3，其中以多粘菌素B1(C₅₆H₉₈N₁₆O₁₃)及B2(C₅₅H₉₆N₁₆O₁₃)居多，多粘菌素B1含量最多，一般达到50％以上。

多粘菌素B对革兰阴性杆菌，如大肠杆菌、绿脓杆菌、副大肠杆菌、肺炎克雷白杆菌、嗜酸杆菌、百日咳杆菌及痢疾杆菌等有抑制或杀菌作用。临床上主要用于敏感菌引起的感染及绿脓杆菌引起的泌尿系统感染、以及眼、气管、脑膜炎、败血症、烧伤感染以及皮肤粘膜感染等。

由于多粘菌素B稳定性较差，现有的多粘菌素B的合成方法是采用发酵的方法制备得到，而且得到的是均是混合物，很少有文献报道能得到单一的多粘菌素B。专利CN201110385129，CN201310506594中均报道用发酵的方法制备得到多粘菌素B，但得到的均是混合物，且产量较低，不适合规模化生成。

发明内容

发明目的：针对上述现有技术，本发明提供了一种多粘菌素B相关化合物的环化制备方法。

技术方案：本发明公开了多粘菌素B相关化合物B1、B1-I、B2、B3的环化制备方法。

其中，多粘菌素B相关化合物B1的环化制备方法，包括以下步骤：

(1)固相合成：

1)以CTC-Resin为固相载体，首先偶合Fmoc-Thr(tBu)-OH，得到 Fmoc-Thr(tBu)-Resin，脱去Fmoc保护得到H-Thr(tBu)-Resin；

2)由Fmoc-Dab(Boc)-OH与步骤1)得到的H-Thr(tBu)-Resin偶联，得到 Fmoc--Dab(Boc)-Thr(tBu)-Resin，然后依次缩合Fmoc-Dab(Boc)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-D-Phe-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH，Fmoc-Dab-OH， Fmoc-Dab(Boc)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH， Fmoc-Dab(Boc)-OH；

3)最后偶合S-6-甲基辛酸CH₃CH₂(CH₃)CH(CH₂)₄COOH，裂解除去树脂，得到片段一；

(2)液相缩合成环：将步骤(1)得到的片段一偶联得到片段二；

(3)将步骤(2)得到的片段二在三氟乙酸的作用下脱除侧链保护，纯化得到多粘菌素B相关化合物B1。

本发明所述多粘菌素B相关化合物B1-I的环化制备方法为：将上述B1制备方法步骤(1)步骤2)中的Fmoc-Leu-OH替换为Fmoc-Ile-OH。

本发明所述多粘菌素B相关化合物B2的环化制备方法为：将上述B1制备方法步骤(1)步骤3)中的CH₃CH₂(CH₃)CH(CH₂)₄COOH替换为 CH₃(CH₃)CH(CH₂)₄COCOOH。

本发明所述多粘菌素B相关化合物B3的环化制备方法为：将上述B1制备方法步骤(1)步骤3)中的CH₃CH₂(CH₃)CH(CH₂)₄COOH替换为 CH3(CH2)6COCOOH。

进一步的，上述制备方法步骤(1)中：

步骤1)固相载体偶联氨基酸的偶联剂为DIEA；

步骤2)偶联剂为DIC+A或DIEA+B，A为HOBT或HOAT,B为HBTU,HATU, PyBOP,TBTU；

步骤3)偶联剂为DIC+A或者B+A+C，其中A为HOBT或HOAT，B为 HBTU、HATU、TBTU或PyBOP，C为DIEA或NMM；

步骤3)裂解树脂所用试剂为体积比为1:1～1:4的三氟乙醇和二氯甲烷，优选体积比为1:2的三氟乙醇和二氯甲烷。裂解试剂的用量为按照CTC-Resin重量的10倍(w:v＝1:10)加入相应体积的量，除去树脂。

进一步的，上述制备方法步骤(2)中，成环溶剂为N，N-二甲基甲酰胺，偶联剂为DIC+A或DIEA+B，其中A为HOBT，B为HBTU，HATU，PyBop， TBTU。反应温度为20～30℃，反应时间为1～2小时。其中优选DIC+HOBT，其他缩合试剂不能使直链肽成环或产物较杂。缩合完成将反应液加入到50倍体积的水中析出，抽滤后用油泵旋干。

进一步的，上述制备方法步骤(3)中，裂解序列中的保护所用试剂为三氟乙酸、水和三异丙基硅烷溶液，其中，三氟乙酸的体积比为80％-90％，水的体积比为5％-10％，三异丙基硅烷的体积比为5％-10％。三氟乙酸、水、三异丙基硅烷的优选体积比为90:10:10。反应温度为10～20℃，反应时间为1～2小时。

步骤(3)反应完成后，旋蒸旋干，用10倍裂解试剂体积的乙醚沉淀，离心得到多粘菌素B相关化合物粗品。

步骤(3)提纯目标物采用色谱柱纯化：流动相A相：0.1％TFA水溶液，流动相B相：0.1％TFA乙腈溶液，梯度：15％-45％。

有益效果：本发明多粘菌素B相关化合物(B1、B1-I、B2、B3)的环化制备方法，首先通过固相合成片段一，最后通过HOBT+DIC液相中偶联条件成环。其中，用CTC树脂有效的降低固相树脂的成本，选择HOBT+DIC为最佳的偶联试剂，都有效的提高了收率，并降低了成本。并且本发明通过对多粘菌素B 各单一组成化合物的研究，可以对多粘菌素B在人体内的代谢过程以及药物动力学进行更深入的研究，使其具有更好的药用前景。

附图说明

图1为本发明所述的多粘菌素B相关化合物B1的合成流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。

本申请中所用试剂列表：

实施例1

多粘菌素B1的环化制备方法，合成流程如图1所示，具体包括以下步骤：

步骤一：

CH₃CH₂(CH₃)CH(CH₂)₄CO-Dab(Boc)-Thr(tBu)-Dab(Boc)-Dab-Dab(Boc)-D-Phe-Leu-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(tBu)-OH的合成：

1)将10g取代度0.4～0.6mmol/g的CTC-Resin加入多肽反应器中，加入2g Fmoc-Thr(tBu)-OH和10ml DIEA反应2小时后，抽去反应液，DMF洗涤两次；脱去Fmoc保护后，DMF洗涤两次，DCM洗涤一次，DMF洗涤两次；

2)然后依次Fmoc--Dab(Boc)-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH，Fmoc-Leu-OH， Fmoc-D-Phe-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH，Fmoc-Dab-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH， Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH, CH₃CH₂(CH₃)CH(CH₂)₄COOH，反应时间均为2小时，脱保护时间为0.5小时，反应终点以茚三酮法检测为准；反应结束后，DMF洗涤两次，DCM洗涤一次， DMF洗涤两次；

3)将洗涤后的树脂再用甲醇洗涤两次后，用200ml三氟乙醇/二氯甲烷脱除树脂2次，每次反应搅拌时间为2小时；滤去树脂，收集反应液，旋干得到6.8g CH₃CH₂(CH₃)CH(CH₂)₄CO-Dab(Boc)-Thr(tBu)-Dab(Boc)-Dab-Dab(Boc)-D-Phe-Le u-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(tBu)-OH。

步骤二：

CH₃CH₂(CH₃)CH(CH₂)₄CO-Dab(Boc)-Thr(tBu)-Dab(Boc)-Cyclo

(Dab-Dab(Boc)-D-Phe-Leu-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(tBu)-OH)的合成：将6.8gCH₃CH₂(CH₃)CH(CH₂)₄CO-Dab(Boc)-Thr(tBu)-Dab(Boc)-Dab-Dab(Boc)-D-Ph e-Leu-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(tBu)-OH溶解到20ml DMF溶液中去，加入0.5g HOBT和0.5ml DIC，室温搅拌反应2小时；将反应液倒入到200ml冰水中，磁子搅拌2小时，抽滤得到固体后，用50ml水淋洗2次，用油泵将滤饼抽干得到 5.4g白色固体。

步骤三：

CH₃CH₂(CH₃)CH(CH₂)₄CO-Dab-Thr-Dab-Cyclo

(Dab-Dab-D-Phe-Leu-Dab-Dab-Thr-OH)的合成：

CH3CH2(CH3)CH(CH2)4CO-Dab(Boc)-Thr(tBu)-Dab(Boc)-Cyclo

(Dab-Dab(Boc)-D-Phe-Leu-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(tBu)-OH)5.4g溶解到60mlTFA/H2O/TIS(8:1:1)溶液中，搅拌3小时，滴入到500ml冰乙醚溶液中，沉淀离心，乙醚洗涤三次，减压干燥，得到2.2g白色固体。

步骤四：

多粘菌素B1的提纯：

CH3CH2(CH3)CH(CH2)4CO-Dab-Thr-Dab-Cyclo

(Dab-Dab-D-Phe-Leu-Dab-Dab-Thr-OH)2.2g用10％乙腈和水溶解，过滤；

纯化设备：汉邦UV3000/NP7000，色谱柱:DAC-50,C18,10um，波长：220. 流动相A相：0.1％TFA水溶液，流动相B相：0.1％TFA乙腈溶液，梯度： 15％-45％，时间为60分钟，得到1.1g多粘菌素B1。

结构确认后确认序列为：

CH3CH2(CH3)CH(CH2)4CO-Dab-Thr-Dab-Cyclo

(Dab-Dab-D-Phe-Leu-Dab-Dab-Thr-OH)

实施例2

多粘菌素B1的环化制备方法，包括以下步骤：

步骤一：

CH3CH2(CH3)CH(CH2)4CO-Dab(Boc)-Thr(tBu)-Dab(Boc)-Dab-Dab(Boc)-D-Phe-Leu-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(tBu)-OH的合成：

1)将10g取代度为0.4～0.6mmol/g的CTC-Resin加入多肽反应器中，加入 2gFmoc-Thr(tBu)-OH和10ml DIEA反应2小时后，抽去反应液，DMF洗涤两次；脱去Fmoc保护后，DMF洗涤两次，DCM洗涤一次，DMF洗涤两次；

2)然后依次Fmoc--Dab(Boc)-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH，Fmoc-Leu-OH， Fmoc-D-Phe-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH，Fmoc-Dab-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH， Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH, CH3CH2(CH3)CH(CH2)4COOH，反应时间均为2小时，脱保护时间为0.5小时，反应终点以茚三酮法检测为准；反应结束后，DMF洗涤两次，DCM洗涤一次，DMF洗涤两次；

3)将洗涤后的树脂再用甲醇洗涤两次后，用200ml三氟乙醇/二氯甲烷脱除树脂2次，每次反应搅拌时间为2小时；滤去树脂，收集反应液，旋干得到6.8g CH3CH2(CH3)CH(CH2)4CO-Dab(Boc)-Thr(tBu)-Dab(Boc)-Dab-Dab(Boc)-D-Phe- Leu-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(tBu)-OH。

步骤二：

CH3CH2(CH3)CH(CH2)4CO-Dab(Boc)-Thr(tBu)-Dab(Boc)-Cyclo

(Dab-Dab(Boc)-D-Phe-Leu-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(tBu)-OH)的合成：将6.8gCH3CH2(CH3)CH(CH2)4CO-Dab(Boc)-Thr(tBu)-Dab(Boc)-Dab-Dab(Boc)-D-P he-Leu-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(tBu)-OH溶解到20ml DMF溶液中去，加入0.65g HBTU和0.5mlDIEA，室温搅拌反应2小时；将反应液倒入到200ml冰水中，磁子搅拌2小时，抽滤得到固体后，用50ml水淋洗2次，用油泵将滤饼抽干得到4.6g白色固体。

步骤三：

CH3CH2(CH3)CH(CH2)4CO-Dab-Thr-Dab-Cyclo

(Dab-Dab-D-Phe-Leu-Dab-Dab-Thr-OH)的合成：

CH3CH2(CH3)CH(CH2)4CO-Dab(Boc)-Thr(tBu)-Dab(Boc)-Cyclo

(Dab-Dab(Boc)-D-Phe-Leu-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(tBu)-OH)4.6g溶解到60mlTFA/H2O/TIS(8:1:1)溶液中，搅拌3小时，滴入到500ml冰乙醚溶液中，沉淀离心，乙醚洗涤三次，减压干燥，得到1.8g白色固体。(HPLC跟踪，主峰不明显，且杂峰较多)

步骤四：

多粘菌素B1的提纯：

CH3CH2(CH3)CH(CH2)4CO-Dab-Thr-Dab-Cyclo

(Dab-Dab-D-Phe-Leu-Dab-Dab-Thr-OH)2.2g用10％乙腈和水溶解，过滤；

纯化设备：汉邦UV3000/NP7000，色谱柱:DAC-50,C18,10um，波长：220. 流动相A相：0.1％TFA水溶液，流动相B相：0.1％TFA乙腈溶液，梯度： 15％-45％，时间为60分钟，得到0.3g多粘菌素B1。

结构确认后确认序列为：

CH3CH2(CH3)CH(CH2)4CO-Dab-Thr-Dab-Cyclo

(Dab-Dab-D-Phe-Leu-Dab-Dab-Thr-OH)

实施例3

多粘菌素B1的环化制备方法，包括以下步骤：

步骤一：

CH3CH2(CH3)CH(CH2)4CO-Dab(Boc)-Thr(tBu)-Dab(Boc)-Dab-Dab(Boc)-D-Phe-Leu-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(tBu)-OH的合成：

1)将10g取代度为0.4～0.6mmol/g的CTC-Resin加入多肽反应器中，加入 2gFmoc-Thr(tBu)-OH和10ml DIEA反应2小时后，抽去反应液，DMF洗涤两次；脱去Fmoc保护后，DMF洗涤两次，DCM洗涤一次，DMF洗涤两次

2)然后依次Fmoc--Dab(Boc)-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH，Fmoc-Leu-OH， Fmoc-D-Phe-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH，Fmoc-Dab-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH， Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH, CH3CH2(CH3)CH(CH2)4COOH，反应时间均为2小时，脱保护时间为0.5小时，反应终点以茚三酮法检测为准；反应结束后，DMF洗涤两次，DCM洗涤一次，DMF洗涤两次；

3)将洗涤后的树脂再用甲醇洗涤两次后，用200ml三氟乙醇/二氯甲烷脱除树脂2次，每次反应搅拌时间为2小时；滤去树脂，收集反应液，旋干得到6.8g CH3CH2(CH3)CH(CH2)4CO-Dab(Boc)-Thr(tBu)-Dab(Boc)-Dab-Dab(Boc)-D-Phe- Leu-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(tBu)-OH。

步骤二：

CH3CH2(CH3)CH(CH2)4CO-Dab(Boc)-Thr(tBu)-Dab(Boc)-Cyclo

(Dab-Dab(Boc)-D-Phe-Leu-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(tBu)-OH)的合成：将6.8gCH3CH2(CH3)CH(CH2)4CO-Dab(Boc)-Thr(tBu)-Dab(Boc)-Dab-Dab(Boc)-D-P he-Leu-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(tBu)-OH溶解到20ml DMF溶液中去，加入0.65g HBTU和0.5mlDIEA，室温搅拌反应2小时；将反应液倒入到200ml冰水中，磁子搅拌2小时，抽滤得到固体后，用50ml水淋洗2次，用油泵将滤饼抽干得到4.8g白色固体。

步骤三：

CH3CH2(CH3)CH(CH2)4CO-Dab-Thr-Dab-Cyclo

(Dab-Dab-D-Phe-Leu-Dab-Dab-Thr-OH)的合成：

CH3CH2(CH3)CH(CH2)4CO-Dab(Boc)-Thr(tBu)-Dab(Boc)-Cyclo

(Dab-Dab(Boc)-D-Phe-Leu-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(tBu)-OH)4.8g溶解到60mlTFA/H2O/TIS(8:1:1)溶液中，搅拌3小时，滴入到500ml冰乙醚溶液中，沉淀离心，乙醚洗涤三次，减压干燥，得到2.1g白色固体。(HPLC跟踪，主峰不明显，且杂峰较多)

步骤四：

多粘菌素B1的提纯：

CH3CH2(CH3)CH(CH2)4CO-Dab-Thr-Dab-Cyclo

(Dab-Dab-D-Phe-Leu-Dab-Dab-Thr-OH)2.2g用10％乙腈和水溶解，过滤；

纯化设备：汉邦UV3000/NP7000，色谱柱:DAC-50,C18,10um，波长：220. 流动相A相：0.1％TFA水溶液，流动相B相：0.1％TFA乙腈溶液，梯度： 15％-45％，时间为60分钟，得到0.2g多粘菌素B1。

结构确认后确认序列为：

CH3CH2(CH3)CH(CH2)4CO-Dab-Thr-Dab-Cyclo

(Dab-Dab-D-Phe-Leu-Dab-Dab-Thr-OH)

实施例4

多粘菌素B1-I的环化制备方法，包括以下步骤：

步骤一：

CH3CH2(CH3)CH(CH2)4CO-Dab(Boc)-Thr(tBu)-Dab(Boc)-Dab-Dab(Boc)-D-Phe-Ile-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(tBu)-OH的合成：

1)将10g取代度0.4～0.6mmol/g的CTC-Resin加入多肽反应器中，加入2g Fmoc-Thr(tBu)-OH和10ml DIEA反应2小时后，抽去反应液，DMF洗涤两次；脱去Fmoc保护后，DMF洗涤两次，DCM洗涤一次，DMF洗涤两次

2)然后依次Fmoc--Dab(Boc)-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH，Fmoc-Ile-OH， Fmoc-D-Phe-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH，Fmoc-Dab-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH， Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH, CH3CH2(CH3)CH(CH2)4COOH，反应时间均为2小时，脱保护时间为0.5小时，反应终点以茚三酮法检测为准；反应结束后，DMF洗涤两次，DCM洗涤一次，DMF洗涤两次；

3)将洗涤后的树脂再用甲醇洗涤两次后，用200ml三氟乙醇/二氯甲烷脱除树脂2次，每次反应搅拌时间为2小时；滤去树脂，收集反应液，旋干得到7.1g CH3CH2(CH3)CH(CH2)4CO-Dab(Boc)-Thr(tBu)-Dab(Boc)-Dab-Dab(Boc)-D-Phe-I le-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(tBu)-OH。

步骤二：

CH3CH2(CH3)CH(CH2)4CO-Dab(Boc)-Thr(tBu)-Dab(Boc)-Cyclo

(Dab-Dab(Boc)-D-Phe-Ile-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(tBu)-OH)的合成：将7.1gCH3CH2(CH3)CH(CH2)4CO-Dab(Boc)-Thr(tBu)-Dab(Boc)-Dab-Dab(Boc)-D-P he-Ile-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(tBu)-OH溶解到20ml DMF溶液中去，加入0.5g HOBT和0.5ml DIC，室温搅拌反应2小时；将反应液倒入到200ml冰水中，磁子搅拌2小时，抽滤得到固体后，用50ml水淋洗2次，用油泵将滤饼抽干得到 6.0g白色固体。

步骤三：

CH3CH2(CH3)CH(CH2)4CO-Dab-Thr-Dab-Cyclo

(Dab-Dab-D-Phe-Ile-Dab-Dab-Thr-OH)的合成：

CH3CH2(CH3)CH(CH2)4CO-Dab(Boc)-Thr(tBu)-Dab(Boc)-Cyclo

(Dab-Dab(Boc)-D-Phe-Leu-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(tBu)-OH)6.0g溶解到60mlTFA/H2O/TIS(8:1:1)溶液中，搅拌3小时，滴入到500ml冰乙醚溶液中，沉淀离心，乙醚洗涤三次，减压干燥，得到2.4g白色固体。

步骤四：

多粘菌素B1-I的提纯：

CH3CH2(CH3)CH(CH2)4CO-Dab-Thr-Dab-Cyclo

(Dab-Dab-D-Phe-Ile-Dab-Dab-Thr-OH)2.4g用10％乙腈和水溶解，过滤；

纯化设备：汉邦UV3000/NP7000，色谱柱:DAC-50,C18,10um，波长：220. 流动相A相：0.1％TFA水溶液，流动相B相：0.1％TFA乙腈溶液，梯度： 15％-45％，时间为60分钟，得到1.2g多粘菌素B1-I。z

结构确认后确认序列为：

CH3CH2(CH3)CH(CH2)4CO-Dab-Thr-Dab-Cyclo

(Dab-Dab-D-Phe-Ile-Dab-Dab-Thr-OH)

实施例5

多粘菌素B2的环化制备方法，包括以下步骤：

步骤一：

CH₃(CH₃)CH(CH₂)₄CO-Dab(Boc)-Thr(tBu)-Dab(Boc)-Dab-Dab(Boc)-D-Phe-Leu-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(tBu)-OH的合成：

1)将10g取代度0.4～0.6mmol/g的CTC-Resin加入多肽反应器中，加入2g Fmoc-Thr(tBu)-OH和10ml DIEA反应2小时后，抽去反应液，DMF洗涤两次；脱去Fmoc保护后，DMF洗涤两次，DCM洗涤一次，DMF洗涤两次

2)然后依次Fmoc--Dab(Boc)-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH，Fmoc-Leu-OH， Fmoc-D-Phe-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH，Fmoc-Dab-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH, CH₃(CH₃)CH(CH₂)₄COCOOH，反应时间均为2小时，脱保护时间为0.5小时，反应终点以茚三酮法检测为准；反应结束后，DMF洗涤两次，DCM洗涤一次，DMF洗涤两次；

3)将洗涤后的树脂再用甲醇洗涤两次后，用200ml三氟乙醇/二氯甲烷脱除树脂2次，每次反应搅拌时间为2小时；滤去树脂，收集反应液，旋干得到6.9g CH₃(CH₃)CH(CH₂)₄CO-Dab(Boc)-Thr(tBu)-Dab(Boc)-Dab-Dab(Boc)-D-Phe-Leu- Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(tBu)-OH。

步骤二：

CH₃(CH₃)CH(CH₂)₄CO-Dab(Boc)-Thr(tBu)-Dab(Boc)-Cyclo

(Dab-Dab(Boc)-D-Phe-Leu-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(tBu)-OH)的合成：将6.9gCH₃(CH₃)CH(CH₂)₄CO-Dab(Boc)-Thr(tBu)-Dab(Boc)-Dab-Dab(Boc)-D-Phe-Le u-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(tBu)-OH溶解到20ml DMF溶液中去，加入0.5g HOBT 和0.5ml DIC，室温搅拌反应2小时；将反应液倒入到200ml冰水中，磁子搅拌 2小时，抽滤得到固体后，用50ml水淋洗2次，用油泵将滤饼抽干得到6.1g白色固体。

步骤三：

CH₃(CH₃)CH(CH₂)₄CO-Dab-Thr-Dab-Cyclo

(Dab-Dab-D-Phe-Leu-Dab-Dab-Thr-OH)的合成：

CH₃(CH₃)CH(CH₂)₄CO-Dab(Boc)-Thr(tBu)-Dab(Boc)-Cyclo

(Dab-Dab(Boc)-D-Phe-Leu-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(tBu)-OH)6.1g溶解到60mlTFA/H2O/TIS(8:1:1)溶液中，搅拌3小时，滴入到500ml冰乙醚溶液中，沉淀离心，乙醚洗涤三次，减压干燥，得到2.3g白色固体。

步骤四：

多粘菌素B2的提纯：

CH₃(CH₃)CH(CH₂)₄CO-Dab-Thr-Dab-Cyclo

(Dab-Dab-D-Phe-Leu-Dab-Dab-Thr-OH)2.4g用10％乙腈和水溶解，过滤；

纯化设备：汉邦UV3000/NP7000，色谱柱:DAC-50,C18,10um，波长：220. 流动相A相：0.1％TFA水溶液，流动相B相：0.1％TFA乙腈溶液，梯度： 15％-45％，时间为60分钟，得到1.2g多粘菌素B2。

结构确认后确认序列为：

CH₃(CH₃)CH(CH₂)₄CO-Dab-Thr-Dab-Cyclo

(Dab-Dab-D-Phe-Leu-Dab-Dab-Thr-OH)

实施例6

多粘菌素B3的环化制备方法，包括以下步骤：

步骤一：

CH3(CH2)6CO-Dab(Boc)-Thr(tBu)-Dab(Boc)-Dab-Dab(Boc)-D-Phe-Leu-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(tBu)-OH的合成：

1)将10g取代度0.4～0.6mmol/g的CTC-Resin加入多肽反应器中，加入2g Fmoc-Thr(tBu)-OH和10ml DIEA反应2小时后，抽去反应液，DMF洗涤两次；脱去Fmoc保护后，DMF洗涤两次，DCM洗涤一次，DMF洗涤两次

2)然后依次Fmoc--Dab(Boc)-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH，Fmoc-Leu-OH， Fmoc-D-Phe-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH，Fmoc-Dab-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH， Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH，Fmoc-Dab(Boc)-OH, CH3(CH2)6COCOOH，反应时间均为2小时，脱保护时间为0.5小时，反应终点以茚三酮法检测为准；反应结束后，DMF洗涤两次，DCM洗涤一次，DMF洗涤两次；

3)将洗涤后的树脂再用甲醇洗涤两次后，用200ml三氟乙醇/二氯甲烷脱除树脂2次，每次反应搅拌时间为2小时；滤去树脂，收集反应液，旋干得到7.3g CH3(CH2)6CO-Dab(Boc)-Thr(tBu)-Dab(Boc)-Dab-Dab(Boc)-D-Phe-Leu-Dab(Boc)- Dab(Boc)-Thr(tBu)-OH。

步骤二：

CH3(CH2)6CO-Dab(Boc)-Thr(tBu)-Dab(Boc)-Cyclo

(Dab-Dab(Boc)-D-Phe-Leu-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(tBu)-OH)的合成：

将

7.3gCH3(CH2)6CO-Dab(Boc)-Thr(tBu)-Dab(Boc)-Dab-Dab(Boc)-D-Phe-Leu-Dab(B oc)-Dab(Boc)-Thr(tBu)-OH溶解到20ml DMF溶液中去，加入0.5g HOBT和0.5ml DIC，室温搅拌反应2小时；将反应液倒入到200ml冰水中，磁子搅拌2小时，抽滤得到固体后，用50ml水淋洗2次，用油泵将滤饼抽干得到6.2g白色固体。

步骤三：

CH3(CH2)6CO-Dab-Thr-Dab-Cyclo(Dab-Dab-D-Phe-Leu-Dab-Dab-Thr-OH) 的合成：

CH3(CH2)6CO-Dab(Boc)-Thr(tBu)-Dab(Boc)-Cyclo

(Dab-Dab(Boc)-D-Phe-Leu-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(tBu)-OH)6.2g溶解到60mlTFA/H2O/TIS(8:1:1)溶液中，搅拌3小时，滴入到500ml冰乙醚溶液中，沉淀离心，乙醚洗涤三次，减压干燥，得到2.3g白色固体。

步骤四：

多粘菌素B3的提纯：

CH3(CH2)6CO-Dab-Thr-Dab-Cyclo(Dab-Dab-D-Phe-Leu-Dab-Dab-Thr-OH)2.4g用10％乙腈和水溶解，过滤；

纯化设备：汉邦UV3000/NP7000，色谱柱:DAC-50,C18,10um，波长：220. 流动相A相：0.1％TFA水溶液，流动相B相：0.1％TFA乙腈溶液，梯度： 15％-45％，时间为60分钟，得到1.3g多粘菌素B3。

结构确认后确认序列为：

CH3(CH2)6CO-Dab-Thr-Dab-Cyclo(Dab-Dab-D-Phe-Leu-Dab-Dab-Thr-OH)。