一种多粘菌素b和粘菌素半抗原、人工抗原及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种多粘菌素b和粘菌素半抗原、人工抗原及其制备方法与应用 (Polymyxin B, colistin hapten and artificial antigen as well as preparation method and application thereof ) 是由 王战辉 温凯 沈建忠 余文博 于雪芝 江海洋 张英杰 唐盈盈 何敏 郝晨淇 于 2021-08-13 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物化学技术领域,具体公开了一种多粘菌素B和粘菌素半抗原、人工抗原及其制备方法与应用。本发明的多粘菌素B和粘菌素半抗原,其结构如式I所示：将由上述半抗原制备得到的多粘菌素B和粘菌素人工抗原免疫实验动物,可得到效价高,灵敏度高的多粘菌素B和粘菌素的抗体。本发明提供的多粘菌素B和粘菌素半抗原、人工抗原及其制备的抗体为建立快速、简便、价廉、灵敏、特异的多粘菌素B和粘菌素检测方法提供了新的物质材料基础。(The invention relates to the technical field of biochemistry, and particularly discloses polymyxin B, a colistin hapten, an artificial antigen, and a preparation method and application thereof. The structures of polymyxin B and colistin hapten of the invention are shown as formula I:)
技术领域
本发明涉及生物化学技术领域，具体地说，涉及一种多粘菌素B 和粘菌素(多粘菌素E)半抗原、人工抗原及其制备方法与应用。
背景技术
多黏菌素B(Polymyxin B,PMB)和粘菌素(colistin or Polymyxin E,PME)是从多黏芽孢杆菌培养液中获得的一类阳离子多肽类抗生素，自上世纪50年代始被应用于临床，但由于其肾毒性等毒副作用，上市20年后逐渐被其他更安全的抗菌药物取代。但是随着细菌耐药形势的严峻和新抗菌药物研发的迟滞，多黏菌素在消失了近30年后，于2000年左右又被临床重新启用，作为重症监控室用药，主要适用于多重耐药菌感染，被誉为多重耐药菌感染的最后一道防线。同时，多粘菌素B和粘菌素也广泛用于畜禽养殖活动中，用于抗菌和促生长。
但是长期以来，多粘菌素B和粘菌素的毒副作用也逐渐持续受到关注和重视。尤其是2016年多粘菌素耐药基因MCR-1被首次报道后，关于多粘菌素类药物的耐药性控制越来越被重视。GB31650-2019中明确规定了动物组织中粘菌素的残留限量，其中牛奶和羊奶残留限量为50μg/kg。因此需要对多粘菌素B和粘菌素进行快速有效的检测。
目前，多粘菌素B和粘菌素的检测手段主要为液相色谱(LC)、液质联用(LC-MS/MS)方法，但由于大型仪器价格高昂、操作性差、不易携带，难以实现生产一线的快速检测，严重制约了对于多粘菌素 B和粘菌素使用的有效监管。而基于抗原-抗体特异性反应的免疫分析技术，具有速度快、易操作、成本低的优点。因此开发一种简单、快捷、用于检测多粘菌素B和粘菌素的单克隆抗体显得尤为重要。
抗体是免疫检测的核心试剂，而半抗原和人工抗原的设计与合成又是其中的关键技术。目前，文献和专利报道的多粘菌素B和粘菌素均为原药结构直接偶联载体蛋白制备人工抗原，存在偶联位点不固定、制备抗体灵敏度不高以及交叉反应不均衡等问题，不能很好的用于多粘菌素B和粘菌素实际样品的检测。
发明内容
针对现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种可实现多粘菌素B和粘菌素的快速、灵敏、特异检测的多粘菌素B和粘菌素半抗原、人工抗原及其制备方法与应用，以及其单克隆抗体的制备和应用。
为了实现该目的，第一方面本发明提供一种多粘菌素B和粘菌素半抗原，其结构如式I所示：
本发明在半抗原设计中选择了药物的支链部分作为半抗原，同时 (利用多肽固相合成的方式)创造性地在多粘菌素B和粘菌素的支链多肽部分引入半胱氨酸，通过半胱氨酸和马来酰亚胺改造的载体蛋白发生特异性的点击化学反应，从而使偶联位点单一，半抗原在载体蛋白上展示的空间构象保持一致，最后得到了高效价和高亲和力的抗体。
第二方面，本发明提供上述多粘菌素B和粘菌素半抗原的制备方法，其包括：通过多肽固相合成方法依次将半胱氨酸、赖氨酸、苏氨酸、赖氨酸和6-甲基庚酸偶联的步骤。
作为一个
具体实施方式
，本发明提供式(I)所示半抗原的制备方法，包括如下步骤：
(1)首先将氨基和侧链保护的半胱氨酸树脂(FMOC-S-三丁基 -L-半胱氨酸4-苄氧苄酯树脂)在20％吡啶中，室温反应20min，脱去9-芴甲氧羰基(FMOC)保护的N-端氨基，茚三酮试剂测试显色；
(2)在偶联树脂中加入N,N-二异丙基乙胺(DIEA)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)和(S)-4-(BOC-氨基)-2-(FMOC-氨基)丁酸，室温反应1h，茚三酮试剂检测无色后，进行下一步操作；
(3)将以上偶联树脂在20％吡啶中，室温反应20min，脱去9- 芴甲氧羰基(FMOC)保护的N-端氨基，茚三酮试剂显示蓝色；
(4)在偶联树脂中加入DIEA、HBTU和FMOC-O-叔丁基-L- 苏氨酸，室温反应1h，茚三酮试剂检测无色后，进行下一步操作；
(5)将以上偶联树脂在20％吡啶中，室温反应20min，脱去9- 芴甲氧羰基(FMOC)保护的N-端氨基，茚三酮试剂显示蓝色；
(6)在偶联树脂中加入DIEA、HBTU和(S)-4-(BOC-氨基)-2-(FMOC-氨基)丁酸，室温反应1h，茚三酮试剂检测无色后，进行下一步操作；
(7)将以上偶联树脂在20％吡啶中，室温反应20min，脱去9- 芴甲氧羰基(FMOC)保护的N-端氨基，茚三酮试剂显示蓝色；
(8)在偶联树脂中加入DIEA、HBTU和6-甲基庚酸，室温反应1h，茚三酮试剂检测无色后，切割树脂，获得粗品肽；
(9)上述粗品肽经HPLC纯化后，真空冷冻干燥即获得式(I) 所示半抗原。
第三方面，本发明提供多粘菌素B和粘菌素人工抗原，其由上述多粘菌素B和粘菌素半抗原与载体蛋白偶联后得到；
其中，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛甲状腺球蛋白(BTG)、人血清白蛋白(HSA)，优选为牛血清白蛋白或卵清蛋白。
所述多粘菌素B和粘菌素人工抗原可以作为免疫原，亦可作为包被原。
本发明中，所述的多粘菌素B和粘菌素人工抗原中，所述多粘菌素B和粘菌素半抗原与载体蛋白的摩尔比为(8-9):1，优选为8.4:1。
第四方面，本发明提供上述多粘菌素B和粘菌素人工抗原的制备方法，首先采用活泼酯法将马来酰亚胺己酸偶联于所述载体蛋白的氨基上，然后采用活泼酯法将所述载体蛋白上的马来酰亚胺基团偶联于所述多粘菌素B和粘菌素半抗原的巯基上。
作为一个具体实施方式，本发明提供所述人工抗原的制备方法，包括如下步骤：
(1)将马来酰亚胺己酸、乙基二甲氨基碳化二亚胺(EDC)、 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合后溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF) 溶剂中，室温搅拌反应24h。所得马来酰亚胺NHS活化酯经柱层析纯化后旋转蒸发获得。
(2)将马来酰亚胺NHS活化酯用DMF溶解后，加入CB液溶解的载体蛋白中，室温搅拌反应24h。所得产物在10mM PBS中透析3天，每天换液3-4次。
(3)将式(I)所示的半抗原溶解后，逐滴加入马来酰亚胺偶联的载体蛋白溶液中，室温搅拌反应24h。所得产物在10mM PBS中透析3天，每天换液3-4次。
第五方面，本发明提供上述多粘菌素B和粘菌素半抗原或多粘菌素B和粘菌素人工抗原在以下任一方面的应用：
(1)在制备多粘菌素B和粘菌素特异性抗体中的应用；
(2)在检测多粘菌素B和粘菌素特异性抗体中的应用。
第六方面，本发明提供多粘菌素B和粘菌素特异性抗体，其以上述多粘菌素B和粘菌素人工抗原为免疫原，免疫动物制备得到；所述多粘菌素B和粘菌素特异性抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
优选地，所述人工抗原由所述多粘菌素B和粘菌素半抗原与牛血清白蛋白偶联得到。
本发明提供的单克隆抗体为广谱抗体，可以同时检测多粘菌素B 和粘菌素。
本发明还提供一种杂交瘤细胞，命名为抗多粘菌素B和粘菌素单克隆抗体杂交瘤细胞5B10。所述杂交瘤细胞5B10分泌的单克隆抗体也属于本发明的保护范围。
第七方面，本发明提供多粘菌素B和粘菌素特异性抗体在以下任一方面的应用：
(1)在检测多粘菌素B和粘菌素中的应用；
(2)在制备多粘菌素B和粘菌素的免疫层析试纸条中的应用；
(3)在制备多粘菌素B和粘菌素的ELISA试剂盒中的应用；
(4)在制备多粘菌素B和粘菌素的化学发光试剂盒中的应用。
第八方面，本发明提供一种检测试剂或检测试纸，其含有上述多粘菌素B和粘菌素特异性抗体。
第九方面，本发明提供一种试剂盒，其含有上述多粘菌素B和粘菌素特异性抗体。
本发明还提供基于所述单克隆抗体和包被原建立的快速、灵敏、广谱的多粘菌素B和粘菌素的免疫分析方法。
优选地，所述包被原由所述多粘菌素B和粘菌素半抗原与卵清蛋白偶联得到。
本发明的有益效果至少在于：
本发明首次公开了新的多粘菌素B和粘菌素半抗原、人工抗原及其制备方法，用所述多粘菌素B和粘菌素人工抗原免疫动物，可得到效价高、灵敏度高的特异性抗体。本发明提供的多粘菌素B和粘菌素半抗原、人工抗原及其制备的抗体，为建立快速、简便、价廉、灵敏、特异的多粘菌素B和粘菌素检测方法提供了新的物质材料。
本发明的多粘菌素B和粘菌素半抗原具有固定的偶联位点，制备出的人工抗原具有均一性好的优点，制备出的单克隆抗体具有效价高、灵敏度高的优点，可以用于多粘菌素B和粘菌素的快速检测方法的建立。本发明提供的多粘菌素B和粘菌素半抗原、人工抗原及其制备的抗体适用于血药浓度监测和兽药残留分析检测，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为式I所示多粘菌素B和粘菌素半抗原的质谱图。
图2为式I所示多粘菌素B和粘菌素免疫原的MALDI-TOF图。
图3为多粘菌素B和粘菌素抗体的标准曲线图。
图4为式II所示多粘菌素B和粘菌素免疫原的MALDI-TOF图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径 (常规生化试剂公司)得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中所用的PBS缓冲液均为pH7.4、0.01M的PBS缓冲液。实施例中所用的碳酸盐缓冲液均为pH 9.6、0.05mol/L的碳酸钠缓冲液。
NHS为N-羟基琥珀酰亚胺的缩写。EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐的缩写。N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐均购自sigma公司。牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum，BSA)购自sigma公司。卵清蛋白(Ovalbumin， OVA)购自sigma公司。弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均购自sigma 公司。
实施例1制备多粘菌素B和粘菌素半抗原
一、多粘菌素B和粘菌素半抗原的制备
1、式I所示多粘菌素B和粘菌素半抗原的制备
(1)首先将氨基和侧链保护的半胱氨酸树脂(FMOC-S-三丁基 -L-半胱氨酸4-苄氧苄酯树脂)在20％吡啶中，室温反应20min，脱去9-芴甲氧羰基(FMOC)保护的N-端氨基，茚三酮试剂测试显色；
(2)在偶联树脂中加入N,N-二异丙基乙胺(DIEA)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)和(S)-4-(BOC-氨基)-2-(FMOC-氨基)丁酸，室温反应1h，茚三酮试剂检测无色后，进行下一步操作；
(3)将以上偶联树脂在20％吡啶中，室温反应20min，脱去9- 芴甲氧羰基(FMOC)保护的N-端氨基，茚三酮试剂显示蓝色；
(4)在偶联树脂中加入DIEA、HBTU和FMOC-O-叔丁基-L- 苏氨酸，室温反应1h，茚三酮试剂检测无色后，进行下一步操作；
(5)将以上偶联树脂在20％吡啶中，室温反应20min，脱去9- 芴甲氧羰基(FMOC)保护的N-端氨基，茚三酮试剂显示蓝色；
(6)在偶联树脂中加入DIEA、HBTU和(S)-4-(BOC-氨基)-2-(FMOC-氨基)丁酸，室温反应1h，茚三酮试剂检测无色后，进行下一步操作；
(7)将以上偶联树脂在20％吡啶中，室温反应20min，脱去9- 芴甲氧羰基(FMOC)保护的N-端氨基，茚三酮试剂显示蓝色；
(8)在偶联树脂中加入DIEA、HBTU和6-甲基庚酸，室温反应1h，茚三酮试剂检测无色后，切割树脂，获得粗品肽；
(9)上述粗品肽经HPLC纯化后，真空冷冻干燥即获得式(I) 所示半抗原，命名为PMB-A。
二、多粘菌素B和粘菌素半抗原的表征
1、质谱鉴定
步骤一的式I所示多粘菌素B和粘菌素半抗原(分子式为: C23H44N6O7S)的质谱鉴定结果：MS m/z[M+H]+理论值：549.3；实测值：549.4，与目标产物的分子量相吻合，质谱图见图1。
实施例2多粘菌素B和粘菌素人工抗原的制备和表征
本实施例所述免疫原与包被原的制备方法中，其区别在于载体蛋白的使用类型，所述免疫原载体蛋白采用BSA，所述包被原载体蛋白采用OVA。
一、多粘菌素B和粘菌素免疫原的合成和鉴定
1、多粘菌素B和粘菌素免疫原的制备
(1)称取马来酰亚胺己酸200mg、EDC 272mg、NHS 163mg 混合后溶于2mL DMF溶剂中，室温，300r/min搅拌，反应24h。所得马来酰亚胺NHS活化酯经柱层析纯化后旋转蒸发获得。
(2)称取5.5mg马来酰亚胺NHS活化酯，500μL DMF溶解后，加入到5mL CB液溶解的20mg BSA蛋白中，室温，300r/min搅拌，反应24h。所得反应液在5L 10mM PBS中透析3天，每天换液3-4 次。
(3)称取9.8mg实施例1中制备的式(I)所示的半抗原，500μL DMF溶解后，逐滴加入马来酰亚胺偶联的BSA蛋白溶液中，室温， 300r/min搅拌，反应24h。所得反应液在10mM PBS中透析3天，每天换液3-4次。所得抗原命名为PMB-A-BSA。
2、多粘菌素B和粘菌素免疫原的鉴定
用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry， MALDI-TOF-MS)法测定PMB-A-BSA溶液中BSA与半抗原的结合比。结果见图2。
结合比＝{M(偶联物)－M(蛋白质)}/M(半抗原)
BSA的分子量为64963.3，式I半抗原的分子量为548.4，由质谱最高峰值分析偶联物的分子量为69577.6，经计算得出BSA与半抗原的结合比为8.4，即PMB-A-BSA中一个BSA分子上平均偶联8.4个半抗原。所得包被原命名为PMB-A-BSA。
二、多粘菌素B和粘菌素包被原的合成
1、多粘菌素B和粘菌素包被原的制备
用OVA代替BSA，其它同本实施例步骤一。所得免疫原命名为 PMB-A-OVA。
实施例3多粘菌素B和粘菌素单克隆抗体的制备
一、动物免疫
将实施例2制备的PMB-A-BSA溶液(浓度为2.3mg/mL)分别免疫6-8周龄的Balb/c雌鼠8只，每只小鼠单次免疫100μg，共免疫4次，每次间隔三周，免疫方式为颈背部皮下多点注射，融合前4 天进行一次额外的腹腔免疫。
二、细胞融合与克隆化
1、挑取抗血清性能最好的小鼠进行细胞融合实验。
2、腹腔免疫4天后，取脾细胞，按10:1(数量配比)比例与SP2/0 骨髓瘤细胞融合，采用icELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔和竞争孔。
3、利用有限稀释法对排名最好的细胞孔进行克隆化，得到可以分泌多粘菌素B和粘菌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将一株杂交瘤细胞株分别命名为抗多粘菌素B和粘菌素单克隆抗体杂交瘤细胞 5B10。
三、细胞冻存和复苏
用冻存液将杂交瘤细胞5B10制成1×106个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时，取出液氮中保存的冻存管，立即放入37℃水浴中解冻，离心去除冻存液后移入培养皿内培养。
四、单克隆抗体的制备与纯化
1、腹水制备
取12周龄的Balb/c小鼠4只，腹腔注射灭菌石蜡油(0.4mL/ 只)。7天后腹腔注射杂交瘤细胞5B10(5×105个/只)。7天后收集腹水。
2、抗体纯化
用Protein A免疫亲和柱法进行纯化，纯化后的抗体-20℃保存。
五、单克隆抗体的鉴定
将步骤四的2中得到的单克隆抗体溶液分别进行如下鉴定：
1、利用间接ELISA法测定单克隆抗体的效价
(1)用PMB-A-OVA作为包被原包被酶标板
采用实施例2制备的PMB-A-OVA溶液(用碳酸盐缓冲液稀释) 进行包被，稀释为系列浓度，每一浓度包被一行，100μL/孔。
(2)37℃孵育2h。
(3)加入100μL/孔封闭液，37℃孵育1h。洗板。
(4)每孔加入100μL系列浓度的单克隆抗体溶液(用PBS缓冲液进行稀释)。
(5)室温孵育30min，洗板。
(6)每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，室温孵育30min。洗板。
(7)加入100μL TMB显色液，避光显色15min。
(8)加入50μL 2mol/L硫酸中止反应；读OD450值。
判定结果：以OD450值为1.6时对应的抗体稀释度初步作为抗体的效价。
结果：采用间接ELISA法检测抗体的效价为1:160000。
3、单克隆抗体灵敏度的计算
(1)采用实施例2制备的PMB-A-OVA溶液(用碳酸盐缓冲液进行稀释，浓度为2.1mg/mL)进行包被，100μL/孔。
(2)37℃孵育2h。
(3)加入100μL/孔封闭液，37℃孵育1h。洗板。
(4)每孔加入50μL PMB或PME标准品溶液(由PMB或PME和 PBS缓冲液组成；PMB或PME的浓度分别为0ng/mL、0.3ng/mL、 0.9ng/mL、2.7ng/mL、8.1ng/mL、24.3ng/mL；将只加入PBS缓冲液的孔作为对照孔)，每个浓度设置3个复孔。
(5)每孔加入50μL单克隆抗体溶液(浓度为20ng/mL)。室温孵育30min，洗板。
(6)每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，30min，洗板。
(7)加入TMB显色液，避光显色15min。
(8)每孔加入50μL 2mol/L硫酸中止反应；读OD450值。
以－log10(标准品浓度)值为横坐标，以OD值为纵坐标，利用Origin 8.5的四参数方程进行拟合，建立标准曲线获得IC50值，如图3所示。单克隆抗体检测多粘菌素B的灵敏度(IC50值)为2.2 ng/mL，检测粘菌素的灵敏度(IC50值)为2.8ng/mL。
对比实验1
本对比实验先采用如下式II的半抗原进行抗原的制备。
式II所示半抗原为硫酸多粘菌素B，CAS号为1405-20-5，购自上海源叶生物技术有限公司。
其免疫原和包被原制备过程如下：
称取39.7mg式II所示的半抗原和50mg BSA或OVA，1mL超纯水溶解后，加入68μL5％的戊二醛溶液，室温，300r/min搅拌，反应 20min。所得反应液在10mM PBS中透析3天，每天换液3-4次。所得抗原命名为PMB-GA-BSA/OVA。
免疫原MALDI-TOF-MS鉴定结果如图4，经计算偶联比为：R＝ 10.5。
BSA的分子量为64963.3，式II半抗原的分子量为1169.5，由质谱最高峰值分析偶联物的分子量为77199.6，经计算得出BSA与半抗原的结合比为10.5。
以上述式II半抗原偶联所得免疫原PMB-GA-BSA溶液与实施例2 制备的式I半抗原所得免疫原PMB-A-BSA溶液(浓度为2.3mg/mL) 分别免疫6-8周龄的Balb/c雌鼠8只，每只小鼠单次免疫100μg，共免疫4次，每次间隔三周，免疫方式为颈背部皮下多点注射，第四次免疫后7天，小鼠尾静脉采血，以间接ELISA法检测血清效价和抑制效果。具体方法如下：
1、小鼠血清样本处理
分别采集小鼠尾静脉血清，8只小鼠采集到的小鼠血清混合收集到1.5mL EP管，4℃，1000r/min离心15min，取出上清液，即为小鼠多克隆抗体，PMB-GA-BSA和PMB-A-BSA免疫小鼠分别命名为 pAb-GA和pAb-A。
2、利用间接ELISA法测定多克隆抗体的效价
(1)用PMB-GA-OVA和PMB-A-OVA作为包被原包被酶标板，分别检测pAb-GA和pAb-A。
分别采用实施例2制备的PMB-A-OVA溶液(用碳酸盐缓冲液稀释)和上述制备的PMB-GA-OVA(用碳酸盐缓冲液稀释)进行包被，稀释为系列浓度，每一浓度包被一行，100μL/孔。
(2)37℃孵育2h。
(3)加入100μL/孔封闭液，37℃孵育1h。洗板。
(4)每孔加入100μL系列浓度的多克隆抗体溶液(用PBS缓冲液进行稀释)。
(5)室温孵育30min，洗板。
(6)每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，室温孵育30min。洗板。
(7)加入100μL TMB显色液，避光显色15min。
(8)加入50μL 2mol/L硫酸中止反应；读OD450值。
判定结果：以OD450值为1.6时对应的抗体稀释度初步作为抗体的效价。
结果：采用间接ELISA法检测多克隆抗体pAb-GA和pAb-A的效价分别为1:1000和1:20000。
3、多克隆抗体抑制效果检测
(1)采用上述PMB-GA-OVA和PMB-A-OVA溶液(用碳酸盐缓冲液进行稀释，终浓度为2μg/mL)进行包被，100μL/孔。
(2)37℃孵育2h。
(3)加入100μL/孔封闭液，37℃孵育1h。洗板。
(4)每孔加入50μL PMB或PME标准品溶液(由PMB或PME和 PBS缓冲液组成；PMB或PME的浓度分别为0ng/mL、3ng/mL、9 ng/mL、27ng/mL、81ng/mL、243ng/mL；将只加入PBS缓冲液的孔作为对照孔)，每个浓度设置3个复孔。
(5)每孔加入50μL多克隆抗体溶液。室温孵育30min，洗板。
(6)每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，30 min，洗板。
(7)加入TMB显色液，避光显色15min。
(8)每孔加入50μL 2mol/L硫酸中止反应；读OD450值。
以－log10(标准品浓度)值为横坐标，以OD值为纵坐标，利用Origin 8.5的四参数方程进行拟合，建立标准曲线获得IC50值。多克隆抗体pAb-GA检测多粘菌素的IC50值为95ng/mL，pAb-A检测多粘菌素的IC50值为21ng/mL。
由上述可知，式I半抗原所得免疫原所得抗血清抗体效价高于式II 半抗原偶联所得免疫原免疫抗血清20倍(20000:1000)，式I半抗原偶联所得免疫原免疫抗血清抗体IC50低于式II半抗原偶联所得免疫原免疫抗血清4.5倍(21ng/mL：95ng/mL)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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