一种抗痛风活性多肽rdp3及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种抗痛风活性多肽rdp3及其制备方法与应用 (Anti-gout active polypeptide RDP3, and preparation method and application thereof ) 是由 杨新旺 王滢 孙俊 刘乃心 唐璟 于 2020-05-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种抗痛风活性多肽RDP3及其制备方法与应用。所述的抗痛风活性多肽RDP3的氨基酸序列为AAAAMAGPK-NH2。本发明纯化得到的抗痛风活性多肽RDP3在氧嗪酸钾诱发的高尿酸血症动物模型实验中显示了较强的降尿酸活性,在单钠尿酸盐晶体诱发的痛风发作动物模型中表现出了较好的缓解能力,揭示本发明抗痛风活性多肽RDP3有潜在的应用前景。本发明所述的抗痛风活性多肽RDP3具有结构简单、抗痛风活性强的有益特点。(The invention discloses an anti-gout active polypeptide RDP3, and a preparation method and application thereof. The amino acid sequence of the anti-gout active polypeptide RDP3 is AAAAMAGPK-NH 2. The purified anti-gout active polypeptide RDP3 shows stronger uric acid reduction activity in hyperuricemia animal model experiments induced by potassium oxonate, shows better relieving capability in an animal model of gout attack induced by mono-sodiuurate crystals, and reveals that the anti-gout active polypeptide RDP3 has potential application prospect. The anti-gout active polypeptide RDP3 has the beneficial characteristics of simple structure and strong anti-gout activity.)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗痛风活性多肽RDP3及其制备方法与应用。
背景技术
随着经济发展以及中国人饮食结构的变化，痛风已从西方多发逐步演变为全球多发。2017年中国痛风报告***显示，中国痛风患者超过8000万人，痛风已成为中国仅次于糖尿病的第二大代谢类疾病。痛风因血液中尿酸堆积并结晶在关节或软组织中而发病，其疾病前期症状为高尿酸血症。痛风不仅会在其急性发作期诱发剧烈疼痛，影响人们生活质量，导致关节功能降低；并且在其隐匿期，即非发作期，持续的高尿酸还会提高心血管疾病乃至糖尿病的患病风险。
尿酸是人体中嘌呤代谢的最终产物，而高尿酸血症一般是由尿酸产生过多或排出过少引起。临床上控制尿酸的药物主要从两方面着手，一是通过抑制尿酸生成关键酶黄嘌呤氧化酶减少尿酸生成，而是通过抑制尿酸重吸收蛋白，即尿酸盐转运体（URAT1）而增加尿酸***。但临床上现有的抗痛风类药物基本上都是从单方面着手，或是在其隐匿期控制尿酸水平，或是在其发作期抑制炎症发生，具有双重作用的整体抗痛风药物的开发仍有大量空白。因此，急需探索或开发出不良反应少、经济实用的新型抗痛风药物。
为此，我们研发一种抗痛风的活性多肽，它既可以有效缓解痛风发作，又具有较高的降尿酸活性。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种抗痛风活性多肽RDP3；第二目的在于提供所述的抗痛风活性多肽RDP3的制备方法；第三目的在于提供所述的抗痛风活性多肽RDP3的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述的抗痛风活性多肽RDP3的氨基酸序列为AAAAMAGPK-NH2。
本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：
A、将大米用去离子水浸泡过夜，过滤后的上清液真空冷冻干燥后得到物料a于-80℃保存备用；
B、将物料a溶解于水中得到物料b，物料b用Tris-HCl缓冲液进行洗脱，收集洗脱液得到物料c；
C、将物料c进行第一次高效液相色谱反相层析得到物料d；
D、将物料d进行第二次高效液相色谱反相层析得到目标物抗痛风活性多肽RDP3。
本发明的第三目的是这样实现的，所述的抗痛风活性多肽RDP3在制备预防/治疗痛风药品中的应用。
本发明提供的抗痛风活性多肽RDP3，其制备方法可以通过生物化学分离纯化方法，由大米提取物中得到。上述方法制备的抗痛风活性多肽RDP3，可通过分离纯化及抗痛风活性进行鉴定。
本发明所述的抗痛风活性多肽RDP3的制备也可通过本领域常规的方法，采用化学合成或基因表达的方式得到，氨基酸序列与本发明SEQ ID NO: 1相同。
本发明纯化得到的抗痛风活性多肽RDP3在氧嗪酸钾诱发的高尿酸血症动物模型实验中显示了较强的降尿酸活性，在单钠尿酸盐晶体诱发的痛风发作动物模型中发现除了较好的缓解能力，揭示本发明抗痛风活性多肽RDP3有潜在的应用前景。本发明所述的抗痛风活性多肽RDP3具有结构简单、抗痛风活性强的有益特点。
附图说明
图1为本发明抗痛风多肽RDP3的Sephadex G50分子筛图；图中，箭头所指为RDP3吸收峰；
图2为本发明抗痛风活性多肽RDP3的HPLC反相C18柱层析图；图中，箭头所指为RDP3吸收峰；
图3 为本发明抗痛风活性多肽RDP3的第2次HPLC反相C18柱层析图；图中，箭头所指为RDP3吸收峰；
图4为本发明抗痛风活性多肽RDP3的降尿酸结果图；图中， ###/***代表P<0.001（t检验）；
图5为本发明抗痛风活性多肽RDP3给药后小鼠血清的黄嘌呤氧化酶活力图； 图中，###/***代表P<0.001（t检验）；
图6 为本发明抗痛风活性多肽RDP3给药后小鼠肝脏的黄嘌呤氧化酶活力图； 图中，**代表P<0.01, ###/***代表P<0.001（t检验）；
图7为本发明抗痛风活性多肽RDP3给药后小鼠肾脏的尿酸盐转运体（URAT1）活力图；图中， #/*代表P<0.05，**代表P<0.01（t检验）；
图8为本发明抗痛风活性多肽RDP3抗痛风发作的结果图。图中， ###/***代表P<0.001（t检验）；
图9为本发明抗痛风活性多肽RDP3的HE染色结果图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的抗痛风活性多肽RDP3的氨基酸序列为AAAAMAGPK-NH2。
本发明所述的抗痛风活性多肽RDP3的制备方法，包括以下步骤：
A、将大米用去离子水浸泡过夜，过滤后的上清液真空冷冻干燥后得到物料a于-80℃保存备用；
B、将物料a溶解于水中得到物料b，物料b用Tris-HCl缓冲液进行洗脱，收集洗脱液得到物料c；
C、将物料c进行第一次高效液相色谱反相层析得到物料d；
D、将物料d进行第二次高效液相色谱反相层析得到目标物抗痛风活性多肽RDP3。
B步骤中所述的水为去离子水。
B步骤中所述的洗脱是取物料b上预先用20 mmol/L的 Tris-HCl缓冲液平衡24 h的Sephadex G50柱子，然后用Tris-HCl缓冲液进行洗脱。
所述的洗脱的流速为3 ml/10min。
所述的Tris-HCl缓冲液pH值为7.8，含0.1 mol/L NaCl。
所述的第一次高效液相色谱反相层析是将物料c上样于预先用含0.1%三氟乙酸的超纯水平衡好的Hypersil ODS2 5mm柱子，在流速为0.5~1.5ml/min的条件下，用含0.1%三氟乙酸的乙腈在线性梯度条件下进行洗脱，检测波长为220 nm。
所述的第二次高效液相色谱反相层析是将物料d真空冷冻干燥后溶于去离子水，然后重复第一次高效液相色谱反相层析过程。
本发明所述的抗痛风活性多肽RDP3的应用为所述的抗痛风活性多肽RDP3在制备预防/治疗痛风药品中的应用。下面以具体实施案例对本发明做进一步说明。
实施例1
抗高尿酸血症活性多肽RDP3分离纯化和鉴定
1、分离纯化
大米用去离子水浸泡过夜，过滤后上清液真空冷冻干燥，-80°保存备用。将获得大米提取物冻干粉，溶解于去离子水中，取1 mL上预先用20 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH7.8，含0.1 mol/L NaCl）平衡24 h的Sephadex G50 (GE Healthcare，超细)柱子（长度40 cm，内径宽度1.5 cm），用同样的缓冲液进行洗脱，流速为3 mL/10 min，每10 min收集1次。检测每管吸光度，检测波长为280 nm，将图1箭头所指吸收峰下样品合并。
将所得样品上样于预先用超纯水（含0.1%的三氟乙酸）平衡好的Hypersil ODS25mm柱子（伊利特产品，尺寸为4.6 mm ×300 mm），实验仪器为Waters 1525高压液相系统，在流速为1 mL/min的条件下，用乙腈（含0.1%的三氟乙酸）在线性梯度（0~100%，100 min）条件下进行洗脱，监测波长为220 nm，所得的分离纯化图谱如图2所示：箭头所指峰为RDP3。收集图2箭头所指峰，真空冷冻干燥后溶于去离子水，然后重复第1次HPLC过程，所得的分离纯化图谱如图3所示，箭头所指为纯化的RDP3所在峰。
2、氨基酸序列的测定
为了确定氨基酸序列，用Denovo测序对样品进行了分析。将样品溶于25 mmol/LNH4HCO3中，在37℃下用二硫代苏糖醇还原1 h，用碘乙酰胺阻断30 min，然后将样品与α-氰基-4-羟基辛酸混合，并在同一设备上进行串联质谱分析。
结果显示，抗痛风活性多肽RDP3的氨基酸序列为AAAAMAGPK-NH2，同SEQ No.1所示。
实施例2
多肽RDP3的抗痛风活性测定
（1）血清尿酸含量测定
利用氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症动物模型检测多肽RDP3的降尿酸活性。选体重22~25g的SPF级昆明小鼠进行实验，将小鼠随机分成7组，每组6只，这7组分别为空白对照、模型组、别嘌醇组（阳性对照）、苯溴马隆组（阳性对照）以及3个RDP3处理组（1000、500、100 µg/kg）。空白对照每天灌胃给等量生理盐水，其余各组每天灌胃给氧嗪酸钾（300 mg/kg）和腺嘌呤（200 mg/kg）1h后，再分别腹腔给药：模型组给等量生理盐水，阳性对照组分别给10mg/kg 别嘌呤醇、8 mg/kg苯溴马隆， 3个RDP3处理组分别给1000、500、100 µg/kg RDP3，一共给药7天。第7天给药（生理盐水、别嘌呤醇、苯溴马隆、RDP3）结束1h后，给小鼠腹腔注射0.3%的戊巴比妥钠（0.1 mL/10 g）麻醉小鼠，然后于小鼠内眦静脉处取全血。将全血于室温下，6000 r/min，离心5 min后以获取血清。将部分小鼠血清使用试剂盒进行尿酸检测，结果如图4所示：阳性对照组和RDP3处理各组的血清尿酸含量明显低于模型组。其余血清以及小鼠肝脏使用试剂盒进行黄嘌呤氧化酶活力检测，结果如图5、6所示，别嘌醇组和RDP3处理组的黄嘌呤氧化酶的活力显著低于模型组。小鼠肾脏通过Western Blotting进行尿酸盐转运体（URAT1）含量检测，结果如图7所示，苯溴马隆组和RDP3处理组URAT1表达量明显低于模型组。
（2）缓解痛风发作活性测
首先获得单钠尿酸盐晶体。将800 mg尿酸与5 mL 1 M NaOH加入155 mL蒸馏水中煮沸溶解，调PH值至7.2。带室温放凉，将混合液置于4℃过夜，去上清，将下层晶体晾干碾碎，配制为20 mg/mL的单钠尿酸盐晶体悬液。
将SPF级昆明小鼠分为5组，每组6只，分别为模型组、双氯芬酸钠组（阳性对照）以及3个RDP3给药组（1000、500、100 μg/kg），每日同一时间通过腹腔注射给药，分别为模型组（生理盐水）、阳性对照组（双氯芬酸钠，12 mg/kg）、给药组（RDP3, 1000、500、100 μg/kg）。第3天给药后30 min，将制备好的单钠尿酸盐晶体悬液注射入小鼠左后足足跖部，50 μL/只。从注射当天起每天测量小鼠足跖部厚度，共测量3日。结果如图8所示，与模型组相比，双氯芬酸钠组和RDP3组显著缓解了单钠尿酸盐堆积诱发的足肿胀。
最后一次测量厚度后，取小鼠左后足跖部分固定于4 %甲醛中24~48 h，组织通过梯度乙醇脱水，二甲苯透明。使用石蜡包埋法，切片5 µm，进行HE染色。结果通过正置显微镜放大200倍观察。多肽RDP3缓解痛风急性发作的活性如图9所示：与模型组相比，双氯芬酸钠组以及RDP3组很好地缓解了足跖部疏松***的肿胀以及炎症细胞募集。
综上所述，本发明涉及抗痛风活性多肽RDP3具有结构简单、活性高、给药方式简单等有益特点。
SEQUENCE LISTING
<110> 昆明医科大学
<120> 一种抗痛风活性多肽RDP3及其制备方法与应用
<130> 2020
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 抗痛风活性多肽RDP3的氨基酸序列
<400> 1
Ala Ala Ala Ala Met Ala Gly Pro Lys Asn His
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