抑制眼部自身免疫性炎症反应的靶向生物肽的筛选及应用
阅读说明：本技术 抑制眼部自身免疫性炎症反应的靶向生物肽的筛选及应用 (Screening and application of targeting biological peptide for inhibiting ocular autoimmune inflammatory reaction ) 是由 成璐 许迅 李京敬 牛田 *** 于 2019-02-25 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种抑制眼部自身免疫性炎症反应的靶向生物肽及其应用。本发明还涉及所述多肽的制法和应用以及含所述多肽的药物组合物。本发明多肽具有多种优点,例如分子量小、生产成本低、水溶性好、免疫源性小、毒副作用低及组织穿透性强等优势；并且,本发明通过EAE及EAU两种模型的研究表明,该生物肽具有显著的免疫调节、抗炎及改善视功能的作用。(The invention provides a targeting biological peptide for inhibiting an autoimmune inflammatory reaction of eyes and application thereof. The invention also relates to a preparation method and application of the polypeptide and a pharmaceutical composition containing the polypeptide. The polypeptide has multiple advantages, such as small molecular weight, low production cost, good water solubility, small immunogenicity, low toxic and side effects, strong tissue penetrability and the like; in addition, the research of two models of EAE and EAU shows that the biological peptide has obvious functions of immunoregulation, anti-inflammation and visual function improvement.)
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地涉及一种抑制眼部自身免疫性炎症反应的靶向生物肽及其应用。
背景技术
随着卫生环境的改善，感染性疾病在眼部炎症性疾病中所占比例逐渐下降，自身免疫性眼病的发病率则逐年升高。
自身免疫性眼病既可以是眼部的原发疾病，如小柳-原田病、白点综合症等，但更常作为全身自身免疫疾病的眼部表现，如视神经脊髓炎(neuromyelitis optica,NMO)及多发性硬化(multiple sclerosis,MS)。眼部自免疫性疾病可累及包括眼表、内眼及眼附属器在内的多个部位，其中，以葡萄膜及视神经最易受累。
自身免疫性葡萄膜炎(Autoimmune uveitis,AU)及自身免疫性视神经炎(Autoimmune optic neuritis,AON)由于其反复发作的特性，可对后极部视网膜、脉络膜及视神经造成严重损伤，对视力威胁极大。流行病学研究表明，在世界范围内，葡萄膜炎致盲的患者占所有致盲患者的第三位，而视神经炎则是青年人群中致盲的首要原因。自身免疫性视神经炎，可以单独发作，也可以是中枢神经系统疾病或全身疾病的部分表现，其中NMO及MS相关性视神经炎是其重要的组成部分。无论是AU或是AON均对视力威胁极大，因此早期及时治疗对改善患者视力预后都极为重要，然而目前其治疗面临着一些难点。
糖皮质激素是临床上治疗自身免疫性葡萄膜炎及视神经炎的传统经典治疗手段，但其副作用仍是目前不容小觑的问题。
单独或联合应用免疫抑制剂也是自身免疫性葡萄膜炎及视神经炎的常用手段，既往及目前临床运用的免疫抑制剂主要包括抗细胞代谢类药物，如硫唑嘌呤、霉酚酸酯等；以及钙调磷酸酶抑制剂类药物，如环磷酰胺、他克莫司和环孢霉素等。但是，这些免疫抑制剂在全身或局局部应用时有不可避免的毒副作用。
随着对AU及AON的细胞和分子机制研究的不断深入，生物靶向药物开始被越来越多地应用到患者的治疗中。近年来，生物制剂通过实验室或临床研究被证实具有抑制免疫炎症反应的作用，并被用于治疗各种眼部自身免疫性疾病，以减少激素和免疫抑制剂的使用。
然而，这些新兴的靶向治疗药物多为生物大分子，在具体的应用中具有以下缺点：i)分子量大，体外合成方法复杂，存在制备过程中重组表达纯化工艺繁琐和内毒素残留等不足，生产成本较高；ii)抗原性强，容易诱发宿主的免疫反应，加重免疫紊乱；iii)容易因为蛋白构象以及修饰基团的改变而导致生物学活性的丧失；iv)由于眼球解剖结构的特殊性，这些大分子化合物往往难以通过血眼屏障及血视神经屏障，很多需要玻璃体内注射或鞘内注射使用，导致了临床上难以推广应用。
总的来说，目前在自身免疫性葡萄膜炎及视神经炎靶向治疗领域，仍缺少一种兼具疗效确切、毒性低、副作用小、性价比高等特点的治疗手段。因此，寻找具有特异生物学活性和生物相容性，并且靶点明确、毒副作用小、抗原性低的小分子药物，有希望透过各种血眼及血视神经组织屏障，提高眼局部的生物利用度，是治疗眼部自身免疫性葡萄炎和视神经炎的关键所在。
综上，本领域迫切需要开发一种具有特异的生物学活性和生物相容性、靶点明确、毒副作用小、抗原性低，并且有希望透过各种血眼及血视神经组织屏障、提高眼局部的生物利用度的小分子药物。
发明内容
本发明的目的就是提供一种具有特异的生物学活性和生物相容性、靶点明确、毒副作用小、抗原性低，并且有希望透过各种血眼及血视神经组织屏障、提高眼局部的生物利用度的小分子药物。
在本发明的第一方面，提供了一种如式I所示的多肽或其药学上可接受的盐，所述的多肽或其药学上可接受的盐具有抑制自身免疫性炎症的活性；
X0-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16(式I)
式中，
X0是无，或1-12个氨基酸的肽段；
X1是选自下组的氨基酸：Cys、Ser
X2是选自下组的氨基酸：Arg、Lys、Gln、Asn；
X3是选自下组的氨基酸：Asn、Gln、His、Lys、Arg；
X4是选自下组的氨基酸：Pro、Ala；
X5是选自下组的氨基酸：Arg、Lys、Gln、Asn；
X6是选自下组的氨基酸：Gly、Pro、Ala；
X7是选自下组的氨基酸：Glu、Asp；
X8是选自下组的氨基酸：Glu、Asp；
X9是选自下组的氨基酸：Gly、Pro、Ala；
X10是选自下组的氨基酸：Gly、Pro、Ala；
X11是选自下组的氨基酸：Pro、Ala；
X12是选自下组的氨基酸：Trp、Tyr、Phe；
X13是选自下组的氨基酸：Cys、Ser；
X14是选自下组的氨基酸：Phe、Leu、Val、Ile、Ala、Tyr；
X15是选自下组的氨基酸：Thr、Ser；
X16是无，或1-13个氨基酸的肽段。
在另一优选例中，所述多肽的总长度为≤80个氨基酸残基，较佳地为≤50个氨基酸残基，更佳地为≤35个氨基酸残基。
在另一优选例中，所述X0为衍生自SEQ ID NO:7的1-12个氨基酸的肽段。
在另一优选例中，1-12表示1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12。
在另一优选例中，1-13表示1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13。
在另一优选例中，所述X0为SEQ ID NO:7的第m位至第12位的肽段，其中m为选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12的正整数。
在另一优选例中，所述X16为衍生自SEQ ID NO:8的第1-13个氨基酸的肽段。
在另一优选例中，所述X16位SEQ ID NO:8的第1至第n位的肽段，其中n为选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13的正整数。
在另一优选例中，所述X0和X16为无。
在另一优选例中，所述多肽选自下组：
(a)具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6所示氨基酸序列的多肽，且所述的多肽的长度为15-35个氨基酸；
(b)将SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6所示氨基酸序列经过1-2个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制自身免疫性炎症功能的由(a)衍生的多肽。
在另一优选例中，所述多肽的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6。
在另一优选例中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码如本发明第一方面所述的多肽。
在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有如在本发明第二方面所述的多核苷酸。
在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如在本发明第三方面所述的载体或基因组中整合有如本发明第二方面所述的多核苷酸。
在本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括：
(a)如本发明第一方面所述的多肽或其药学上可接受的盐；和
(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
在另一优选例中，所述组分(a)占所述药物组合物总重量的0.1-99.9wt％,较佳地10-99.9wt％，更佳地70％-99.9wt％。
在另一优选例中，所述药物组合物为液态、固体、或半固体。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为口服剂型、注射剂、或外用药物剂型。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、或注射剂。
在另一优选例中，所述药物组合物为液态组合物。
在另一优选例中，所述药物组合物为口服制剂。
在另一优选例中，所述药学上可接受的载体选自下组：输液剂载体和/或注射剂载体，较佳地，所述的载体是选自下组的一种或多种载体：生理盐水、葡萄糖盐水、或其组合。
在另一优选例中，所述药学上可接受的载体可以是包括纳米材料的载体。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为眼药水、针剂(如眼周和眼内注射液)、眼用凝胶或眼药膏。
在另一优选例中，所述药物组合物为缓释剂型。
在另一优选例中，所述药物组合物在用于抑制自身免疫性炎症的应用中，可单独使用，或联合使用。
在另一优选例中，所述联合使用包括：与其它抑制自身免疫性炎症的药物联合使用。
在另一优选例中，所述其它抑制自身免疫性炎症的药物包括：糖皮质激素类药物、免疫抑制剂，或大分子生物靶向药物。
在另一优选例中，所述糖皮质激素类药物包括：甲强龙、***龙，或***。
在另一优选例中，所述其它抑制自身免疫性炎症的药物包括：抗代谢类药物、钙调磷酸酶抑制剂类药物、烷化剂、新型免疫抑制剂，或其组合。
在另一优选例中，所述抗代谢类药物包括：硫唑嘌呤、霉酚酸酯、甲氨喋呤、环磷酰胺，或其组合。
在另一优选例中，所述钙调磷酸酶抑制剂类药物包括：他克莫司、环孢霉素，或其组合。
在另一优选例中，所述烷化剂类药物包括：环磷酰胺、白消安，或其组合。
在另一优选例中，所述新型免疫抑制剂包括：雷帕霉素、FTY720，或其组合。
在另一优选例中，所述大分子生物靶向药物包括：TNF-α单克隆抗体、抗CD20单克隆抗体、抗VEGF单克隆抗体，或其组合。
在本发明的第六方面，提供了一种如本发明第一方面所述的多肽或其药学上可接受的盐的用途，用于制备一药物，所述药物用于抑制自身免疫性炎症。
在另一优选例中，所述自身免疫性炎症包括：眼部自身免疫性炎症、系统性红斑狼疮、自身免疫性关节炎、自身免疫性肠炎、自身免疫性脑神经炎、多发性硬化，或其组合。
在另一优选例中，所述眼部自身免疫性炎症包括：自身免疫性葡萄膜炎AU、自身免疫性视神经炎AON、视神经脊髓炎NMO、自身免疫性角膜结膜炎，或其组合。
在本发明的第七方面，提供了一种抑制哺乳动物自身免疫性炎症的方法，包括步骤：给需要的对象施用如本发明第一方面所述的多肽或其药学上可接受的盐。
在另一优选例中，所述的哺乳动物包括人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括：啮齿动物(如大鼠、小鼠)、灵长动物(如猴)。
在另一优选例中，所述自身免疫性炎症为眼部自身免疫性炎症。
在另一优选例中，所述施用包括眼内注射、滴眼液输入、球后注射、球旁注射、结膜下注射或静脉注射。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了膜锚定配体-受体酵母双杂交系统。其中，(A)显示了分别构建含有备选肽(Peptide)与c-Met编码序列的质粒，将其转入两种不同酵母菌株中的示意图。(B)显示了膜锚定配体-受体酵母双杂交系统的工作原理。将两种酵母菌株杂交后，备选肽(Peptide)通过跨膜肽(TMP)嵌合在细胞膜表面，膜受体c-Met也表达在膜表面。备选肽与c-Met一旦发生相互作用，膜内侧的泛素检测系统即被激活，释放GAL4转录因子启动报告基因。
图2显示了平板筛选实验的流程图。分别构建含有备选肽(Peptide)与c-Met编码序列的质粒，将其转入两种不同酵母菌株中，将两种酵母菌株杂交后，进行平板筛选实验。
图3显示了基于小肽-受体相互作用的高通量筛选的部分结果。其中，(A)显示了“膜锚定配体-受体酵母双杂交系统”检测肽库中小肽与c-Met相互作用，其中H-CN与c-Met的结合较部分其他小肽更强(菌株生长最快、颜色最深)；(B)显示了H-CN与c-Met相互作用的三维结构局部图。
图4显示了H-CN对EAE临床评分的影响。在免疫后第15天开始，每组小鼠分别予以腹腔注射PBS、H-CP、H-CN或FTY720治疗。免疫后的隔天对小鼠临床表现进行观察并评分。开始注射2天后(第17天)H-CN及FTY20治疗组临床症状评分出现明显下降。
图5显示了不同EAE治疗组血清炎症因子水平。EAE小鼠分别予以腹腔注射PBS、H-CP、H-CN、FTY720治疗，IFN-r、TNF-a、IL-2、IL-6，IL-17A、IL-10等细胞因子水平改变如图所示，*表示P<0.05，**表示P<0.01，##表示P>0.05。
图6显示了H-CN对EAE小鼠脾脏及***Th细胞亚群的影响。EAE小鼠脾脏及***中Th0、Th1、Th17及Treg等各群比例均升高，而H-CN能够降低Th0、Th1及Th17细胞群比例，同时升高Treg亚群比例。
图7显示了H-CN对EAE小鼠神经组织Th细胞亚群的影响。上图显示了神经组织中CD4+T比例的改变，正常小鼠仅有微量CD4+T，EAE造模后CD4+T增多，FTY720能够减少靶器官中CD4+T的浸润，而H-CN对此无影响。下图显示了CD4+T中Th亚群比例改变：H-CN能够显著减少EAE小鼠神经系统中Th1及Th17细胞群比例，同时升高Treg亚群比例。
图8显示了EAE小鼠闪光视觉诱发电位(VEP)检查结果。左图显示了各组VEP波形，EAE组正常波幅显著下降，干扰波相对增强，H-CP治疗组未及改善，H-CN及FTY720组可及波形部分恢复。右图显示了各组N1-P1振幅比较，**表示P<0.01，*表示P<0.05，##表示差异无统计学意义。
图9显示了各组小鼠免疫后第22天眼底表现。根据图中显示可见，正常小鼠血管无增粗、无视网膜病灶等；EAU小鼠可及血管增粗、扩张充血及渗出灶；H-CP治疗组可及视盘周围大的融合病灶；H-CN治疗组可及血管炎症状减轻，渗出减少。
图10显示了H-CN对EAU临床评分的影响。在免疫后第12天开始，每组小鼠分别予以PBS、H-CP及H-CN腹腔注射联合点眼治疗。免疫后第10天开始，隔天对小鼠临床表现进行观察并评分。开始注射3次后(第16天)H-CN治疗组临床症状评分出现明显下降。
图11显示了H-CN对EAU组织病理改变的影响。免疫后第22天开始取小鼠眼球进行HE染色，可及EAU组及H-CP组可及炎症浸润及视网膜褶皱，病变累及外核层及光感受器细胞层，可及血管周围炎性肉芽肿病灶，H-CP组出现局灶性网脱；H-CN组可及玻璃体腔及浅层视网膜炎症浸润，视网膜平坦，外层结构正常。
图12显示了H-CN对EAU小鼠脾脏及***Th细胞亚群的影响。EAU小鼠脾脏及***中Th0、Th1、Th17及Treg等各群比例均升高，而H-CN能够降低Th0、Th1及Th17细胞群比例，同时升高Treg亚群比例。
图13显示了H-CN对EAU小鼠眼球Th细胞亚群的影响。上图显示了眼球中CD4+T比例的改变，正常小鼠眼球中仅有微量CD4+T，EAU造模后眼球中CD4+T增多，而H-CN并不能减轻眼球中CD4+T的浸润。下图显示了CD4+T中Th亚群比例改变：尽管H-CN对眼球CD4+T浸润无影响，但能够调节眼球局部CD4+T的分群，可以显著减少Th1及Th17细胞群比例，同时升高Treg亚群比例。
图14显示了RAW264.7细胞(左)和HUVEC细胞(右)MTS增殖实验结果。结果表明，不同浓度的活性肽H-CN对照肽Pep17孵育24h对RAW264.7和HUVEC细胞的活力无明显影响，表明其无细胞毒性。
图15显示了H-CN干预组与对照组间小鼠视网膜切片电镜扫描、HE染色、视网膜电图(ERG)及VEP结果均未见明显改变。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次开发了一种具有抑制自身免疫性炎症功能的，分子量仅为4KD以下的小分子多肽。具体地，本发明人应用生物信息学的方法，基于同源性分析和生物学特性等的分析，选定了数个候选多肽序列；利用膜锚定配体-受体酵母双杂交系统，用c-Met受体蛋白对候选多肽序列进行筛选，筛选出了一类具有一段同源序列的小分子多肽。并且，经实验性自身免疫性脑神经炎(EAE)小鼠模型及实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)小鼠模型中免疫调节作用的验证，发现了此类多肽能够使EAE和EAU小鼠的临床症状减轻、视功能明显改善。此外，采用玻璃体腔注射的靶向生物肽的安全性检测表明，此类多肽对小鼠视网膜结构无影响并且对小鼠视功能无影响，即证明了此类多肽进行玻璃体腔注射的安全性。在此基础上完成了本发明。
多肽
如本文所用，术语“多肽”、“小分子多肽”、“短肽”或“本发明多肽”可互换使用，是指具有抑制自身免疫性炎症且具有本发明第一方面所述的式I结构的多肽。
在一个优选的实施方式中，本发明的多肽具有如SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6所示的氨基酸序列。
在一个更优选的实施方式中，本发明的多肽具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。如本文所用，术语“H-CN多肽”、“多肽H-CN”、“H-CN小肽”或“肽H-CN”可互换使用，是指具有抑制自身免疫性炎症的肽H-CN氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的蛋白或多肽。
此外，所述术语“多肽”还包括具有抑制炎症功能的、SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-5个(通常为1-4个，较佳地1-3个，更佳地1-2个，最佳地1个)氨基酸的缺失、***和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为5个以内，较佳地为3个以内，更佳地为2个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。
在另一优选例中，所述在N末端添加的氨基酸序列为SSYRGKDLQENY(SEQ ID NO:7，从N端至C端)；所述在C末端添加的氨基酸序列为SNPEVRYEVCDIP(SEQ ID NO:8，从N端至C端)所示。
本发明还包括本发明多肽的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持抑制自身免疫性炎症功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)本发明多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的然后蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
一类优选的活性衍生物指与式I的氨基酸序列相比，有至多5个，较佳地至多3个，更佳地至多2个，最佳地1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
最初的残基
代表性的取代
优选的取代
Ala(A)
Val；Leu；Ile
Val
Arg(R)
Lys；Gln；Asn
Lys
Asn(N)
Gln；His；Lys；Arg
Gln
Asp(D)
Glu
Glu
Cys(C)
Ser
Ser
Gln(Q)
Asn
Asn
Glu(E)
Asp
Asp
Gly(G)
Pro；Ala
Ala
His(H)
Asn；Gln；Lys；Arg
Arg
Ile(I)
Leu；Val；Met；Ala；Phe
Leu
Leu(L)
Ile；Val；Met；Ala；Phe
Ile
Lys(K)
Arg；Gln；Asn
Arg
Met(M)
Leu；Phe；Ile
Leu
Phe(F)
Leu；Val；Ile；Ala；Tyr
Leu
Pro(P)
Ala
Ala
Ser(S)
Thr
Thr
Thr(T)
Ser
Ser
Trp(W)
Tyr；Phe
Tyr
Tyr(Y)
Trp；Phe；Thr；Ser
Phe
Val(V)
Ile；Leu；Met；Phe；Ala
Leu
本发明还提供本发明多肽的类似物。这些类似物与本发明多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明多肽还可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下酸形成的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羟乙磺酸。其他盐包括：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式。
编码序列
本发明还涉及编码本发明多肽的多核苷酸。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以是编码SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6所示的氨基酸序列的所有简并的变异体形式的核苷酸序列。
本发明的多核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。
另一方面，本发明还包括对本发明多肽DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。
制备方法
本发明多肽可以是重组多肽或合成多肽。本发明的多肽可以是化学合成的，或重组的。相应地，本发明多肽可用常规方法人工合成，也可用重组方法生产。
一种优选的方法是使用液相合成技术或固相合成技术，如Boc固相法、Fmoc固相法或是两种方法联合使用。固相合成可快速获得样品，可根据目的肽的序列特征选用适当的树脂载体及合成系统。例如，Fmoc系统中优选的固相载体如连接有肽中C端氨基酸的Wang树脂，Wang树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-烷氧基苄醇；用25％六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温处理20分钟，以除去Fmoc保护基团，并按照给定的氨基酸序列由C端逐个向N端延伸。合成完成后，用含4％对甲基苯酚的三氟乙酸将合成的胰岛素原相关肽从树脂上切割下来并除去保护基，可过滤除树脂后***沉淀分离得到粗肽。将所得产物的溶液冻干后，用凝胶过滤和反相高压液相层析法纯化所需的肽。当使用Boc系统进行固相合成时，优选树脂为连接有肽中C端氨基酸的PAM树脂，PAM树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-羟甲基苯乙酰胺；在Boc合成系统中，在去保护、中和、偶联的循环中，用TFA/二氯甲烷(DCM)除去保护基团Boc并用二异丙基乙胺(DIEA)/二氯甲烷中和。肽链缩合完成后，用含对甲苯酚(5-10％)的氟化氢(HF),在0℃下处理1小时，将肽链从树脂上切下，同时除去保护基团。以50-80％乙酸(含少量巯基乙醇)抽提肽，溶液冻干后进一步用分子筛Sephadex G10或Tsk-40f分离纯化，然后再经高压液相纯化得到所需的肽。可以使用肽化学领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各氨基酸残基，例如可使用二环己基碳二亚胺(DCC)，羟基苯骈三氮唑(HOBt)或1,1,3,3-四脲六氟磷酸酯(HBTU)进行直接偶联。对于合成得到的短肽，其纯度与结构可用反相高效液相和质谱分析进行确证。
在一优选例中，本发明多肽，按其序列，采用固相合成的方法制备，行高效液相色谱纯化，获得高纯度目的肽冻干粉，-20℃贮存。
另一种方法是用重组技术产生本发明多肽。通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸可用来表达或生产重组的本发明多肽。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码本发明多肽的多核苷酸，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
由于本发明多肽较短，因此可以考虑将多个多肽串联在一起，重组表达后获得表达产物，然后通过酶切等方法形成所需的小肽。
自身免疫性葡萄膜炎(Autoimmune uveitis,AU)
AU是一类可累及葡萄膜、视网膜及玻璃体的眼部免疫炎症性疾病，具有病程长、易双眼受累、反复发作等特点，并可导致并发性白内障、继发性青光眼、继发性脉络膜新生血管等严重并发症，致盲率可高达30％。
AU及MS的发病与辅助T细胞(T helper cell,Th cell)为主介导的全身及局部免疫紊乱有关。
对AU及MS而言，其靶向治疗的靶点可以是某些炎症因子，如肿瘤坏死因子(tumornecrosis factor，TNF-a)、白介素(interleukin，IL-6、IL-17、IL-1)等；或是可溶性的介质，如干扰素(interferons)等；也可以是细胞表面的某些分子，如CD19、CD52、CD152等。
视神经脊髓炎(neuromyelitis optica,NMO)
NMO是一种视神经与脊髓相继或同时受累的自身免疫性脱髓鞘性疾病，约50％的NMO患者以视神经炎为首发表现。
NMO在亚洲人群中尤为高发，占亚洲人群脱髓鞘疾病的20％-48％。在过去，NMO曾被认为是MS的一种特殊表型，直到近十年来随着对其发病机制的不断深入研究，尤其是水通道蛋白4(aquaporin4,AQP4)自身抗体这一NMO特异性免疫球蛋白的发现，才逐渐将其从MS中分离出来成为一种独立的疾病。
AQP4是位于星形胶质细胞足突上的主要的水通道蛋白分子，NMO中由于自身AQP4抗体的力损伤甚至失明。约有一半的NMO患者可以表现为孤立的视神经炎，其中20％为双眼受累，可反复发作，每发作一次都会造成视力进一步的下降，因此持续且严重的视力损伤是NMO视神经炎的特征表现；而与之相比，MS的视神经炎多为单眼发作，发作后视力多能恢复至接近正常水平，因此视力预后较好。
对NMO而言，由于NMO患者特征性抗体AQP4自身抗体的存在，针对这一发病机制，目前生物靶向疗法主要包括B细胞抑制治疗及血浆置换疗法等，以及临床前期实验中的AQP4抗体阻断治疗等。然而NMO患者中AQP4抗体的阳性率仅有50％-60％左右，在AQP4抗体阴性的患者中上述治疗措施的效果较差。并且由于NMO诊断的困难，血清AQP4抗体阴性的患者在发病早期极易与MS相关的ON混淆，而MS的一些新型生物治疗措施，例如IFN-β、那他珠单抗、口服芬戈莫德等、会加剧NMO疾病的进展，给治疗带来了更大的困难。
Teff/Treg失衡在AU及AON中的作用
CD4+辅助T细胞(T helper cell,Th cell)介导了AU及MS的发病：外周初始T细胞(naive T cell)在自身抗原刺激下分化为Th1和Th17等效应T细胞(Effector T Cells，Teff cell)亚群，分泌IFN-γ及IL-17A等炎症因子，导致眼部及神经组织病理损害。
调节性T细胞(regulatory T cell,Treg cell)是一类具有免疫抑制作用的T细胞亚群，能够抑制Teff的活化与增殖，同时分泌IL-10等免疫抑制因子，维持组织内的免疫稳态和避免自身免疫反应。而外周及组织内Teff/Treg的失衡导致了AU与MS的发病。调节Teff/Treg的平衡，对减缓AU及MS的疾病进展及改善视力预后有重要意义。
在NMO的发病过程中，除体液免疫以外，细胞免疫也参与其中。首先，NMO病灶处有大量CD3+T细胞浸润；其次，NMO患者存在编码MHC II类分子的HLA-DR17位点基因异常，而MHC II类分子主要在免疫起始阶段负责将处理过的12-15个氨基酸长度的抗原片段呈递给CD4+T辅助T细胞(T helper cell,Th cell)细胞；再次，AQP4抗体属于IgG，而抗体从IgM向IgG的转化需要Th细胞的参与，并且B细胞抑制治疗并不能减少NMO特异性IgG滴度，提示其可能是通过抑制T细胞激活而起到治疗作用；此外，大量动物实验表明在小鼠中注射AQP4抗原决定簇可以激活细胞免疫反应并产生AQP4特异性T细胞，AQP4抗原决定簇AQP4281-300可以在小鼠中诱导产生Th1及Th17免疫应答反应，提示Teff细胞可能作为NMO自身免疫应答过程中的上游环节，参与了疾病的发生发展。
综上所述，调节Teff/Treg的平衡，对减缓AU及AON疾病进展及改善视力预后有重要意义。
在本发明中，提供了一类能够调节Teff/Treg平衡的小分子靶向生物肽，为AU患者的治疗提供了一种新策略。
c-Met受体靶向生物肽
c-Met作为受体络氨酸激酶家族成员，是一种膜蛋白受体，与配体肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor，HGF)结合后可激活其胞内段的络氨酸激酶活性，参与组织损伤修复、免疫调控及抗炎等过程。Kringle 1结构域是HGF的重要功能域之一，具有高度的c-Met受体亲和性，且已被证实具有抗炎及免疫调节作用。研究表明Kringle 1结构域激活c-Met后可诱导Treg的分化及促进IL-10因子的分泌，抑制Teff的增殖及功能，下调IFN-γ、IL-17A的表达，从而恢复Teff/Treg的平衡，在实验性自身免疫性葡萄膜炎(ExperimentalAutoimmune Uveitis,EAU)及实验性自身免疫性脑神经炎(experimental autoimmuneencephalomyelitis,EAE)等多种自身免疫疾病模型中均能发挥突出的免疫调节作用。
肽类药物是从内源性功能蛋白中分离合成的小分子活性制剂，相对大分子蛋白质而言，生物肽在保留母蛋白功能的同时，还具有分子量小、生产成本低、水溶性好、免疫源性小、毒副作用低及组织穿透性强等优势。
然而，既往生物肽均存在作用靶点不明确、作用机制不确定等问题，导致存在潜在的副作用，限制了其临床应用；因此研发具有明确靶点的生物肽，对研究成果的临床转化意义重大。
在本发明中，选取c-Met受体来筛选小分子肽段，靶点和作用机制明确，且克服了上述大分子活性制剂的缺点。
膜锚定配体-受体酵母双杂交系统
“膜锚定配体-受体酵母双杂交系统”是一种配体与膜受体相互作用的高通量检测系统，可以用于进行受体靶向性生物肽的筛选。该系统将膜蛋白受体表达在酵母细胞膜表面，同时将配体通过融合跨膜肽锚定在细胞膜表面。受体和配体模块在胞内分别偶联***泛素检测系统上和下半区，当受体和配体发生相互作用时，检测系统激活，释放转录因子，启动报告基因。通过检测报告基因是否表达及表达强度，可得知配体与膜受体是否结合，并对配体与受体的亲和力进行预判。具体流程和机理如图1所示。
基于上述认识，本发明人拟通过生物信息学技术及上述膜锚定配体-受体酵母双杂交系统，从c-Met受体的天然配体HGF中筛选生物肽，并通过体内外实验对该生物肽的免疫调节生物活性及生物安全性进行检验。
药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量(如0.1-99.9wt％；较佳的10-99.9wt％；更佳的，70-99.9wt％)的本发明多肽(尤其是多肽H-CN)，以及药学上可接受的载体。
通常，可将本发明多肽配制于无毒、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和***反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明多肽以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药的方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为眼药水、针剂(如眼周和眼内注射液)、眼用凝胶或眼药膏。
本发明所述蛋白的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明多肽每天以约1-4mg/kg动物体重(较佳的2-3mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明的主要优点包括：
1)小分子肽类靶向药物相对大分子蛋白质而言，具有分子量小、生产成本低、水溶性好、免疫源性小、毒副作用低及组织穿透性强等优势。这些特性使小分子靶向生物肽在眼部自身免疫性炎症的临床治疗中具有潜在的优势及较为广泛的应用前景。
2)本发明研究的新型生物肽，是以c-Met受体为靶点、通过受体靶向性筛选出的，并且其母蛋白HGF为内源性大分子蛋白，其体内外应用的安全性也已得到验证，因而与糖皮质激素及免疫抑制剂相比，具有靶点明确、毒副作用小的优点。
3)相较于大分子的单克隆抗体等靶向治疗药物，①其为小分子、亲水性生物肽，具有组织穿透性强的优点，有希望透过各种血眼及血视神经组织屏障，提高眼局部的生物利用度；②且由于其母蛋白为内源性蛋白，因此具有免疫原性低、生物相容性好的优点；③并且能够通过体外固相合成获得，生产成本低。
4)通过EAE及EAU两种模型的研究表明，该生物肽具有显著的免疫调节、抗炎及改善视功能的作用，有效性得到验证。
5)传统免疫抑制剂除在抑制Th1、Th17等Teff亚群作用的同时也抑制了Treg细胞的增殖活化，而本发明的靶点c-Met受体通路在抑制Teff的同时能够促进Treg的分化与功能。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
如无特别说明，实施例所用的材料和试剂均为市售产品。
实施例1：靶向生物肽的筛选
1.1肽库构建：
1.1.1氨基酸序列及二级结构分析
使用基本局部比对搜索工具(basic local alignment search tool,BLAST)分析HGF氨基酸序列。登陆美国国立生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation,NCBI)网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，在NRDB蛋白质序列复合数据库中查找“Hepatocyte growth factor”。选择BLAST搜索程序进入Standard Protein-Protein BLAST(BLASTp)子程序，提交查得的HGF氨基酸序列及其Kringle 1结构域的二级结构分析。从Kringle 1中筛选出若干备选多肽序列，对其基本性质及生物学特性进行分析。
1.1.2氨基酸序列基本性质分析
通过ExPASy(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)，我们对氨基酸序列的各项基本参数(包括氨基酸残基的组成、分子量、等电点、半衰期以及PH为7.0时的净电荷等)进行分析。
1.1.3生物学特性分析
将待分析的氨基酸序列编辑成EditSeq Protein Sequence File格式文件后，应用DNAStar软件包的Protean程序分别行抗原性分析(Jameson-Wolf法)、表面接触性分析(Emini法)和亲水性分析(Kyte&Dolittle法)。
通过上述分析，筛选出半衰期较长、亲水性较强、表明接触性较强、抗原性较低的小肽序列组成肽库。
1.2基于小肽-受体相互作用的高通量筛选
通过PCR方法获得肽库中小肽的基因序列，克隆至配体表达载体，构成“信号肽-备选肽-检测模块”的融合基因。将配体载体转化至酵母菌株Y2HGold中；同样方法构成“信号肽-c-Met-检测模块”受体载体，转化至酵母菌株Y187中。将包含有小肽的配体文库Y2HGold菌株和包含有c-Met的受体文库Y187菌株同时扩大培养至所需的规模并进行杂交。杂交后涂布筛选平板(SD/Trp-Leu-Ade-His-+3AT+α-X-gal)进行筛选，如图2所示。
挑取生长最快，颜色最深的菌株，试剂盒提取配体质粒，进行测序，获得小肽序列，并利用固相合成技术进行合成，最终筛选出以肽H-CN(CRNPRGEEGGPWCFTSNPEVRYE)为例的一系列多肽。部分结果如图3所示。
表2列出了筛选所得的部分与c-Met受体具有显著相互作用的多肽。
表2
(注：所述的结合强度主要是定性的判断，在运用“膜锚定配体-受体酵母双杂交系统”进行检测的结果中，例如图3左图所示的第三列孔有酵母生长为强，第二列孔有酵母生长为中，只有第一列有或无生长为弱，部分数据未列于图3中。)
1.3H-CN与c-Met受体结合的特异性检测
生物靶向治疗必须避免“脱靶”产生的副作用，因而需要检测H-CN与c-Met同家族膜受体的交叉反应。
通过氨基酸序列检索发现，H-CN的氨基酸序列与HGF同家族(生长因子家族)成员(表皮生长因子EGF、***IGF、成纤维生长因子FGF、血小板源性生长因子PDGF等)的氨基酸序列不存在重叠，提示其存在交叉反应可能性较低。
进一步通过“膜锚定配体-受体酵母双杂交系统”检测H-CN与c-Met同家族(生长因子受体家族)成员间有无相互作用，从而明确H-CN与c-Met结合的特异性。构建含有生长因子受体(EGF受体EGFR、IGF受体IGFR、FGF受体FGFR、PDGF受体PDGFR等多种具有络氨酸激酶活性的膜蛋白受体)融合基因的质粒文库，将H-CN分别与生长因子受体共同表达在酵母细胞膜表面。
检测结果表明H-CN与上述多种膜蛋白受体间均无作用。
实施例2：靶向生物肽抑制眼部自身免疫性炎症反应的有效性检测：
实验性自身免疫性脑神经炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠模型被用于模拟MS等人类自身免疫性神经系统炎症疾病，包括自身免疫性视神经炎的相关研究。实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)小鼠模型作为自身免疫性葡萄膜炎的动物模型，被广泛应用于自身免疫性葡萄膜炎的免疫病理机制研究以及研发预防或治疗药物的过程中。
在本实施例中，构建了EAE及EAU动物实模型，并对生物肽H-CN在这两种模型中的免疫调节作用和抗炎作用进行了研究
2.1H-CN治疗EAE的有效性研究
2.1.1EAE小鼠模型建立及处理、观察
1)EAE模型的诱导①抗原乳化：三通管连接两支玻璃乳化针管，用PBS稀释髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(MOG35-55)抗原肽至3mg/ml后加入乳化管中，再加入等体积5mg/ml的完全弗氏佐剂(CFA)(每200μl乳化液含300μgMOG35-55，100μl PBS和100μl CFA)，置冰上来回交替推动活塞500次，直至抗原呈完全乳化状态；②百日咳毒素(PT)的配制：用PBS稀释PT至终浓度1μg/ml，200μl/小鼠；③模型诱导：a.1％戊巴比妥钠麻醉腹腔注射小鼠；b.尾静脉(i.v.)注射PT，200μl/小鼠；c.用酒精棉球消毒小鼠背部两侧皮肤，在两侧背部中下处皮下注射MOG抗原乳化液，每侧100μl；d.48h后，每只小鼠再次尾静脉注射200μl PT；e.每天观察临床症状并评分。
2)EAE模型的处理将EAE小鼠随机分成空白组、对照组、H-CN组、H-CP(对照肽，为H-CN的序列随机打乱而来)组、阳性对照组。空白组为未造模组，其余各组从EAE小鼠造模的第15天开始，每日给予腹腔注给药，其中对照组予200μl PBS腹腔注射，H-CN组予200μg H-CN(1μg/μl，溶剂为PBS)腹腔注射，H-CP组予200μg H-CP(1μg/μl，溶剂为PBS)腹腔注射，阳性对照组予100μg FTY720(0.5μg/μl，溶剂为含10％DMSO的PBS溶液)。其中FTY720是一种新型的免疫抑制剂，能够有效减少外周循环中淋巴细胞数目，被泛应用于移植手术术后及自身免疫疾病等，本研究中采用FTY720作为H-CN疫调节效果的的阳性对照药物。
3)EAE模型的观察及临床评分：EAE免疫诱导后每天对其临床症状进行观察并按照报道的经典评分方法一名指定的观察员进行盲法评分。
2.1.2小鼠血清炎症因子水平检测
取小鼠外周血，应用ELISA方法检测血清中IFN-r、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNFa等炎症因子的浓度：①标准品制备：将标准品固体放入15ml离心管中，加入2ml稀释液重悬，轻吹打混匀，室温静置15min。取9个EP管，分别标号为：1:1,1:2,1:4,1:8,1:16,1：32,1:64,1:128,1:256。1:1管中加入300ul标准品溶液，除1:1管外每管中加入ul稀释液。用移液器吸取300ul标准品溶液加入到1:2管中，轻轻吹打混匀后移液器吸出300ul，移至1:4管，如此反复对倍稀释直至1:256管，最后从1:25中吸出300ul弃去。另准备第9个EP管加入300ul稀释液作为空白对照。②细胞因子捕获磁珠制备：根据样本数及标准品管数计算检测管数n(检测数＝样品数+9个标准品+1个空白对照)。共有7种细胞因子捕获磁珠，每管检品需加入每种细胞因子捕获磁珠10ul，故每种细胞因子捕获磁珠需要量为：l×n。吸取所需体积的每种细胞因子捕获磁珠于一新的EP管中，置于漩涡混器上混匀。③细胞因子捕获磁珠重悬：将步骤②中配制的混合磁珠200g离心5min，吸上清，加入等体积的血清封闭液，置于漩涡混合器上混匀，室温避光孵育30min。④样品稀释：将血清样品及稀释液按照1:3进行稀释。⑤加样：吸取稀释后的样品50ul置于EP管中，向样品管、标准品管及空白照管中加入步骤③中重悬的捕获磁珠，每管加入50ul，充分混匀。⑥抗体标记：每管加入50ul PE标记的细胞因子抗体，充分混匀，室温避光育3h。⑦洗涤：每管加入1ml洗涤液吹打混匀，200g离心5min，吸去上清，洗涤次。⑧检测：每管加入300ul洗涤液重悬，将重悬后的标准品管、空白管及样品依次放入流式分析仪中进行检测，检测结果用FCAP Array软件进行分析。
2.1.3小鼠外周及神经组织单核淋巴细胞(PBMC)亚群分析
1)小鼠外周PBMC取材
取小鼠脾脏及外周***。使用载玻片磨砂面进行研磨，300目双层滤网过滤获取单细胞悬液，300g离心5min，去除上清。一只小鼠取得的细胞悬液内加入1ml红细胞裂解液，静止5min后加入PBS洗涤。
2)小鼠脑和视神经组织PBMC取材
取小鼠脑及视神经组织。使用载玻片磨砂面进行研磨，300目双层滤网过滤获取单细胞悬液，300g离心5min，去除上清。在15ml离心管底部铺5ml 70％Percoll，用10ml 40％Percoll悬单细胞并轻轻铺在70％Percoll上面，1000g升速0降速0离心30min，云雾淋巴细胞将出现在两层中间。小心将淋巴细胞吸出，加10ml PBS，300g离心5min洗去Percoll，涤两次。
3)CD4+辅助T细胞(Th细胞)亚群流式分析
细胞表面抗原染色：①制备PBMC悬液。分为空白对照组、单染组及样品组，每组计数后取10^6个PBMC，1×PBS洗涤后，300g离心5min，去除上清。②Fixable Viability Dye死活染料(APC-Cy7荧光)1：1000稀释，APC-Cy7单组及样品组每组加入100ul，冰上避光染色10min，加入FACS缓冲液进行洗涤。③除空白对照组和其他单染组外，每组加入1:100稀释后的相应细胞表面抗100ul，2-8℃避光静置30min，加入FACS缓冲液洗涤2次后，200ul FACS重悬。④用流式细胞分析仪的相应荧光通道对空白组、单染组及样组进行分析。
细胞因子染色：①制备PBMC悬液，分为空白对照组、单染组及样品组，每组计数后取10^6个PBMC，用1ml含10％胎牛血清的1640培养基悬。②刺激淋巴细胞：淋巴细胞在PMA(1:1000)、Inomycin(1:1000)、giStop(1:1000)和GolgiPlug(1:1000)等试剂37℃刺激5h后收集细胞，加入FACS缓冲液进行洗涤。③Fixable Viability Dye死活染料(APC-Cy7荧光)1：1000稀释，APC-Cy7单组及样品组每组加入100ul，冰上避光染色10min，加入FACS缓冲液洗涤2次。④细胞表面染色。⑤固定破膜：每管加入250ul固定破膜液，振荡混匀后2-8℃避光孵育30min。每管加入1ml破膜洗涤液洗涤2次。⑥除空白对照组和其他单染组外，每组加入1:100稀释后的相应细胞因子抗00ul，2-8℃避光静置30min，用破膜洗涤液洗涤细胞2次后，200ul FACS缓冲液重悬。⑦用流式细胞分析仪的相应荧光通道对空白组、单染组及样组进行分析。
转录因子染色：①制备PBMC悬液，分为空白对照组、单染组及样品组，每组计数后取10^6个PBMC，用1ml含10％胎牛血清的1640培养基悬。②Fixable Viability Dye死活染料(APC-Cy7荧光)1：1000稀释，APC-Cy7单组及样品组每组加入100ul，冰上避光染色10min，加FACS缓冲液洗涤。③细胞表面染色。④固定破核膜：每管加入1ml固定破核膜液，振荡混匀后2-8℃避光孵育min。每管加入1ml破膜洗涤液洗涤细胞2次。⑤除空白对照组和其他单染组外，每组加入1:100稀释后的相应转录因子抗体100ul，2-8℃避光静置30min，用破膜洗涤液洗涤细胞2次后，200ul FACS缓冲液重悬。⑥用流式细胞分析仪的相应荧光通道对空白组、单染组及样组进行分析。
2.1.4小鼠电生理检查
免疫后第30天，对小鼠进行电生理检查；受检小鼠预先暗适应12h以上。操作前20min使用阿托品滴眼液扩瞳；1％戊巴比妥钠麻醉腹腔注射小鼠，无肌颤为标准；麻醉过程中使用羧甲基纤维素钠维持小鼠角膜湿润。利用Roland RETI Animal电生理仪记录小鼠闪光VEP情况，方法同之文献报道。对闪光VEP P1的振幅和潜伏期进行统计。
2.1.5实验结果：
1)H-CN改善EAE小鼠临床症状评分
MOG35-55与CFA乳剂免疫小鼠后第10天左右开始，小鼠开始出现临床症状，最早表现为尾巴的无力与瘫软，随后症状随着免疫后天数的增加而逐渐加重，症状在免疫后第14-16天左右达到高峰，主要表现为双后肢的瘫痪及前肢的无力。高峰期过后，小鼠症状逐渐改善。本发明人采用了免疫后第15天开始每日腹腔注射的方法治疗EAE。
根据每天的临床症状观察发现，H-CN多肽组使用第2天起(免疫后第17天)起，临床症状得到明显改善，临床评分与H-CP治疗组及PBS对照组均有显著差异(P<0.05)，且这种差异保持到免疫后第24天。FTY720治疗在临床评分方面也显示出类似的疗效，而杂肽H-CP组小鼠的临床评分则与PBS组始终无明显差异。各组小鼠隔日评分情况见图4及表3。
表3 EAE小鼠临床评分统计
天数
PBS组
H-CP组
H-CN组
FTY720组
0
0±0
0±0
0±0
0±0
2
0±0
0±0
0±0
0±0
4
0±0
0±0
0±0
0±0
6
0±0
0±0
0±0
0±0
8
0±0
0±0
0±0
0±0
10
0.5±0.35
0.5±0
0.6±0.42
0.5±0.35
12
1.0±0.35
1.0±0.35
1.2±0.45
0.9±0.22
14
2.2±0.76
2.4±0.42
2.2±0.27
2.2±0.57
16
3±0.61
2.8±0.28
2.4±0.42*
2.6±0.55
18
2.9±0.22
2.9±0.65
1.9±0.42**
1.7±0.27**
20
2.8±0.27
2.8±0.27
1.5±0.35**
1.2±0.27**
22
2.5±0.5
2.5±0.79
1.2±0.27**
1.0±0.35**
24
2.4±0.22
2.3±0.57
0.8±0.27**
0.5±0.35**
*表示与PBS组比P<0.05，**表示与PBS组比P<0.01，H-CN组与FTY720组评分无统计学差异，PBS组与H-CP组间评分无统计学差异
2)H-CN降低EAE小鼠血清中多种炎症因子表达水平
在给药后第5天(免疫后第20天)取小鼠血清，利用CBA对EAE小鼠PBS治疗组、H-CP治疗组、H-CN治疗组及FTY720治疗组进行IFN-r、TNF-a、IL-2、IL-4、IL-6、IL-17A、IL-10等炎症因子水平的检测。
结果表明，与PBS组相比，H-CN治疗组及FTY720治疗组IFN-r、TNF-a、IL-2、IL-6及IL-17A等因子水平均下降，差异有统计学意义，而H-CN组与FTY720组间差异则无统计学意义，这表明H-CN能够抑制EAE模型外周上述炎症因子的分泌，并且作用可与FTY720相媲美。
此外，IL-4因子的水平在各组间则未见统计学差异，这可能是由于EAE模型中Th2亚群未发生改变，IL-4水平也相应无变化。
此外，还发现H-CN治疗组IL-10因子水平的较PBS组水平较升高，差异有统计学意义，这表明H-CN除了能够抑制IFN-r、IL-2、IL-6、IL-17A等促炎因子的产生外，同时可以增加炎症及免疫抑制因子IL-10的水平，起到抑制炎症及免疫反应的作用。对照肽H-CP治疗组与PBS组相比各种炎症因子的水平未及明显改变，表明H-CN的治疗作用具有氨基酸序列依赖性的。
综上所述，该部分结果表明H-CN具有免疫调控作用，能够抑制自身免疫炎症反应中过度激活的免疫及炎症反应，且作用显著，可与FTY720相比较。
3)H-CN对EAE外周CD4+T细胞分群的影响
为进一评估H-CN对Th细胞的影响，我们取EAE小鼠及H-CN治疗组的脾脏及***中的PBMC，通过流式细胞分析技术对Th0、Th1、Th17和Treg亚群所占的百分比进行分析。Th1、Th17和Treg等的作用此前已经介绍过，Th0群是致敏激活的Th细胞，是由原始T细胞向Th1、Th2、Th17等细胞分化的中间状态。PBMC进行表面、细胞因子及转录因子染色后进行流式检测，根据细胞大小及折光性圈出淋巴细胞分群，利用死活燃料圈出活细胞群后，从中圈出CD4+细胞群，并对CD4+CD62L+(Th0)、CD4+IFN-r+(Th1)、CD4+IL-17A+(Th17)、及CD4+Foxp3+(Treg)亚群在CD4+细胞群中的百分比进行分析。
结果表明，EAE模型中Th0、Th1、Th17及Treg群比例均较正常小鼠升高，其中Th1升高较不明显，这可能与取材时间有关，有报道显示在EAE发病早期主要以Th17升高为主72。而H-CN能够降低EAE小鼠脾脏及***CD4+T细胞中Th0、Th1及Th17亚群比例，同时升高Treg细胞群比例，差异有统计学意义(P<0.05)。实验结果如图6所示。
上述结果表明，H-CN能够通过改变外周Th细胞亚群的比例，从而起到免疫调节作用。
4)H-CN对EAE神经组织CD4+T细胞分群的影响
为进一步探索H-CN对靶器官中Th细胞的影响，我们取正常小鼠、EAE小鼠及EAE H-CN治疗小鼠的大脑及视神经等组织，提取组织PBMC，进行表面、细胞因子及转录因子染色后进行流式检测。根据细胞大小及折光性圈出淋巴细胞分群，利用死活燃料圈出活细胞群后，从中圈出CD4+细胞群，并对神经组织中CD4+细胞群所占比例及CD4+细胞群中各Th亚群的百分比进行统计分析。由图7可见，正常小鼠神经组织中仅有微量的CD4+细胞，而EAE模型中CD4+细胞明显增多，FTY720这种新型免疫抑制剂主要通过减少外周循环中的淋巴细胞发挥免疫抑制作用，因此可FTY720治疗组神经组织中CD4+细胞明显减少，而H-CN治疗组则未见明显改变，提示H-CN发挥作用的机制与FTY720并不相同。对EAE组及EAE H-CN治疗组CD4+T细胞中Th细胞百分比的改变进行分析，而正常小鼠及FTY720组CD4+T细胞较少，不适宜进一步统计其中亚群百分比。结果发现，H-CN虽然无法减少神经组织中CD4+T细胞的浸润，但可以影响其分群改变，减少Th1及Th17等促炎亚群的比例，升高Treg免疫调节亚群的比例。实验结果如图7所示。
5)H-CN抑制EAE视功能损伤的研究
为评估小鼠视神经功能损伤情况，对小鼠进行全视野闪光VEP检查，并对各组间检查结果进行比较。在闪光VEP的各波形中，P1的波形和潜伏期较为稳定，常被用来作为定量评估的指标，因此本发明人对各组小鼠P1的潜伏期和N1-P1振幅进行统计分析。
结果表明，EAE小鼠P1潜伏期未见明显改变，但N1-P1振幅较正常小鼠显著下降，反应了EAE小鼠视神经的损伤。使用H-CN治疗后，能够部分恢复P1的波形，振幅较EAE组及EAE+H-CP组有统计学意义，与FTY720组间无统计学差异。各组间P1潜伏期未及明显改变，差异无统计学医院。实验结果如图8所示。
上述结果提示H-CP能够减轻EAE小鼠视神经受累，改善视功能。
2.1.6讨论
在本实施例2.1中，对多肽H-CN在EAE模型中的免疫调节作用进行了验证。
结果表明，H-CN能够改变外周免疫器官及靶器官中Th细胞的分群，使Th1、Th17等促炎细胞群的比例下降，同时降低了致敏的中间态的Th0细胞；此外能够促进Treg的分化，增加发挥免疫抑制作用的Treg亚群的比例。并且对血清中炎症因子水平的检测发现，H-CN治疗后血清中TNF-a、IFN-r、IL-2、IL-6及IL-17A等炎症因子的水平明显降低，而抑炎因子IL-10的水平上升，从蛋白水平进一步验证了H-CN的免疫调节作用，并最终表现为H-CN治疗后EAE小鼠的临床症状减轻、视功能明显改善。
上述结果均表明H-CN是一种具有免疫调控作用的新型生物肽，能够用于EAE等自身免疫性炎症疾病的治疗中。
2.2 H-CN治疗EAU的有效性研究
2.2.1 EAU模型的建立及分组
近交系野生型C57BL/6J小鼠雌性150只(通过种鼠自繁以充分保证同源、近交，减少实验动物个体差异)，6-8周龄，用含300μg光感受器间维生素类结合蛋白1-20(IRBP1-20)的PBS和含300μg结核分枝杆菌H37RA的完全弗氏佐剂等体积混合至200μl，充分乳化后注入小鼠大腿及尾根部皮肤，每侧大腿根50μl，尾根部100μl，同时腹腔注射含1μg百日咳毒素的PBS(200μl)。实验分5组(每组n＝6)：健康对照+PBS组、EAU+PBS组、EAU+H-CN组(10μg/μl)、EAU+H-CP组(10μg/μl)；根据EAU模型第6-8天开始出现炎症，第18-20天到达高峰的特点，于EAU免疫后第4天、第8天、第12天、第16天，给予双眼玻璃体腔注射，每眼5μl；于第26天终止实验。
2.2.2眼底临床炎症反应的评分
于建模开始(Day 0)隔日利用双目间接检眼镜联合前置镜对小鼠眼底进行观察，并根据Caspi的炎症反应分级标准进行盲法评分，动态观察各时间点各组动物病变的程度。
2.2.3视网膜脉络膜组织病理学检查
建模第20天取小鼠眼球进行石蜡切片及HE染色，光学显微镜观察、拍照：①计数玻璃体腔和视网膜前炎性细胞渗出数量；②观察视网膜各层组织病理改变，根据Caspi报道的评分标准进行评分。
2.2.4小鼠眼球/外周单核淋巴细胞亚群分析
为评估H-CN对EAU眼内及外周Th1、Th17和Treg各亚群的影响，于建模第20天分离小鼠眼球及颈部引流***内的单核淋巴细胞，利用流式细胞分析技术检测Th1(CD4+IFN-γ+IL-17A-)，Th17(CD4+IFN-γ-IL-17A+)，Treg(CD4+CD25+Fxop3+)在CD4+T细胞中所占百分比。(方法参照EAE实验部分)
2.2.5实验结果
1)H-CN改善EAU小鼠临床症状评分
IRBP1-20与CFA乳剂免疫小鼠后第10天左右开始，小鼠开始出现临床症状，最早表现为血管扩张充血，随着时间延长，逐渐出现玻璃体浑浊及视网膜，可见沿血管分布的星芒状渗出，在18-20天左右症状达到高峰，随后逐渐缓解，后期可残留网膜萎缩等。我们采用了免疫后第12天开始隔日腹腔注射联合点眼的方法治疗EAE。根据每天的临床症状观察，H-CN多肽组从第三次治疗(免疫后第16天)起，临床症状得到明显改善，临床评分与H-CP治疗组及PBS对照组均有显著差异(P<0.05)，且这种差异保持到免疫后第26天。而杂肽H-CP组小鼠的临床评分则与PBS组始终无明显差异。结果如表4所示。
表4 EAU小鼠临床评分统计
天数
PBS组
H-CP组
H-CN组
0
0±0
0±0
0±0
2
0±0
0±0
0±0
4
0±0
0±0
0±0
6
0±0
0±0
0±0
8
0±0
0±0
0±0
10
0.42±0.52
0.42±0.52
0.42±0.52
12
0.67±0.52
0.75±0.62
0.83±0.75
14
1.17±0.41
1.25±0.41
1.00±0.63
16
1.83±0.75
1.83±0.68
1.17±0.74**
18
3.00±0.89
3.00±0.63
1.83±0.75**
20
3.17±0.88
3.33±0.64
1.67±0.51**
22
2.33±0.52
2.33±0.52
1.17±0.41**
24
2.33±0.52
2.17±0.52
1.17±0.41**
26
2.17±0.52
2.17±0.52
1.17±0.41**
*表示与PBS组比P<0.05，**表示与PBS组比P<0.01，PBS组与H-CP组间评分无统计学差异
2)H-CN改善EAU小鼠眼球组织病理改变
免疫后第22天取小鼠眼球进行石蜡切片并进行HE染色，对各组视网膜脉络膜的组织病理学表现进行比较，可见PBS及杂肽H-CP治疗的EAU小鼠可及炎症浸润、血管周围炎性肉芽肿、视网膜褶皱、脉络膜新生血管及局灶性网脱等病理改变，而H-CN治疗组视网膜外层结构为受累，仅有玻璃体腔及浅层视网膜的炎症浸润，表明H-CN能够有效减轻EAU小鼠视网膜脉络膜的病理改变。
3)H-CN对EAU外周CD4+T细胞分群的影响
为评估H-CN对EAU小鼠是否与对EAE小鼠一样能够调节Th细胞亚群的改变，我们在免疫后第22天取EAU小鼠脾脏及***中的PBMC，通过流式细胞分析技术对Th亚群百分比进行分析。结果表明，EAU模型中Th0、Th1、Th17及Treg群比例均较正常小鼠明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。使用H-CN治疗后，EAU小鼠脾脏及***CD4+T细胞中Th0、Th1及Th17亚群比例显著降低，同时Treg细胞群比例显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明，与在EAE小鼠中的表现一样，H-CN同样能够调节EAU小鼠周围免疫器官中Th细胞亚群的比例，发挥免疫调节作用。
4)H-CN对EAU眼球组织CD4+T细胞分群的影响
为进一步探索H-CN对眼球中Th细胞的影响，我们取正常小鼠、EAU小鼠及EAU H-CN治疗小鼠的眼球组织提取PBMC，进行表面、细胞因子及转录因子染色后进行流式检测。并对眼球中CD4+细胞群所占比例及CD4+细胞群中各Th亚群的百分比进行统计分析。由图13可见，正常小鼠眼球中仅有微量的CD4+细胞，而EAU模型中CD4+细胞明显增多，而H-CN治疗后并不能减少眼球中CD4+T的数量。尽管如此，H-CN虽然无法减少眼球中CD4+T细胞的浸润，但可以影响其分群改变，可以有效减少Th1及Th17等促炎亚群的比例，升高Treg免疫调节亚群的比例，从而发挥免疫调节的作用。
2.2.6讨论
在本实施例2.2中，对多肽H-CN在EAU模型中的免疫调节作用进行了验证。
结果表明，与在EAE模型中的作用相一致，H-CN能够改变EAU模型外周免疫器官及眼球中Th细胞的分群，使Th0、Th1、Th17等促炎细胞群的比例下降，Treg比例升高，并使H-CN治疗后的EAE小鼠的眼部临床症状减轻、视网膜组织病理学表现减轻。
这表明，H-CN是一种具有广谱免疫调节作用的生物肽，能够作为眼部自身免疫性疾病的潜在治疗手段。
实施例3：靶向生物肽的安全性检测：
3.1体外实验
MTS细胞毒性实验CellTiter 96AQueous One Solution Cell ProliferationAssay是一种用比色法来检测细胞增殖和细胞毒实验中的活细胞数量的检测试剂，主要成分中含有一个新型的四唑化合物[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,inner salt；MTS]。
其主要工作原理是，MTS可被细胞生物还原成为一种有色的甲臜产物，溶解于培养基中，而用分光光度法在490nm出检测到的甲臜产物与活细胞的数目成正比。取对数生长期RAW264.7细胞(小鼠巨噬细胞株)和HUVEC细胞(人脐静脉内皮细胞株)，按5×10^4/ml浓度接种于96孔板，当细胞生长良好至80％左右融合时，更换无血清培养基饥饿培养24小时。将96孔板中的RAW264.7细胞和HUVEC细胞分为以下组：空白对照组；H-CN组(50,100,200,500μM)；H-CP组(50,100,200,500μM)；***DXM组(50μM)，各组设6个复孔。空白对照组各孔中加入100μl无血清DMEM培养基，余各组中每孔加入100μl含上述浓度多肽(或DXM)的无血清培养基，于37℃、5％CO2的恒温培养箱中培养24小时后，每孔加入20μl MTS溶液，放回培养箱中再孵育3小时。酶标仪设置吸光度490nm，测得各孔吸光度(optical density,OD)，并计算各组细胞相对存活率＝实验组OD/对照组OD×100％。
3.2体内实验
6-8周龄雌性C57BL/6J小鼠给予双眼玻璃体腔注射(n＝5)，左眼内注射活性肽H-CN17 10μl(10μg/μl)作为实验眼，右眼内注射PBS 10μl作为对照眼，利用活体显微镜动态观察注射后双眼角膜及晶体混浊情况；注射后第7日摘取双眼眼球，利用HE染色及透射电镜检查，对视网膜结构形态及光感受器细胞、双极细胞和神经节细胞结构进行观察；利用视网膜电生理检查对大鼠注射前(第0日)和注射后(第7日)ERG的改变进行研究。
3.3实验结果
1)活性肽对细胞活力的影响
通过RAW264.7细胞和HUVEC细胞的MTS细胞活力测定实验对H-CN的细胞毒性进行初步探索，结果表明不同浓度(最高达500uM)的H-CN处理对细胞活性均无明显影响，提示H-CN具有一定的生物安全性。实验结果如图14所示。
2)活性肽对小鼠视网膜结构、功能的影响：通过视网膜切片电镜扫描及HE染色结果，表明H-CN对小鼠视网膜结构无影响；而ERG及VEP检测结果则表明H-CN对小鼠视功能无影响。实验结果如图15所示。
上述结果表明H-CN玻璃体腔注射的安全性。
3.4讨论
在本实施例中，对多肽H-CN体内外应用的安全性进行了探讨。
结果表明，H-CN无细胞毒性、玻璃体腔注射对眼球结构功能无影响，初步验证了其生物安全性，为其临床转化提供了依据。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海市第一人民医院
<120> 抑制眼部自身免疫性炎症反应的靶向生物肽的筛选及应用
<130> P2019-0205
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser
1 5 10 15
Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu
20
<210> 2
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro
1 5 10 15
Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu Val
20 25 30
Arg Tyr Glu
35
<210> 3
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro
1 5 10 15
Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu Val
20 25 30
Arg Tyr
<210> 4
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser
1 5 10 15
Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro
20 25
<210> 5
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu
1 5 10 15
Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu
20 25
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr
1 5 10 15
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr
1 5 10
<210> 8
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
Ser Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro
1 5 10