阅读说明：本技术 从棕色扁海绵中提取的环肽类化合物及其制备方法与用途 (Cyclic peptide compound extracted from Phakellia fusca and preparation method and application thereof ) 是由 林厚文 王淑萍 吴莹 颜益珍 孙凡 刘丽云 于 2019-02-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种从棕色扁海绵中提取的环肽类化合物,化学结构式如下：<Image he="642" wi="700" file="DDA0001978188820000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>本发明的环肽类化合物制备方法简单,对HePG2细胞抑制活性显著。本发明为研究和开发新抗肿瘤药物提供了新的先导化合物,为开发利用我国海洋药用资源提供了科学依据。(The invention discloses a cyclic peptide compound extracted from Phakellia fusca, which has the following chemical structural formula: the cyclic peptide compound provided by the invention is simple in preparation method and has obvious inhibitory activity on HePG2 cells. The invention provides a new lead compound for researching and developing new anti-tumor drugs and provides scientific basis for developing and utilizing marine medicinal resources in China.)

从棕色扁海绵中提取的环肽类化合物及其制备方法与用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种从棕色扁海绵中提取的环肽类化合物及其制备方法与用途。

背景技术

海绵是生物活性肽的丰富来源，包括线性肽、缩酚酸肽和环肽。海绵来源的环肽因其结构的多样性、优异的稳定性和有效的生物活性被广泛研究。近年来，肽作为治疗剂越来越受到关注，超过60种肽药物已经进入市场，并且数百种新型治疗肽正处于临床前和临床开发阶段，如已被FDA批准用于疼痛治疗的海洋肽ziconotide和用于癌症治疗的dolastatin衍生的药物因此，海洋衍生肽已成为天然产物化学家的研究热点。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种从棕色扁海绵中提取的环肽类化合物。

本发明的第二个目的是提供一种所述从棕色扁海绵中提取的环肽类化合物的制备方法。

本发明的第三个目的是提供一种所述从棕色扁海绵中提取的环肽类化合物在制备抗肿瘤药物中应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一个方面提供了一种从棕色扁海绵中提取的环肽类化合物，是从中国西沙群岛附近海域采集的海洋无脊椎动物棕色扁海绵Phakellia fusca中分离得到的一种新的环肽类化合物，其分子式为C₃₉H₅₃N₇O₈，其化学结构式如下：

本发明的第二个方面提供了一种所述从棕色扁海绵中提取的环肽类化合物的制备方法，包括以下步骤：

将棕色扁海绵Phakellia fusca粉碎，用浓度为95％的乙醇渗漉提取8次，合并提取液后减压浓缩，浓缩得到提取液；棕色扁海绵Phakellia fusca溶于乙醇的浓度为0.02～0.04g/mL；

将提取液用等体积乙酸乙酯萃取三次，得到乙酸乙酯层浸膏；将乙酸乙酯层浸膏混悬于浓度为90％的甲醇水溶液中，用等体积石油醚萃取三次，下层溶液合并后加水稀释，用等体积的二氯甲烷萃取三次，合并萃取液并减压浓缩得到二氯甲烷层浸取液；

将上述二氯甲烷层浸取液通过Sephadex LH-20凝胶柱层析，用50％的CH₂Cl₂-MeOH洗脱剂洗脱，并采用质谱定位追踪的方式，将大分子量的化合物富集，然后采用ODS中压柱色谱分离，用MeOH/H₂O梯度洗脱，采用质谱追踪定位分析，获得含有大分子量的环肽类化合物的精细馏分，最终采用质谱导向的半制备高效液相色谱法对馏分进行分离，得到所述环肽类化合物。

本发明的第三个方面提供了一种所述从棕色扁海绵中提取的环肽类化合物在制备抗肿瘤药物中应用，所述肿瘤为肝癌。

本发明的第四个方面提供了一种药物组合物，是以所述环肽类化合物作为活性成分。

本发明的环肽类化合物能对人肝癌细胞HePG2显示出很强的抑制活性，与肿瘤的增值和凋亡都具有密切的关系，因此可用于制备抗肿瘤药物。

由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：

本发明的药源材料棕色扁海绵属(Phakellia fusca)寻常纲(Demospongiae)软海绵目(Halichondrid)轴海绵科(Axinellidae)海绵，本发明提供的环肽类化合物，是从中国西沙群岛附近海域采集的海洋无脊椎动物棕色扁海绵Phakellia fusca中分离到。本发明的环肽类化合物制备方法简单，对HePG2细胞抑制活性显著。本发明为研究和开发新抗肿瘤药物提供了新的先导化合物，为开发利用我国海洋药用资源提供了科学依据。

附图说明

图1是本发明的环肽类化合物的MS/MS碎片检测图。

图2是本发明的环肽类化合物通过LC-MS的高级Marfey’s分析图。

图3是本发明的环肽类化合物在不同浓度下对HePG2细胞抑制率曲线图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

本发明是从中国西沙群岛附近海域采集的海洋无脊椎动物棕色扁海绵Phakelliafusca中分离得到的一种新的具有抑制HePG2细胞毒性的环肽类化合物。

实施例1

制备本发明的环肽类化合物：

将从中国西沙群岛附近海域采集的海洋无脊椎动物棕色扁海绵Phakellia fusca(干重4.1kg)粉碎，用浓度为95％的乙醇(120L)渗漉提取8次，合并提取液后减压浓缩，回收乙醇，浓缩得到提取液。

将提取液用等体积乙酸乙酯萃取三次，得到乙酸乙酯层浸膏(124.3g)。将乙酸乙酯层浸膏混悬于浓度为90％的甲醇水溶液(1L)中，用等体积石油醚萃取三次，下层溶液合并后加水600mL稀释，用等体积的二氯甲烷萃取三次，合并萃取液并减压浓缩得到二氯甲烷层浸取液(41.5g)。

将上述二氯甲烷层浸取液41.5g通过Sephadex LH-20凝胶柱层析，用50％的CH₂Cl₂-MeOH洗脱剂洗脱，并采用质谱定位追踪的方式，将大分子量的化合物进行富集得23.1g。采用ODS中压柱色谱分离，用MeOH/H₂O梯度(10％-100％，450min)洗脱，采用质谱追踪定位分析，获得含有大分子量的环肽类化合物的精细馏分；最终采用质谱导向的半制备高效液相色谱法对馏分进行分离(15％乙腈水，流速2.0mL/min，在正模式下分子离子为748.4下检测)，得到本发明的环肽类化合物，其分子式为C₃₉H₅₃N₇O₈，其化学结构式如下：

本发明的环肽类化合物的理化性质和核磁共振数据如下：

化合物C₃₉H₅₃N₇O₈：淡黄色无定型粉末；[α]²⁵ _D-97.8(c 0.90,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)205(4.37)nm；IR(ATR)ν_max 3279,3061,2956,2931,2874,1714,1634,1523,1438,1371,1318,1242,1158,1043,1026,922,823,751,701cm^-1；¹H and ¹³C NMR数据如表1所示，ESIMS/MS数据如图1所示；HRESIMS m/z 748.4034[M+H]⁺(calcd for C₃₉H₅₃N₇O₈,747.3956)，核磁共振谱数据见表1。

表1：环肽类化合物C₃₉H₅₃N₇O₈的核磁共振谱数据(CDCl₃)

7个氨基酸残基的连接顺序，通过分析HMBC和ROESY相关信号及ESI-MS/MS确定。HMBC相关信号Leu-NH/Val-CO、Val-NH/Phe-CO、Phe-NH/Asp-CO和Asp-NH/Pro³-CO确定了结构片段Pro³-Asp-Phe-Val-Leu的存在。结合ROESY相关信号Pro³-Hα/Pro²-Hα、Pro¹-Hα/Pro²-Hα和Pro¹-Hδ/Leu-Hα，确定该环肽类化合物的结构为cyclo-(Pro¹-Pro²-Pro³-Asp-Phe-Val-Leu)(如图2所示，图2是本发明的环肽类化合物通过LC-MS的高级Marfey’s分析图，不同离子的选择提取离子图，从图中可以看出，a是m/z 410、b是m/z 426、c是m/z 460、d是m/z428、e是m/z 412，a中14.33处是本发明的环肽类化合物，15.95处为标准品峰；b中17.15处是本发明的环肽类化合物，19.12处为标准品峰；c中17.25处是本发明的环肽类化合物，18.71处为标准品峰；d中12.48处是本发明的环肽类化合物，13.19处为标准品峰；e中16.06处是本发明的环肽类化合物，18.28处为标准品峰)。七个氨基酸残基和一个大环共计16个不饱和度，而本发明的环肽类化合物有17个不饱和度，说明存在一个额外环。另外Phe-Hα同Asp-γ-CO之间存在HMBC相关，以及苯丙氨酸氨基氢质子信号缺失，说明天冬氨酸的游离羧基和苯丙氨酸的氨基之间形成酰胺键，即组成了2,5-二酮-吡咯烷五元环。这意味着本发明的环肽类化合物是一个有双环系统的独特环七肽。通过ESI-QTOF-MS/MS质谱分析发现，b系碎片离子峰：m/z 649、503、405、308和211，对应母离子依次丢失Val、Phe、Asp、Pro和Pro这些中性分子的碎片离子峰；相应地，y系碎片离子峰：m/z 635、538、441、344和246，对应母离子依次丢失Leu、Pro、Pro、Pro和Asp，这证实了该环肽的NMR结构解析结果，如图1所示，图1是本发明的环肽类化合物的MS/MS碎片检测图。

各氨基酸残基的绝对构型通过高级Marfey法确定，如图2所示。本发明的环肽类化合物(0.1mg)用6N的盐酸在110℃下水解12h后用L-FDLA衍生化，相应的L-氨基酸标准品用D/L-FDLA衍生化，得到的衍生物用UPLC-ESI-QTOF-MS分析，通过比较样品中各个氨基酸衍生物同标准品衍生物的保留时间来确定绝对构型。氨基酸标准品衍生物的保留时间如下：L-Pro 14.33min，D-Pro 15.95min；L-Leu 17.15min，D-Leu 19.12min；L-Phe 17.24min，D-Phe 18.71min；L-Asp 12.48min，D-Asp 13.19min；L-Val 16.06min，D-Val 18.28min。分析结果表明，该环七肽中的所有氨基酸残基均为L-构型。

实施例2

体外抗肿瘤活性实验

对本发明的环肽类化合物C₃₉H₅₃N₇O₈进行了体外细胞毒活性实验，样品用DMSO溶解，低温保存，DMSO在最终体系中的浓度控制在不影响检测活性的范围之内，倍比稀释为1-100μg/mL的工作浓度。取对数生长期人肝癌细胞HePG2，用含10％小牛血清的DMEM培养液，制成单细胞悬液1×10⁶个/mL，将该悬液加到96孔板中，每孔加入100μL。于5％CO₂，37℃培养箱中培养24h后，分别加入受试药物(本发明的环肽类化合物C₃₉H₅₃N₇O₈和阳性对照药顺铂)，使其终浓度分别为0.03,0.10,0.30,1.0,3.0,10μM，每个样品均设3个复孔，阴性对照为等体积培养基及相应的DMSO浓度为溶媒对照，以消除DMSO对细胞生长的影响，阳性对照药为顺铂cisplatin。于5％CO₂，37℃培养箱中培养72h后，每孔加入10μL CKK8溶液，继续培养4h后，在450nm处测定各孔吸光值(OD值)。通过运用线性回归方法确定抑制百分数，进而计算出IC₅₀值。一般情况下，每个样品在测试中均设置复孔(n＝3)，在结果中以标准偏差(SD)表示。本发明的环肽类化合物对HePG2细胞不同浓度的抑制率和半数有效抑制浓度IC₅₀值如图3所示，图3是本发明的环肽类化合物在不同浓度下对HePG2细胞抑制率曲线图。

IC₅₀值和本发明的环肽类化合物对HePG2细胞不同浓度的抑制率的数据如表2所示：

表2.化合物C₃₉H₅₃N₇O₈在不同浓度下对HePG2细胞的抑制率和半数有效抑制浓度IC₅₀值(μM)(n＝3)

由图3可见，本发明的环肽类化合物对HePG2细胞有显著的抑制活性，IC₅₀值为4.6±0.05μM，与阳性药顺铂cisplatin(4.2±0.04μM)药效相当，因此可用于制备抗肿瘤药物。本发明为研制新的抗肿瘤药物提供了新的先导化合物。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。