一种速溶胶原蛋白微针及其制备方法
阅读说明：本技术 一种速溶胶原蛋白微针及其制备方法 (Instant collagen microneedle and preparation method thereof ) 是由 肖建喜 李文华 于 2021-03-25 设计创作，主要内容包括：本发明属于护肤品领域,具体涉及一种速溶胶原蛋白微针及其制备方法。所述胶原蛋白微针包括重组胶原蛋白/动物胶原蛋白和透明质酸,所述重组胶原蛋白/动物胶原蛋白和透明质酸的混合物溶液制备获得的胶原蛋白微针成型性和溶解性良好；所述胶原蛋白微针还具有良好的微针形貌,针体力学性能优良,能够刺穿皮肤角质层；针体在插入皮肤后能够快速溶解,实现胶原蛋白的高效递送,促进胶原蛋白的吸收,帮助修复受损肌肤；所述胶原蛋白微针制备方法简单,制备过程中很好的保持了胶原蛋白的生物活性,制备工艺适于规模化生产。(The invention belongs to the field of skin care products, and particularly relates to an instant collagen microneedle and a preparation method thereof. The collagen microneedle comprises recombinant collagen/animal collagen and hyaluronic acid, and the collagen microneedle prepared from the mixture solution of the recombinant collagen/animal collagen and the hyaluronic acid has good formability and solubility; the collagen microneedle also has good microneedle appearance, the needle body has excellent mechanical property, and can pierce the stratum corneum; the needle body can be quickly dissolved after being inserted into the skin, so that the high-efficiency delivery of collagen is realized, the absorption of the collagen is promoted, and the damaged skin is helped to be repaired; the preparation method of the collagen microneedle is simple, the bioactivity of the collagen is well kept in the preparation process, and the preparation process is suitable for large-scale production.)
技术领域
本发明属于护肤品领域，具体涉及一种速溶胶原蛋白微针及其制备方法。
背景技术
胶原蛋白是人体含量最多的蛋白质，约占人体蛋白质总量的30％。作为主要的结构蛋白，胶原蛋白形成一个分子支架，为人体提供机械强度和结构完整性，支持和保护柔软组织和内部器官。胶原蛋白同时具有高生物活性，参与大量细胞外基质的相互作用，与细胞再生、伤口愈合等有非常密切的关系。胶原蛋白具有生物相容性、生物降解性、生物吸收性等优点，因此在化妆品、医疗器械等领域应用广泛。
胶原蛋白是皮肤的主要结构成分，皮肤中胶原蛋白纤维的降解、断裂、塌陷、流失会造成皱纹、痤疮、暗黄等皮肤问题；同时，胶原蛋白纤维网络为成纤维细胞提供良好的生长环境，而其过度降解则会影响成纤维细胞表达胶原蛋白，导致胶原蛋白的进一步缺失，加速皮肤的衰老。因此，胶原蛋白是护肤品中最常用的添加剂之一，然而，胶原蛋白作为较大分子量的蛋白质，如何促进胶原蛋白被皮肤吸收，一直是胶原蛋白护肤品中的关键问题。
微针是一种经皮给药装置，是指通过微纳加工技术制作的、尺寸在微米级的微型针尖结构，其由具有一定厚度的方形、圆形或眼膜形状的贴片底座和锥形针尖结构两部分组成。可溶微针是一种采用微米级的针尖阵列刺穿皮肤角质层，将药物输送到体内的物理促渗技术。由于微针只刺穿皮肤角质层，没有触及到皮下组织及神经，实现表皮给药，能够降低对皮肤皮下组织及神经的损伤，具有无痛、精确、高效、便利等给药优点。可溶微针的制备要求非常严苛，不仅要求具有微针的精细形貌，而且要求微针针尖具有良好的力学性能支撑其刺破表皮层，同时针尖在刺入皮肤后能快速溶解。由于重组胶原蛋白存在成型性较差、动物胶原蛋白存在溶解性较差等缺陷，目前尚不能利用重组胶原蛋白或动物胶原蛋白成功制备胶原蛋白微针。
本发明意外发现，在重组胶原蛋白中加入一定比例的透明质酸，可以制备成型性良好的重组胶原蛋白微针，所述的重组胶原蛋白微针具有良好的微针形貌和力学性能；同时本发明发现，在动物胶原蛋白中加入一定比例的透明质酸，制备获得的动物胶原蛋白微针不仅具有良好的微针形貌和针体力学性能，而且所述微针的针体在插入皮肤后能够快速溶解。本发明技术方案解决了重组胶原蛋白/动物胶原蛋白难以制备微针的问题，制备获得的重组胶原蛋白/动物胶原蛋白微针既具有良好的微针形貌和针体力学性能，又能在插入皮肤后快速溶解，实现胶原蛋白的高效递送，促进胶原蛋白的吸收，修复受损肌肤；同时所述胶原蛋白微针制备方法简单，制备过程中很好的保持了胶原蛋白的生物活性，且制备工艺适于规模化生产。
发明内容
首先，针对现有技术中存在的重组胶原蛋白成型性较差、动物胶原蛋白溶解性较差等缺陷，难以制备可溶胶原蛋白微针的问题，本发明将重组胶原蛋白/动物胶原蛋白与透明质酸以一定比例混合，成功制备了成型性良好且能快速溶解的胶原蛋白微针。具体包括以下内容：
第一方面，本发明提供了一种用于制备胶原蛋白微针的原料液，所述原料液包括重组胶原蛋白/动物胶原蛋白溶液与透明质酸溶液。
优选地，所述原料液包括浓度比为0.01-30mg/ml：5-30mg/ml重组胶原蛋白与透明质酸。
优选地，所述原料液包括浓度比为0.01-0.7mg/ml：5-30mg/ml动物胶原蛋白与透明质酸。
优选地，所述动物胶原蛋白为牦牛胶原蛋白。
优选地，所述原料液还包括化妆品可接受的功效成分，和/或化妆品可接受的辅助原料。
优选地，所述化妆品可接受的功效成分包括烟酰胺、积雪草提取液、野菊花提取液、牡丹提取液、芦荟提取液、马齿苋提取液、玫瑰纯露、茶树纯露、尿囊素、水杨酸中的任一种或几种。
优选地，所述化妆品可接受的辅助原料包括葡萄糖、可溶淀粉、乳糖、硫酸软骨素、羧甲基纤维素Ⅳ、羧甲基纤维素钠、壳聚糖、聚乙二醇、聚乙烯醇、PVP、麦芽糖、海藻酸钠、聚乳酸、聚乙醇酸中的任一种或几种。
第二方面，本发明提供了一种由上述第一方面所述的原料液制备获得的胶原蛋白微针。
第三方面，本发明提供了一种上述第二方面所述胶原蛋白微针在制备化妆品、医学美容产品中的应用。
第四方面，本发明提供了一种上述第三方面所述胶原蛋白微针的制备方法，所述方法包括：
(1)微针原料液的制备：65℃-85℃下，将透明质酸加热溶解后真空干燥脱泡；降温至25℃以下，加入胶原蛋白溶液，真空干燥脱泡，得微针原料液；
(2)胶原蛋白微针的制备：将步骤(1)所述微针原料液加入到微针模具中，25℃以下真空干燥脱泡，固化，脱模，即得胶原蛋白微针。
优选地，所述胶原蛋白溶液为动物胶原蛋白溶液，所述步骤(1)为：65℃-85℃下，将透明质酸加热溶解后真空干燥脱泡；降温至25℃以下，加入动物胶原蛋白溶液后均质，真空干燥脱泡，得微针原料液。
优选地，所述动物胶原蛋白为牦牛胶原蛋白。
第五方面，本发明提供了一种胶原蛋白微针，所述胶原蛋白微针包括以下重量百分比的组份：重组胶原蛋白0.04-86％wt，透明质酸14％-99.96％wt。
优选地，所述胶原蛋白微针还包括化妆品可接受的功效成分，和/或化妆品可接受的辅助原料。
优选地，所述化妆品可接受的功效成分包括烟酰胺、积雪草提取液、野菊花提取液、牡丹提取液、芦荟提取液、马齿苋提取液、玫瑰纯露、茶树纯露、尿囊素、水杨酸中的任一种或几种。
优选地，所述化妆品可接受的辅助原料包括葡萄糖、可溶淀粉、乳糖、硫酸软骨素、羧甲基纤维素Ⅳ、羧甲基纤维素钠、壳聚糖、聚乙二醇、聚乙烯醇、PVP、麦芽糖、海藻酸钠、聚乳酸、聚乙醇酸中的任一种或几种。
第六方面，本发明提供了一种上述第五方面所述胶原蛋白微针在制备化妆品、医学美容产品中的应用。
第七方面，本发明提供了一种胶原蛋白微针，所述胶原蛋白微针包括以下重量百分比的组份：动物胶原蛋白0.03-12％wt，透明质酸88％-99.96％wt。
优选地，所述动物胶原蛋白为牦牛胶原蛋白。
优选地，所述胶原蛋白微针还包括化妆品可接受的功效成分，和/或化妆品可接受的辅助原料。
优选地，所述化妆品可接受的功效成分包括烟酰胺、积雪草提取液、野菊花提取液、牡丹提取液、芦荟提取液、马齿苋提取液、玫瑰纯露、茶树纯露、尿囊素、水杨酸中的任一种或几种。
优选地，所述化妆品可接受的辅助原料包括葡萄糖、可溶淀粉、乳糖、硫酸软骨素、羧甲基纤维素Ⅳ、羧甲基纤维素钠、壳聚糖、聚乙二醇、聚乙烯醇、PVP、麦芽糖、海藻酸钠、聚乳酸、聚乙醇酸中的任一种或几种。
第八方面，本发明提供了一种上述第七方面所述胶原蛋白微针在制备化妆品、医学美容产品中的应用。
本发明的有益效果是：
(1)本发明发现，在重组物胶原蛋白中加入一定比例的透明质酸，制备的重组胶原蛋白微针成型性良好，解决了重组胶原蛋白成型性较差难以制备可溶微针的问题；制备的重组胶原蛋白微针具有良好的微针形貌，并且针体力学性能优良，能刺穿皮肤角质层；所述微针的针体在插入皮肤后能快速溶解，实现胶原蛋白的高效递送，促进胶原蛋白的吸收，修复受损肌肤；
(2)本发明发现，在动物胶原蛋白中加入一定比例的透明质酸，制备的动物胶原蛋白微针能快速溶解，解决了动物胶原蛋白溶解性差难以制备可溶微针的问题；制备的动物胶原蛋白微针具有良好的微针形貌，并且针体力学性能优良，能刺穿皮肤角质层；所述微针的针体在插入皮肤后能快速溶解，实现胶原蛋白的高效递送，促进胶原蛋白的吸收，修复受损肌肤；
(3)本发明所述方法简单，制备过程中很好的保持了胶原蛋白的生物活性，制备工艺适于规模化生产；
(4)透明质酸是皮肤中的有益成分，能快速填充皮肤微小缺陷，帮助表皮结构保持水分；同时，所述针体中还可加入化妆品可接受的功效成分，通过针体的快速溶解递送至真皮层中被快速吸收，起到补充肌肤营养、修复受损肌肤、促进血液循环等功效。
(5)本发明所述微针中可添加化妆品可接受的其他功效成分，使微针具有多种美容功效。
附图说明
图1重组胶原蛋白微针的SEM图和显微镜显微观察图
图2立式荧光显微镜明场通道观察重组胶原蛋白微针的溶解效果；
图3重组胶原蛋白微针的琼脂糖凝胶垫扩散正面图；
图4重组胶原蛋白微针的琼脂糖凝胶垫扩散侧面图；
图5刚果红标记的重组胶原蛋白微针穿刺猪皮后的猪皮组织H&E染色图；
图6动物胶原蛋白微针的SEM图；
图7立式荧光显微镜明场通道观察动物胶原蛋白微针的溶解效果。
具体实施方式
以下具体结合实施例进一步描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
以下实施中所述的重组胶原蛋白是利用转基因技术和基因重组技术在动物、植物或者微生物表达体系中获得的胶原蛋白。以下实施例中所述的重组胶原蛋白为大肠杆菌发酵获得的重组胶原蛋白，但不局限于上述方法，也可以为其他方法制备的重组胶原蛋白，包括毕赤酵母发酵的重组胶原蛋白、重组人源胶原蛋白等。
以下实施例所述重组胶原蛋白参照文献(He M,Zhang Y,Munyemana J C,etal.Tuning the hierarchical nanostructure of hematite mesocrystals viacollagen-templated biomineralization[J].Journal of Materials Chemistry B,2017,5(7):1423-1429.)制备获得。但是本发明并不局限于上述方法制备获得的重组胶原蛋白，其他任何方法制备获得的重组胶原蛋白均适用本发明所述用于制备重组胶原蛋白微针的技术方案，因此，任何方法制备获得的重组胶原蛋白均在本发明的保护范围之内。
以下实施例中所述的动物胶原蛋白以牦牛胶原蛋白为例，但不局限于牦牛胶原蛋白；所述的牦牛胶原蛋白是通过酶解法从牦牛肌腱中提取纯化得到的胶原蛋白。
本发明所述的微针由具有一定厚度的方形、圆形或眼膜形状的贴片底座和锥形针尖结构两部分组成，贴片底座和针尖结构一体连接，且通过模具法制备，所述模具为PDMS阴模，其阵列特征为：针长800μm，针底部直径为225μm，针尖距离650μm，数量阵列20×20。
以下实施例中所述的胶原蛋白微针成型性判断标准：微针是否能从模具上完整的拿下来，且拿下来后肉眼观察是否规整，针尖是否整齐排布；胶原蛋白微针可溶性判断标准：微针针体在2min内是否完全溶解。
实施例1
称取透明质酸，加入定量水，配成浓度为：1、5、10、15、20、25、30mg/ml的透明质酸溶液；将溶液搅拌至没有肉眼可见粉末结块物质后，将其放入真空干燥箱加热至80℃，恒温30min；取出后再次搅拌均匀，放入真空干燥箱中，保持-50kPa真空度，55℃，干燥脱泡12h后取出；冷却后加入重组胶原蛋白至其最终浓度为：0.5mg/ml，搅拌均匀后再次放入真空干燥箱，-50kPa真空度，25℃恒温干燥脱泡12h，得到微针原料溶液。
取一定量的微针原料溶液加入PDMS模具，放入真空干燥箱中，-50kPa真空度25℃恒温干燥脱泡，每隔4h恢复大气压，重复两次，脱泡8h后，再次加入相同体积的微针原料溶液，重复上述操作真空干燥脱泡3次，直至微针干燥，脱模得重组胶原蛋白微针。
不同浓度的透明质酸1mg/ml-35mg/ml与0.5mg/ml重组胶原蛋白的微针效果如表1所示。结果表明，透明质酸的浓度为5mg/ml-30mg/ml，重组胶原蛋白的浓度为0.5mg/ml时，即透明质酸与重组胶原蛋白浓度比为10-60:1时，重组胶原蛋白和透明质酸能够混合形成溶液，该原料液制备的微针成型性好，并可在水中快速溶解。
表1不同浓度的透明质酸与0.5mg/ml重组胶原蛋白的微针效果
注：“速溶”指微针在水中2min内快速溶解成溶液状态
实施例2
称取透明质酸，加入定量水，配成浓度为15mg/ml的透明质酸溶液；将溶液搅拌至没有肉眼可见粉末结块物质后，将其放入真空干燥箱加热至65℃，恒温30min；取出后再次搅拌均匀，放入真空干燥箱中，保持-50kPa真空度，55℃，干燥脱泡12h后取出；冷却后加入重组胶原蛋白使重组胶原蛋白最终浓度为：0.01、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、5.0、10.0、20.0、30.0mg/ml，搅拌均匀后再次放入真空干燥箱，-50KPa真空度，20℃恒温干燥脱泡12h，得到微针原料溶液。
取一定量的微针原料溶液加入PDMS模具，放入真空干燥箱中，-50kPa真空度20℃恒温干燥，每隔4h重复恢复大气压，重新抽真空操作，脱泡8h后，再次加入相同体积的微针原料溶液，重复上述操作真空干燥脱泡3次，直至微针干燥，脱模得重组胶原蛋白微针。
不同浓度的重组胶原蛋白0.01mg/ml-30.0mg/ml与15mg/ml透明质酸的微针效果如表2所示。结果表明，重组胶原蛋白0.01mg/ml-30.0mg/ml，透明质酸的浓度为15mg/ml时，即透明质酸与重组胶原蛋白浓度比为0.5-1500:1时，重组胶原蛋白和透明质酸能够混合形成溶液，该原料液制备的微针成型性好，并可在水中快速溶解。
表2不同浓度的重组胶原蛋白与15mg/ml透明质酸的微针效果
注：“速溶”指微针在水中2min内快速溶解成溶液状态
实施例3
根据实施例1、实施例2的实验结果，在本实施例中探究透明质酸浓度极值和重组胶原蛋白极值浓度条件下的微针成型、溶解情况。称取透明质酸，加入定量水，配成浓度为5mg/ml和30mg/ml的透明质酸溶液；将溶液搅拌至没有肉眼可见粉末结块物质后，将其放入真空干燥箱加热至65℃，恒温30min；取出后再次搅拌均匀，放入真空干燥箱中，保持-50kPa真空度，55℃，干燥脱泡12h后取出；冷却后向30mg/ml透明质酸组加入重组胶原蛋白至其浓度为30mg/ml，向5mg/ml透明质酸组加入重组胶原蛋白至其浓度为0.01mg/ml搅拌均匀后再次放入真空干燥箱，-50kPa真空度，20℃恒温干燥脱泡12h，得到微针原料溶液。
取定量微针原料溶液加入PDMS模具，放入真空干燥箱中，-50kPa真空度20℃恒温干燥，每隔4h重复恢复大气压，重新抽真空操作，脱泡8h后，再次加入相同体积的微针原料溶液，重复上述操作真空干燥脱泡3次，直至微针干燥，脱模得重组胶原蛋白微针。
透明质酸复合重组胶原蛋白极值浓度点的结果如表3所示。结果表明，重组胶原蛋白为浓度上限30mg/ml，透明质酸为浓度上限30mg/ml时，重组胶原蛋白和透明质酸能够混合形成溶液，该原料液制备的微针成型性好，并可在水中快速溶解，胶原蛋白为浓度下限0.01mg/ml，透明质酸为浓度下限5mg/ml时，可以得到同样的结果。
表3边界浓度重组胶原蛋白与透明质酸的微针效果
注：“速溶”指微针在水中2min内快速溶解成溶液状态
实施例4
1.重组胶原蛋白微针的制备
称取透明质酸，加入定量水，配成浓度为5mg/ml、15mg/ml的透明质酸溶液；将溶液搅拌至没有肉眼可见粉末结块物质后，将其放入真空干燥箱加热至75℃，恒温30min；取出后再次搅拌均匀，放入真空干燥箱中，保持-50Kpa真空度，55℃，干燥脱泡12h后取出，冷却；设置两组，一组向5mg/ml透明质酸溶液组加入FITC标记的重组胶原蛋白至其浓度为0.01mg/ml、另一组向15mg/ml透明质酸溶液组加入FITC标记的重组胶原蛋白至其浓度为0.5mg/ml，搅拌均匀后再次放入真空干燥箱，-50kPa真空度，20℃恒温干燥脱泡12h，所得到微针原料溶液。
取定量微针原料溶液加入PDMS模具，放入真空干燥箱中，-50kPa真空度20℃恒温干燥，每隔4h重复恢复大气压，重新抽真空操作，脱泡8h后，再次加入相同体积的微针原料溶液，重复上述操作真空干燥脱泡3次，直至微针干燥，脱模得重组胶原蛋白微针。
2.重组胶原蛋白微针性能测定
(1)重组胶原蛋白微针SEM检测
检测过程：将5mg/ml透明质酸-0.01mg/ml重组胶原蛋白微针通过导电胶贴合到样品台上，在其表面通过真空镀金30s的方法使其表面均匀分布一层导电层，使用场发射扫描电子显微镜在同样选区内不同放大倍数下获得SEM图。
结果如图1(A)和(B)所示，单个微针针尖具有针尖的形状，微针大小与设计大小相同，多个针尖在横、纵方向上具有均匀的分布，具有相同的高度和针尖直径，是理想的微针形状，表明其具有能够在皮肤形成均匀通道的潜力。
(2)重组胶原蛋白微针的正置显微镜荧光场观察重组胶原蛋白分布
检测过程：将微针放置在载玻片上，在Nikon-ECLIPSE 80i/DS-Ri2/NIS-ElementsD成像系统的明场条件下观察微针形状和分布状态，后转换到激发波长为460nm-550nm的荧光激发条件下进行激发，在4×条件下拍摄照片。取微针中一排针尖在明场通道下进行4×、10×放大倍数下照片的拍摄。
结果如图1(C)所示，通过FITC标记重组胶原蛋白且通过透析方法去除掉未与重组胶原蛋白结合的FITC分子后，与透明质酸复合制备的重组胶原蛋白微针在荧光通道下观察到均匀分布的绿色荧光(FITC自身荧光)，且荧光强度均一，说明重组胶原蛋白是均匀的分布在微针中。通过在明场通道下观察，结果如图1(D)所示，所述微针的单个针尖均为锥形结构。
(3)重组胶原蛋白微针针体的溶解结果
实验过程：将单排的针尖阵列在Nikon-ECLIPSE 80i/DS-Ri2/NIS-ElementsD成像系统的明场条件下观察微针形状和分布状态，进行4×、10×放大倍数下照片的获得。取大小适中的猪皮，将通过均匀外力贴合到猪皮表面，开始计时，在3min后取下并得到单排针尖阵列，在Nikon-ECLIPSE 80i/DS-Ri2/NIS-ElementsD成像系统的明场通道下进行观察对比。
通过明场立体显微镜观察对比微针中使用前后的针体的溶解情况，结果如图2所示，Nikon-ECLIPSE 80i/DS-Ri2/NIS-ElementsD成像系统从侧面观察重组胶原蛋白微针的针体，在使用前针体结构完整，使用3min后，针体完全溶解，说明本发明制备的重组胶原蛋白微针溶解性良好，在使用过程中能够完全溶解。
(4)琼脂糖凝胶垫的微针扩散实验
用0.1％刚果红标记微针，提前制备琼脂糖凝胶垫，从0min起通过均匀外力使微针与琼脂糖接触并开始计时，以5min为时间间隔单位记录正面与侧面红色扩散情况，共观察30min，通过均匀分布在微针内刚果红染料的扩散情况来表征微针的溶解扩散能力。
结果如图3和图4所示，从侧面(图3)可以看出，刚果红标记的重组胶原蛋白微针在琼脂糖凝胶垫上进行了扩散；从正面(图4)可以看出，刚果红标记的重组胶原蛋白微针在琼脂糖凝胶垫上放置30min取下微针后，刚果红标记的重组胶原蛋白已扩散进入琼脂糖凝胶垫内。即，本发明所述的重组胶原蛋白微针中的重组胶原蛋白可有效渗入皮肤。
(5)刚果红标记的重组胶原蛋白微针穿刺实验
将0.1％刚果红标记的重组胶原微针贴合在猪皮表面，进行透皮实验，15min后取下重组胶原微针，将猪皮组织通过冷冻切片的方法处理成厚度为10μm、15μm的组织切片，通过H&E染色在立式荧光显微镜明场条件下进行观察。
结果如图5所示，本发明所述的重组胶原微针能够刺破猪皮表层，力学性能良好。
实施例5
动物胶原蛋白微针的制备：称取透明质酸，加入定量水，配成浓度为15mg/ml的透明质酸溶液；将溶液搅拌至没有肉眼可见粉末结块物质后，将其放入真空干燥箱加热至65℃，恒温30min；取出后再次搅拌均匀，放入真空干燥箱中，保持-50kPa真空度，55℃，干燥脱泡12h后取出；冷却后分别加入不同浓度的牦牛胶原蛋白溶液得到牦牛胶原蛋白最终浓度为：0.01、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、2.0mg/ml的储备液，搅拌均匀后控制温度低于25℃，通过高速剪切均质乳化机进行均质，均质后将混合液再次放入真空干燥箱，-50kPa真空度，20℃恒温干燥脱泡12h，得到微针原料溶液。
取定量微针原料溶液加入PDMS模具，放入真空干燥箱中，-50kPa真空度20℃恒温干燥，每隔4h重复恢复大气压，重新抽真空操作，脱泡8h后，再次加入相同体积的微针原料溶液，重复上述操作真空干燥脱泡3次，直至微针干燥，脱模得动物胶原蛋白微针。
不同浓度的牦牛胶原蛋白0.01mg/ml-2.0mg/ml与15mg/ml透明质酸的微针效果如表4所示。结果表明，牦牛胶原蛋白0.01mg/ml-0.7mg/ml，透明质酸的浓度为15mg/ml时，即透明质酸与动物胶原蛋白浓度比为21.4-1500:1时，动物胶原蛋白和透明质酸能够混合形成溶液，该原料液制备的微针成型性好，并可在水中快速溶解。
表4不同浓度动物胶原蛋白与15mg/ml透明质酸的微针效果
注：“不可溶”指微针无法在水中快速溶解成溶液状态；“速溶”指微针在水中2min内快速溶解成溶液状态
实施例6
动物胶原蛋白微针的制备：称取透明质酸，加入定量水，配成浓度为：1、5、10、15、20、25、30、35mg/ml的透明质酸溶液；将溶液搅拌至没有肉眼可见粉末结块物质后，将其放入真空干燥箱加热至80℃，恒温30min；取出后再次搅拌均匀，放入真空干燥箱中，保持-50kPa真空度，55℃，干燥脱泡12h后取出；冷却后加入牦牛胶原蛋白使牦牛胶原蛋白最终浓度为0.5mg/ml，搅拌均匀后控制温度低于25℃，通过高速剪切均质乳化机进行均质，均质后将混合液再次放入真空干燥箱，-50kPa真空度，25℃恒温干燥脱泡12h，得到微针原料溶液。
取定量微针原料溶液加入PDMS模具，放入真空干燥箱中，-50kPa真空度25℃恒温干燥，每隔4h重复恢复大气压，重新抽真空操作，脱泡8h后，再次加入相同体积的微针原料溶液，重复上述操作真空干燥脱泡3次，直至微针干燥，脱模得动物胶原蛋白微针。
不同浓度的透明质酸1mg/ml-35mg/ml与0.5mg/ml牦牛胶原蛋白的微针效果如表5所示。透明质酸的浓度为5mg/ml-30mg/ml，牦牛胶原蛋白的浓度为0.5mg/ml时，即透明质酸与动物胶原蛋白浓度比为10-60:1时，动物胶原蛋白和透明质酸能够混合形成溶液，该原料液制备的微针成型性好，并可在水中快速溶解。
表5不同浓度透明质酸与0.5mg/ml动物胶原蛋白的微针效果
注：“速溶”指微针在水中2min内快速溶解成溶液状态
实施例7
动物胶原蛋白微针的制备：根据实施例5、实施例6的实验结果，在本实施例中探究透明质酸浓度极值和动物胶原蛋白极值浓度条件下的微针成型、溶解情况。称取透明质酸，加入定量水，配成浓度为5mg/ml和30mg/ml的透明质酸溶液；将溶液搅拌至没有肉眼可见粉末结块物质后，将其放入真空干燥箱加热至65℃，恒温30min；取出后再次搅拌均匀，放入真空干燥箱中，保持-50kPa真空度，55℃，干燥脱泡12h后取出；分别向5mg/ml和30mg/ml的透明质酸溶液中加入牦牛胶原蛋白至牦牛胶原蛋白最终浓度为0.01mg/ml和0.7mg/ml，搅拌均匀后控制温度低于25℃，通过高速剪切均质乳化机进行均质，均质后将混合液再次放入真空干燥箱，-50kPa真空度，25℃恒温干燥脱泡12h，得到微针原料溶液。
取定量微针原料溶液加入PDMS模具，放入真空干燥箱中，-50kPa真空度20℃恒温干燥，每隔4h重复恢复大气压，重新抽真空操作，脱泡8h后，再次加入相同体积的微针原料溶液，重复上述操作真空干燥脱泡3次，直至微针干燥，脱模得动物胶原蛋白微针。
透明质酸复合牦牛胶原蛋白极值浓度点的结果如表6所示。结果表明，牦牛胶原蛋白为浓度上限0.7mg/ml，透明质酸为浓度上限30mg/ml时，动物胶原蛋白和透明质酸能够混合形成溶液，该原料液制备的微针成型性好，并可在水中快速溶解，动物胶原蛋白为浓度下限0.01mg/ml，透明质酸为浓度下限5mg/ml时，可以得到同样的结果。
表6边界浓度动物胶原蛋白与透明质酸的微针效果
注：“速溶”指微针在水中2min内快速溶解成溶液状态
实施例8
1.动物胶原蛋白微针的制备
称取透明质酸，加入定量水，配成浓度为5mg/ml、15mg/ml的透明质酸溶液；将溶液搅拌至没有肉眼可见粉末结块物质后，将其放入真空干燥箱加热至65℃，恒温30min；取出后再次搅拌均匀，放入真空干燥箱中，保持-50kPa真空度，55℃，干燥脱泡12h后取出；冷却后向5mg/ml透明质酸溶液组加入牦牛胶原蛋白至牦牛胶原蛋白浓度为0.05mg/ml，向15mg/ml透明质酸溶液组加入牦牛胶原蛋白至牦牛胶原蛋白浓度为0.5mg/ml，通过高速剪切均质乳化机进行均质，控制温度低于25℃，均质后再次放入真空干燥箱，-50kPa真空度，20℃恒温干燥脱泡12h，得到微针原料溶液。
取定量微针原料溶液加入PDMS模具，放入真空干燥箱中，-50kPa真空度20℃恒温干燥，每隔4h重复恢复大气压，重新抽真空操作，脱泡8h后，再次加入相同体积的微针原料溶液，重复上述操作真空干燥脱泡3次，直至微针干燥，脱模得动物胶原蛋白微针。
2.动物胶原蛋白微针性能测定
(1)动物胶原蛋白微针SEM检测
检测过程：将5mg/ml透明质酸与0.01mg/ml牦牛胶原蛋白制备的动物胶原蛋白微针通过导电胶倾斜贴合到样品台上，在其表面通过真空镀金30s的方法使其表面均匀分布一层导电层，使用场发射扫描电子显微镜在同样选区内不同放大倍数下获得SEM图。
结果如图6(A)、(B)、(C)、(D)所示，单个微针针尖具有针尖的形状，微针大小与设计大小相同，多个针尖在横、纵方向上具有均匀的分布，具有相同的高度和针尖直径，是理想的微针形状，表明其具有能够在皮肤形成均匀通道的潜力。
(2)动物胶原蛋白微针针体的溶解结果
实验过程：将单独的针尖阵列在Nikon-ECLIPSE 80i/DS-Ri2/NIS-ElementsD成像系统的明场条件下观察微针形状和分布状态，进行4×、10×放大倍数下照片的获得。取大小适中的猪皮，将微针通过均匀外力贴合到猪皮表面，开始计时，在3min后取下并得到一排单独的针尖，在Nikon-ECLIPSE 80i/DS-Ri2/NIS-ElementsD成像系统的明场通道下进行观察对比。
通过明场立体显微镜观察对比微针中使用前后的针体的溶解情况，结果如图7所示，Nikon-ECLIPSE 80i/DS-Ri2/NIS-ElementsD成像系统从侧面观察动物胶原蛋白微针的针体，在使用前针体结构完整，使用3min后，针体完全溶解，说明本发明制备的动物胶原蛋白微针溶解性良好，在使用过程中能够完全溶解。
实施例9
在本实施例中，同时考察了透明质酸与其他常见的复型剂和化妆品常用增稠塑性成分(葡萄糖、可溶淀粉、乳糖、硫酸软骨素、壳聚糖、透明质酸、羧甲基纤维素Ⅳ、羧甲基纤维素钠、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮PVP)制备胶原蛋白微针的效果比较，具体为：
将配成浓度5mg/mL的上述溶液；将溶液搅拌至没有肉眼可见粉末结块物质后，将其放入真空干燥箱加热至75℃，恒温30min；取出后再次搅拌均匀，放入真空干燥箱中，保持-50kPa真空度，55℃，干燥脱泡12h后取出；冷却后加入0.01mg/ml的重组胶原蛋白，搅拌均匀后再次放入真空干燥箱，-50kPa真空度，15℃恒温干燥脱泡12h，所得到微针原料溶液。
取定量微针原料溶液加入PDMS模具，放入真空干燥箱中，-50kPa真空度15℃恒温干燥，每隔4h重复恢复大气压，重新抽真空操作，脱泡8h后，再次加入相同体积的微针原料溶液，重复上述操作真空干燥脱泡3次，直至微针干燥，脱模得重组胶原蛋白微针。
不同原料配制的微针效果如表7所示。结果表明，葡萄糖、硫酸软骨素、透明质酸、聚乙烯吡咯烷酮具有溶解能力能够与重组胶原蛋白混合均匀；但只有透明质酸能够与重组胶原蛋白具有微针成型能力，且制备的微针能够速溶。结果表明，只有透明质酸与重组胶原蛋白能够制成成型性和溶解性良好的胶原蛋白微针。
表7不同原料制备的微针效果
注：“速溶”指微针在水中2min内快速溶解成溶液状态
以上所述仅为本发明的个别示范性实施案例的细节，对于本领域的技术人员来说，本发明在实际应用过程中根据具体的制备条件可以有各种更改和变化，并不用于限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，均应包含在本发明的保护范围之内。