阅读说明：本技术 针对il-33的抗体 (Antibodies to IL-33 ) 是由 钱峰 王军 段世鑫 于 2020-06-10 设计创作，主要内容包括：本发明提供单克隆抗体或其结合片段,所述非完全人源化单克隆抗体或其片段特异性识别IL-33,其包含至少1个选自以下的可变区或其突变序列：1)包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示的重链CDR区序列；和/或,2)包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示的轻链CDR区序列。本发明所提供的人源化单克隆抗体或其结合片段的亲和力高且稳定性强。(The present invention provides a monoclonal antibody or binding fragment thereof, which non-fully humanized monoclonal antibody or fragment thereof specifically recognizes IL-33, comprising at least 1 variable region or mutated sequence thereof selected from the group consisting of: 1) comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 3, a heavy chain CDR region sequence; and/or, 2) comprises SEQ ID NO: 4. SEQ ID NO: 5. SEQ ID NO: 6, and a light chain CDR region sequence. The humanized monoclonal antibody or the binding fragment thereof provided by the invention has high affinity and strong stability.)

针对IL-33的抗体

技术领域

本发明涉及生物技术医药领域。具体地，本发明涉及能够特异性识别并结合人类IL-33分 子的抗体。

背景技术

IL-33为IL-1家族关键成员，其在组织和代谢稳态、感染、炎症、癌症及神经系统疾病中 都具有重要作用。IL-33以高亲和力与白细胞介素1受体4(IL-1R4；亦称为致癌抑制因子2[ST2]) 结合，并与IL-1RAcP形成三元复合体以形成信号传导复合体。此信号传导复合体导致一系列 依赖Myddosome(具有MyD88和IRAK家族成员)的下游信号传导。IL-33作为一种警报素，由 受损伤的屏障层细胞(内皮细胞和上皮细胞)产生。当细胞(例如肥大细胞或嗜碱性粒细胞)受 到IL-33刺激时，产生2型细胞因子，例如IL-4、IL-5和IL-13。

临床前研究表明，IL-33在许多哮喘和过敏性疾病中具有关键作用。IL-33信号通路的阻断 可通过针对IL-33或IL-1R4的中和抗体、IL-33或IL-1R4的遗传缺失或IL-1R4与Fc偶联的 可溶性融合蛋白来实现(Coyleetal.,1999,J.Exper.Med190(7):895-902)。在过敏原(例如尘螨、蟑螂 或链格孢属(alternaria)真菌)诱导产生的炎症模型中，IL-33在驱动炎症和气道重塑等方面具有 重要作用。在依赖佐剂(例如氢氧化铝(明矾)或尿酸钠晶体)的药理学模型中，IL-33在模型的致 敏期和诱导2型细胞因子(例如IL-5和IL-13)的产生中具有重要作用。IL-33亦被发现在气道病 毒感染相关的炎症应答中具有重要作用。由病毒感染对气道上皮造成的损伤可引发IL-33的释 放并改变免疫应答类型。

疾病例如慢性鼻窦炎伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis withnasalpolyps,CRSwNP)、特应性皮 炎(AD)和哮喘中有多种细胞因子涉及发病机理。IL-33受体ST2表达于许多与2型炎症相关的 细胞类型中，包括肥大细胞、嗜碱性粒细胞、Th2细胞、2型固有淋巴样细胞。这些细胞在IL-33 的刺激下会产生许多炎性细胞因子，尤其是与2型炎症相关的细胞因子，包括IL-5、IL-13、 IL-4、IL-31和IL-9。亦产生其他细胞因子及趋化因子，其在募集其他炎性细胞中具有重要作 用。IL-33的最初释放是由身体或黏膜表面的上皮损伤触发引起。疾病相关的触发因素包括具 有蛋白水解活性的过敏原、上皮的物理损伤、病毒及身体表面常见的真菌和细菌。在富含嗜酸 性粒细胞和肥大细胞的疾病组织中，上皮的损伤引发级联反应，从而释放IL-33，作用在局部 靶细胞上，并驱动产生多种对2型炎症应答极为重要的细胞因子。

发明内容

人源化抗体是来自非人类物种的抗体(例如鼠抗体)，其蛋白序列已被修饰以增加其与人体 内抗体的相似性，其基本保留了原抗体的亲和力和特异性，同时也降低了异源性。鼠源抗体人 源化，就是通过基因工程，使其和人体内抗体分子具有尽可能相似的轮廓，从而避免人体免疫 系统的识别。进行人源化改造要遵循两个基本原则，即要保持或提高抗体的亲和力和特异性， 也要降低或消除抗体的免疫原性。目前人源化抗体可以分为四类：人-鼠嵌合抗体、改型抗体、 表面重塑抗体和全人源化抗体。近年来，人源化抗体在肿瘤治疗、自身免疫疾病和心血管疾病 等方面都显示出很好的应用前景。

鉴于此，本申请提供识别IL-33的人源化抗体。根据本申请选择的人源化抗体，在其可变 区序列中包含许多特定的“回复突变”，即从人源化序列回到小鼠序列的突变。这些回复突变在 对于维持原始抗体的构象和结合亲和力方面非常重要，同时其是对具有潜在T细胞表位的最 低发生率的残基进行，从而使得对抗体产生不利免疫应答的风险最小化。

为了产生期望的和人类骨架具有特定的CDR区序列的识别IL-33的人源化抗体，本申请 的发明人鉴定了人类骨架(CDR区序列之外)中影响CDR区展示的关键残基并设计了一系列 这些关键残基的突变以恢复CDR区的正确展示，同时使抗体的免疫原性最小化，并对人源化 抗体的CDR区序列进行部分突变，以提高其亲和力及特异性。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一方面，本申请提供了一种单克隆抗体或其结合片段，所述单克隆抗体或其片段能够特异 性识别IL-33，其包含至少1个选自以下的可变区或其突变序列：

1)包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示的重链CDR区序列；和/ 或，

2)包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示的轻链CDR区序列。

在本申请的一个

具体实施方式

中，其中所述重链CDR区序列所在的骨架序列的1-10个氨 基酸残基不同于SEQ ID NO：47；或所述轻链CDR区所在骨架序列的1-10个氨基酸残基不同 于SEQ ID NO：34。

在本申请的一个具体实施方式中，其中所述重链CDR区序列所在的骨架序列的1个，2 个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸残基不同于SEQ ID NO：47。

在本申请的一个具体实施方式中，所述重链CDR区序列所在的骨架序列的1-5个氨基酸 残基不同于SEQ ID NO：47。

在本申请的一个具体实施方式中，所述重链CDR区序列所在的骨架序列的1-3个氨基酸 残基不同于SEQ ID NO：47。

在本申请的一个具体实施方式中，所述重链CDR区序列所在的骨架序列的3个氨基酸残 基不同于SEQ ID NO：47。

在本申请的一个具体实施方式中，所述轻链CDR区所在骨架序列的1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸残基不同于SEQ ID NO：34。

在本申请的一个具体实施方式中，所述轻链CDR区所在骨架序列的1-5个氨基酸残基不 同于SEQ ID NO：34。

在本申请的一个具体实施方式中，所述轻链CDR区所在骨架序列的1-4个氨基酸残基不 同于SEQ ID NO：34。

在本申请的一个具体实施方式中，所述轻链CDR区所在骨架序列的4个氨基酸残基不同 于SEQ ID NO：34。

在本申请的一个具体实施方式中，其中所述重链CDR区序列所在的骨架序列在选自由以 下组成的组的至少一个残基不同于SEQ ID NO：47：G044、S049、A075和A097。

在本申请的一个具体实施方式中，其中所述重链CDR区序列所在的骨架序列在选自由以 下组成的组的至少一个残基不同于SEQ ID NO：47：G044R、S049A、A075V和A097T。

在本申请的一个具体实施方式中，所述重链可变区序列包含以下所列的骨架序列：(1)SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11；(2)SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16；(3)SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、 或SEQID NO：20；和(4)SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22。

在本申请的一个具体实施方式中，所述重链CDR区序列所在的骨架序列选自以下序列所 示的骨架序列：SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：52。

在本申请的一个具体实施方式中，所述轻链CDR区序列所在的骨架序列在选自由以下组 成的组的至少一个残基不同于SEQ ID NO：34：L004、G072和T087。

在本申请的一个具体实施方式中，所述轻链CDR区序列所在的骨架序列在选自由以下组 成的组的至少一个残基不同于SEQ ID NO：34：L004V、G072R和T087V。

在本申请的一个具体实施方式中，所述轻链可变区包含以下所列的骨架序列：(1)SEQ ID NO： 23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25；(2)SEQ ID NO：26；(3)SEQ ID NO：27、SEQID NO：28、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30；和(4)SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32。

在本申请的一个具体实施方式中，所述轻链CDR区序列所在的骨架序列选自以下序列所 示的骨架序列：SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO： 42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：53。

本发明另一发明提供上述单克隆抗体或其结合片段的突变序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述突变序列的突变发生在轻链CDR区。

在本发明的一个具体实施方式中，所述突变为N034和/或S035。

在本发明的一个具体实施方式中，所述突变为N034Q或N034S。

在本发明的一个具体实施方式中，所述突变为S035A。

在本发明的一个具体实施方式中，其重链选自SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO： 52。

在本发明的一个具体实施方式中，其轻链选自SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO： 40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：53。

在本发明的一个具体实施方式中，所述抗体或其结合片段，其包括SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：33，或其包括SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：33，或其包括SEQ ID NO：45和SEQID NO：41，或其包括SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：41，或其包括SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：35，或其包括SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：36，或其包括SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：37，或其包括SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：41，或其包括SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：35，或其包括SEQID NO：46和SEQ ID NO：36，或其包括SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：37，或其包括SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：43，或其包括SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：38，或其包括SEQ ID NO：48和SEQID NO：39，或其包括SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：40，或其包括SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：43，或其包括SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：38，或其包括SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：39，或其包括SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：40，或其包括SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：41，或其包括SEQID NO：48和SEQ ID NO：42，或其包括SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：44，或其包括SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：44，或其包括SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：44，或其包括SEQ ID NO：51和SEQID NO：44，或其包括SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：44，或其包括SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：43，或其包括SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：42，或其包括SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：53，或其包括SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53，或其包括SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：58所示的序列。

本发明另一方面提供多核苷酸，其编码上述所述的抗体或其结合片段。

本发明另一发明提供表达载体，其能够表达上述所述的抗体或其结合片段，或所述表达载 体能够含有上述所述的多核苷酸。

本发明另一方面提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述所述的表达载体，或其基因组 中整合有上述所述的多核苷酸。

示例性的，本发明至少具有以下优势之一：

本发明所提供的抗体或其结合片段的亲和力高且稳定性高，具有极大的制备成抗体药的潜 在药用价值，可以治疗、预防或减轻与IL-33相关的疾病，如哮喘、类风湿性关节炎、败血症、 心脏疾病、动脉粥样硬化、恶性肿瘤等等。

附图说明

图1所示为本发明实施例中提供的ProteinA纯化后SDS-PAGE的实验结果图。

图2所示为本发明实施例中提供的SEC二次纯化后SDS-PAGE实验结果图。

图3-1至图3-6所示为SPR检测抗原在芯片上的非特异性结合的实验结果图。其中，图 3-1：抗体为W3759-cAb1-xIgG4K.SP，抗原为W3759-hPro1-WT，比例为1:1；图3-2：抗体为W3759-cAb1-z1-p1-uIgG4K.SP，抗原为W3759-hPro1-WT，比例为1:1；图3-3：抗体为 W3759-cAb1-sz8-p1-uIgG4K.SP，抗原为W3759-hPro1-WT，比例为1:1；图3-4：抗体为 W3759-cAb1-sz9-p1-uIgG4K.SP，抗原为W3759-hPro1-WT，比例为1:1；图3-5：抗体为 W3759-cAb1-sz10-p1-uIgG4K.SP，抗原为W3759-hPro1-WT，比例为1:1；图3-6：抗体为 W3759-cAb1-xIgG4K.SP，抗原为W3759-hPro1-Mut，比例为1:1。

图4-1所示为抗原包被法测定得到抗体与抗原结合亲和力的实验结果图。

图4-2所示为ELISA法检测抗体与野生型及突变型抗原的亲和力的实验结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。 显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施 例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发 明保护的范围。

本发明公开了识别IL-33的单克隆抗体，该抗体几乎是完全人源化的，从而避免对抗体的 不利免疫应答，因此在体内使用是安全的。本申请中抗体的特征在于具有独特的CDR区序列 和新颖的非完全人源化骨架序列和设计，并对CDR区序列进行了部分突变，使其与非完全人 源化骨架序列形成高亲和力的抗体。

说明：本申请提供的抗体的可变区包含CDR区和骨架序列，其至少之一中的至少一个残 基不同于对应的完全人类骨架序列。

本发明所述的抗体是至少包含抗体的抗原结合部分的分子，具体包括完整的抗体，诸如多 克隆抗体或单克隆抗体，以及其蛋白水解片段诸如Fab或F(ab')2片段。单链抗体也落入在本 发明的范围之内。

本文所用的术语“氨基酸残基突变”是指单个氨基酸残基的取代、***或缺失。本文所用的 术语“回复突变”是指在人类抗体骨架中发现的单个氨基酸残基向在鼠抗体骨架中发现的对应 氨基酸残基的取代。

本发明中，W3759-hPro1-WT I为人源IL-33，W3759-hPro1-Mut为抗原表位突变的人源 IL-33。

向其引入回复突变的参考完全人源化重链序列为SEQ ID NO：47；完全人源化轻链序列 为SEQ ID NO：34。

实施例1CDR区移植的抗体可变区序列的设计

1.1抗体序列编号与互补决定区(CDR区)的确定

通过ANARCI软件，根据Kabat编号方法对W3759-cAb1(鼠源序列)进行自动编号(Dunbar and Deane 2015)。根据Antibodies网站上的定义确定W3759-cAb1抗体序列中的CDR 区域(如表1)(Martin 2018，http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html#cdrid)。

表1 Dr.Martin网站对CDR的定义

1.2人源化及翻译后修饰去除的设计与质粒构建

将鼠源抗体W3759-cAb1的序列(重链SEQ ID NO：45和轻链SEQ ID NO：33)与IMGT人源胚系序列库进行比对(Lefranc 2003)，并对其分析以鉴定在V区骨架中可能对于抗体的结 合特征重要的氨基酸。这些氨基酸用于掺入一种或更多种变体CDR区移植的抗体，在此基础 上，选择与W3759-cAb1序列比对中，在对应位置氨基酸差别最少的人源胚系序列作为人源化 模板，并通过上述鉴定，对恢复鼠源抗体结合效力可能关键的残基进行回复突变，从而设计一 系列重链和轻链V区，进而构建不同的人源化抗体。

在设计回复突变过程中，还要分析W3759-cAb1序列中是否存在以下位点：CDR区中天 冬酰胺脱氨基位点(Asn-Gly或Asn-Ser)，CDR区中天冬氨酸盐异构化位点(Asp-Gly)，CDR区或框架(Framework)区未配对的半胱氨酸，以及CDR区或框架区N-连接的糖基化位 点(Asn-Xxx-Ser/Thr，其中Xxx可以是除了脯氨酸外的其它氨基酸)。根据经验设计点突变 从而去除该位点。这些突变同时也将被引入人源化的抗体中。回复突变的数目通过初始鼠序列 确定。

带有嵌合抗体序列的质粒由金唯智合成：以pcDNA3.1质粒为基础，包含抗体重链可变区 的质粒，由W3759-cAb1的重链可变区，融合人源IgG1重链CH1，铰链区，CH2及CH3序列构成；包含抗体轻链可变区的质粒，由W3759-cAb1的轻链可变区，融合人源Ig kappa CK结构域序列构成。每一个质粒构建都包含同样的恒定区域序列，仅在抗体的重链或轻链可变区 有差别。

1.3小量瞬转表达及SDS-PAGE凝胶电泳

首先准备1mL 1.2x10⁶，且活率大于95％的HEK293F细胞，用于每一株抗体表达。接着 将终浓度为1μg/mL的质粒DNA与终浓度为2.5μL/mL的Lipofectamine^TM2000转染试剂混合 后，加入准备好的细胞中。将转染后的细胞放入37℃恒温摇床中，150rpm，8％CO₂浓度的环 境中进行培养。

培养5天后，在25℃下，以4000rpm离心10分钟去除细胞。收集上清后用于k_off检测及 凝胶电泳。使用NuPAGE^TM 4-12％Bis-Tris的蛋白胶(ThermoFisher)进行电泳，上样量为13μL， 同时使用PageRuler^TM蛋白标准品指示样品条带分子量。

1.4K_off排序(捕获抗体法)(SPR法)

(1)包被

在实验开始前，由400mM EDC与100mM NHS(GE)混合配置得到活化剂。使用活化剂以10μL/min的流速，420s使传感器芯片活化。而后以10μL/min的流速，420s，向1-8通道 分别注入用10mM NaAc(pH 4.5)稀释的终浓度为30μg/mL的anti-human Fc IgG(Jackson)。最后用1M ethanolamine-HCl(GE)封闭芯片420s，流速为10μL/min。

(2)捕获抗体及亲和力检测

将空白上清对照和含有抗体的上清分别注射到Fc1和Fc2通道中，流速为10μL/min，持 续50s。接着将2M W3759-hPro1和缓冲液注射到Fc1-Fc2，流速为30μL/min，结合300s， 随后解离2400s。当解离过程结束后，使用10mM Glycine pH 1.5作为再生buffer注射入通道 中。

(3)再生

使用10mM Glycine，pH 1.5缓冲液使芯片再生。

(4)数据分析

最终的结合解离曲线是扣减参比通道及缓冲液通道后的结果。按照1:1的结合模型对数据 进行拟合。

1.5抗体生产

包含重链及轻链可变区基因的质粒在Expi293F细胞中进行共表达。培养6天后收取细胞， 收集上清并使用经过洗涤缓冲液(100mM Tris，pH 7.0)平衡后的MabSelect SuRe进行蛋白 纯化。由细胞培养液得到的上清通过进样阀上柱。再使用30倍柱体积的洗涤缓冲液洗去杂质， 经缓冲液B(0.1M Glycine pH 3.5)梯度洗脱得到目的蛋白质。而后使用Nanodrop 2000检测 A280，并由公式A280/消光系数得到洗脱液中蛋白浓度。最后，纯化后的抗体经过SDS-PAGE 凝胶电泳及HPLC-SEC检测，并在-80℃冻存。

1.6SPR测定KD值(包被抗原法)亲和力

(1)缓冲液置换

使用脱盐柱将W3759-hPro1-WT及W3759-hPro1-Mut置换到1×HBS-EP+的缓冲液中。

(2)包被

在实验开始前，由400mM EDC与100mM NHS(GE)混合配置得到活化剂。使用活化剂以10μL/min的流速，420s使传感器芯片活化。而后将使用10mM NaAc pH 4.5稀释的5μg/mLW3759-hPro1-WT注射入通道1-6中，流速为10μL/min，30s。将使用10mM NaAc pH 4.5 稀释的5μg/mL W3759-hPro1-Mut注射入通道7中，流速为10μL/min，30s。最后用1Methanolamine-HCl(GE)封闭芯片420s，流速为10μL/min。

(3)检测

将不同浓度的抗体及缓冲液注射入Fc1和Fc2通道中，流速为30μL/min，结合持续3600 s，而后解离3600s。在每一个相互作用检测的循环之后，使用10mM Glycine pH 1.5使传感器 芯片表面重生，流速为10μL/min，持续30s。

(4)再生

使用10mM Glycine，pH 1.5缓冲液使芯片再生。

(5)数据分析

最终的结合解离曲线是扣减参比通道及缓冲液通道后的结果。按照1:1的结合模型对数据 进行拟合。

1.7ELISA测定EC₅₀(半数有效)

将W3759-hPro1(IL-33)以0.125μg/mL在4℃条件下，过夜包被在ELISA板上。封闭洗 板之后，使用封闭液对半稀释抗体，并在室温下孵育2h。而后洗板并孵育二抗(Goatanti Human IgG-Fc-HRP，Bethyl-A80-304P)1h。洗板后，加入TMB底物，并加入2M HCl终止反应。 最后使用酶标仪在450nm读取光吸收值。

2结果

2.1序列分析

W3759-cAb1抗体可变区氨基酸序列如下所示。CDR区域(单下划线并加粗显示)根据 Kabat CDR区定义法确定。点突变位点由双下划线斜体突出标出。

W3759-cAb1_VH：(SEQ ID NO:45)

W3759-cAb1_VL：(SEQ ID NO:33)

2.2人源化设计及质粒构建

通过数据库比对找到与W3759-cAb1抗体轻链可变区框架序列相似度最高的人源胚系基 因：hIGKV7-3*01+hIGKJ2*03人源胚系基因(表2，3)。与W3759-cAb1抗体重链可变区框 架序列相似度最高的人源胚系基因是hIGHV3-21*01+hIGHJ1*01(表2，3)。为了最大限度维持抗原-抗体的结合能力，通过回复突变，我们根据经验设计了两组不同的人源化抗体。第 一组包含6个人源化重链及6个轻链可变区的变体(轻链变体中包含点突变位点)。第二组包 含2个人源化重链及7个轻链可变区的变体。这些突变能够使CDR区维持在最初的构象，如 果这些区域与抗原结合，则可以保持其与抗原原有的亲和力。

人源化可变区序列由金斯瑞进行反向翻译，密码子优化及基因合成。

表2可变区基因的人源化设计一

表3可变区基因的人源化设计二

说明：“...”表示对应的位置的氨基酸与其上的氨基酸相同。

2.3嵌合及人源化抗体的瞬时转染

使用真核表达质粒pcDNA3.1与293F细胞对23株抗体进行表达(表4，5)，包括1株嵌合抗体，2株杂交抗体以及27株人源化及翻译后修饰突变抗体。使用表达抗体的细胞培养上清进行K_off排序实验。

表4人源化抗体设计一

表5人源化抗体设计二

2.4K_off排序分析

使用表达有抗体的细胞培养上清进行K_off排序实验(结果分析见表6)。由于抗体解离非 常缓慢，测得的kd值小于Biacore的检测极限(1E-05)，因此无法使用kd值来比较抗原抗体 的结合能力。同时，由于结合曲线缺乏曲度，所以也无法得到准确的ka值。最后，采用预期 结合反应(expected binding response)的强弱来指示抗体的ka值。

表6 SPR数据分析

由表6SPR可知，改造后抗体与IL-33的结合活性并不一致。Expected binding高于W3759-cAb1-xIgG4K.SP的抗体有W3759-cAb1-sz6-uIgG4K.SP，W3759-cAb1-sz8-uIgG4K.SP， W3759-cAb1-sz9-uIgG4K.SP，W3759-cAb1-sz10-uIgG4K.SP，W3759-cAb1-sz11-uIgG4K.SP。 其中结合活性最好的是W3759-cAb1-sz9-uIgG4K.SP。

2.5ELISA排序分析

由于抗体的特性，无法得到准确的kd值对构建的人源化抗体进行比较。因此，同时对这 些抗体使用ELISA检测与抗原的结合能力进行分析。实验结果见表7-1、表7-2和表7-3。

表7-1 ELISA数据分析1

表7-2 ELISA数据分析2

表7-3 ELISA数据分析3

根据表7-1、表7-2和表7-3的ELISA数据可知，改造后抗体与IL-33的结合活性大小不 一，且阴性对照和人源IgG4均与IL-33不结合。结合活性最好的三个改造后抗体分别为W3759-cAb1-sz8-uIgG4K.SP，W3759-cAb1-sz9-uIgG4K.SP和W3759-cAb1-sz10-uIgG4K.SP，其中W3759-cAb1-sz9-uIgG4K.SP和W3759-cAb1-sz10-uIgG4K.SP与W3759-cAb1-xIgG4K.SP测得的EC₅₀基本一致。

2.6抗体的表达与纯化

综合分析SPR与ELISA数据，选择W3759-cAb1-z1-uIgG4K.SP， W3759-cAb1-sz8-uIgG4K.SP，W3759-cAb1-sz9-uIgG4K.SP，W3759-cAb1-sz10-uIgG4K.SP作为 候选抗体，并将N034Q突变引入人源化抗体，加上1株嵌合抗体，使用真核表达质粒pcDNA3.1 与293F细胞表达。收集表达有抗体的细胞培养上清，使用Protein A层析柱纯化， W3759-cAb1-sz8-uIgG4K.SP，W3759-cAb1-sz9-uIgG4K.SP经过两步纯化后达到90％以上纯度。 ProteinA纯化后的实验结果如图1所示；SEC纯化后的实验结果如图2所示。

图1所示编号及具体实验结果如下所示。

No.	ProteinName	MW(kDa)	Concentration(mg/ml)	Buffer	Purity(％)
						1	W3759-cAb1-xlgG4K.SP	145.1/25+50	3.91	PBS	97.36％
2	W3759-cAb1-z1-p1-ulgG4K.SP	144.5/25+50	4.18	PBS	98.48％
						3	W3759-cAb1-sz8-p1-ulgG4K.SP	144.8/25+50	1.17	PBS	88.38％
4	W3759-cAb1-sz9-p1-ulgG4K.SP	144.6/25+50	1.81	PBS	73.98％
						5	W3759-cAb1-sz10-p1-ulgG4K.SP	144.8/25+50	3.34	PBS	96.28％

由图1可知，ProteinA纯化后W3759-cAb1-xIgG4K.SP，W3759-cAb1-z1-p1-uIgG4K.SP和 W3759-cAb1-sz10-p1-uIgG4K.SP一步纯化后条带单一(抗体在非还原状态为一条带，还原后 分为重链和轻链两条带)，纯度较高；而W3759-cAb1-sz8-p1-uIgG4K.SP和W3759-cAb1-sz9-p1-uIgG4K.SP一步纯化后有杂带，有杂蛋白，需要进一步纯化。进一步纯化 W3759-cAb1-sz8-p1-uIgG4K.SP和W3759-cAb1-sz9-p1-uIgG4K.SP如图2所示。

图2所示编号及具体实验结果如下所示。

No.	ProteinName	MW(kDa)	Concentration(mg/ml)	Buffer	Purity(％)
						3	W3759-cAb1-sz8-p1-ulgG4K.SP	144.8/25+50	0.88	PBS	98.52％
4	W3759-cAb1-sz9-p1-ulgG4K.SP	144.6/25+50	1.05	PBS	99.62％

由图2可知，W3759-cAb1-sz8-p1-uIgG4K.SP和W3759-cAb1-sz9-p1-uIgG4K.SP两步纯化 后条带单一，纯度较高。

纯化后经HPLC检测抗体纯度如下：W3759-cAb1-xlgG4K.SP的纯度可达97.36％；W3759-cAb1-z1-p1-ulgG4K.SP纯度可达98.48％；W3759-cAb1-sz10-p1-ulgG4K.SP纯度可达 96.28％；W3759-cAb1-sz8-p1-ulgG4K.SP的纯度可达98.52％；W3759-cAb1-sz9-p1-ulgG4K.SP 的纯度可达99.62％，且杂峰很少，五种蛋白经纯化后纯度均可达到实验要求。

2.7SPR检测(抗原包被法)

由于SPR检测时，包被抗体法所得结合曲线缺乏曲度无法测定准确的ka，因此尝试提高 流经抗原的浓度。然而通过检测不同浓度抗原流经参比通道的信号，发现抗原显示出随着浓度升 高而不断增高的与芯片的非特异性相互作用，使得这种条件下无法测得真实的动力学参数。因此， 考虑采用抗原包被法进行检测(分析结果见表8和图3-1至图3-6)。

表8采用包被抗原法测定的实验结果

图3-1至图3-6为采用包被抗原法测定得到的抗体与抗原亲和力曲线。图3-1至图3-5为 包被IL-33抗原后分别以W3759-cAb1,W3759-cAb1-z1-p1-uIgG4K.SP,W3759-cAb1-sz8-p1-uIgG4K.SP,W3759-cAb1-sz9-p1-uIgG4K.SP, W3759-cAb1-sz10-p1-uIgG4K.SP为流动相得到的抗体与抗原亲和力曲线，可以看出 W3759-cAb 1-sz 10-p 1-uIgG4K.SP具有比W3759-cAb1更强的抗原结合能力。图3-6为 包被IL-33突变体后以W3759-cAb1为流动相得到的抗体与抗原亲和力曲线，可知突变抗原与 改造后抗体及嵌合抗体均不结合。

如图3-1至图3-6和表8所示，虽然该方法由于二价效应的原因，无法测得真实的亲和力， 但是该种方法测得的KD值仍然适用于比较抗体之间亲和力的强弱趋势。最后测定得到改造后 的抗体与抗原的亲和力最强为77.6pM，最弱为15.7nM，且改造后的抗体与突变抗原无亲和 力。其中，W3759-cAb1-sz10-p1-uIgG4K.SP具有比嵌合抗体(0.21nM)更强的抗原结合能力。

2.8ELISA检测

为了进一步验证SPR的分析结果，使用ELISA方法测定改造后抗体与抗原的亲和力，实 验结果见表9、图4-1和图4-2。

表9 ELISA方法测定实验结果

图4-1和图4-2为使用ELISA方法测定改造后抗体与IL-33及IL-33突变体的亲和力图。

由图4-1可知，与人源IgG4相比W3759-cAb1,W3759-cAb1-z1-p1-uIgG4K.SP,W3759-cAb1-sz8-p1-uIgG4K.SP,W3759-cAb1-sz9-p1-uIgG4K.SP, W3759-cAb1-sz10-p1-uIgG4K.SP 5个抗体与IL-33都具有一定的亲和性，且改造后抗体 W3759-cAb1-sz10-p1-uIgG4K.SP和嵌合抗体W3759-cAb1与IL-33具有较高的亲和性。

由图4-2可知，浓度在10nM以下时，W3759-cAb1,W3759-cAb1-z1-p1-uIgG4K.SP,W3759-cAb1-sz8-p1-uIgG4K.SP,W3759-cAb1-sz9-p1-uIgG4K.SP, W3759-cAb1-sz10-p1-uIgG4K.SP 5个抗体与IL-33突变体基本不结合，高浓度时会出现非特异 性结合现象。

根据图4-1、图4-2和表9分析可知，ELISA检测得出的结果与SPR检测的结果有较好的 一致性，W3759-cAb1-sz10-p1-uIgG4K.SP与嵌合抗体一致性较高，W3759- cAb1-sz8-p1-uIgG4K.SP的效果较好，在ELISA检测中，相比其它改造后的抗体，其具有与抗 原更高的亲和力。

本发明所提供的抗体或其结合片段的亲和力高且稳定性高，具有极大的制备成抗体药的潜 在药用价值，其为研制治疗、预防或减轻与IL-33相关疾病，如哮喘、类风湿性关节炎、败血 症、心脏疾病、动脉粥样硬化、恶性肿瘤的药物等提供了核心基础。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则 之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南京赛新生物科技有限公司

<120> 针对IL-33的抗体

<160> 53

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 重链CDR1

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr Gly Met Ser

1 5 10

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 重链CDR2

<400> 2

Ser Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 重链CDR3

<400> 3

Leu Pro Ala Pro Phe Val Ser

1 5

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 轻链CDR1

<400> 4

Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Arg Tyr Gly Asn Ser Phe Met His

1 5 10 15

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 轻链CDR2

<400> 5

Arg Ala Ser Asn Leu Asp Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 轻链CDR3

<400> 6

Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Leu Thr

1 5

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NQ

<400> 7

Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Arg Tyr Gly Gln Ser Phe Met His

1 5 10 15

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NS

<400> 8

Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Arg Tyr Gly Ser Ser Phe Met His

1 5 10 15

<210> 9

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SA

<400> 9

Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Arg Tyr Gly Asn Ala Phe Met His

1 5 10 15

<210> 10

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> H1FR1

<400> 10

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser

20 25

<210> 11

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> H2FR1

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 12

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> H1FR2

<400> 12

Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala

1 5 10

<210> 13

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> H2FR2

<400> 13

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10

<210> 14

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> H3FR2

<400> 14

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10

<210> 15

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> H4FR2

<400> 15

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

1 5 10

<210> 16

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> H5FR2

<400> 16

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala

1 5 10

<210> 17

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> H1FR3

<400> 17

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr Arg

20 25 30

<210> 18

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> H2FR3

<400> 18

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 19

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> H3FR3

<400> 19

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg

20 25 30

<210> 20

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> H4FR3

<400> 20

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg

20 25 30

<210> 21

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> H1FR4

<400> 21

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Lys Val Ser Ala

1 5 10

<210> 22

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> H2FR4

<400> 22

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 23

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> L1FR1

<400> 23

Asp Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys

20

<210> 24

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> L2FR1

<400> 24

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys

20

<210> 25

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> L3FR1

<400> 25

Asp Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys

20

<210> 26

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> L1FR2

<400> 26

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 27

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> L1FR3

<400> 27

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 28

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> L2FR3

<400> 28

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asn Asp Val Ala Asn Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 29

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> L3FR3

<400> 29

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asn Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 30

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> L4FR3

<400> 30

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asn Asp Val Ala Asn Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 31

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> L1FR4

<400> 31

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

1 5 10

<210> 32

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> L2FR4

<400> 32

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 33

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> W3759-mVK

<400> 33

Asp Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Arg Tyr

20 25 30

Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Asp Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

<210> 34

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> W3759-hVK

<400> 34

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Arg Tyr

20 25 30

Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asn Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 35

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> W3759-zVK1-p1

<400> 35

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Arg Tyr

20 25 30

Gly Gln Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asn Asp Val Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 36

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> W3759-zVK1-p2

<400> 36

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Arg Tyr

20 25 30

Gly Ser Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asn Asp Val Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 37

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> W3759-zVK1-p3

<400> 37

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Arg Tyr

20 25 30

Gly Asn Ala Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asn Asp Val Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 38

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> W3759-zVK2-p1

<400> 38

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Arg Tyr

20 25 30

Gly Gln Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asn Asp Val Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 39

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> W3759-zVK2-p2

<400> 39

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Arg Tyr

20 25 30

Gly Ser Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asn Asp Val Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 40

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> W3759-zVK2-p3

<400> 40

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