结合人lag-3的抗体、其制备方法和用途

文档序号：1210729 发布日期：2020-09-04 浏览：7次 >En<

阅读说明：本技术 结合人lag-3的抗体、其制备方法和用途 (Antibodies that bind human LAG-3, methods of making, and uses thereof ) 是由赵杰黄浩旻朱祯平于 2019-02-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了能够特异性结合人LAG-3的抗体或其抗原结合片段,其具有全新的与人LAG-3结合的表位以及良好的增强混合淋巴细胞反应的生物学活性,可应用于制备用于癌症免疫疗法的药物,具有良好的临床应用前景。(The invention discloses an antibody or an antigen binding fragment thereof capable of specifically binding human LAG-3, which has a brand-new epitope bound with human LAG-3 and good biological activity for enhancing mixed lymphocyte reaction, can be applied to preparation of a medicament for cancer immunotherapy, and has good clinical application prospect.)

结合人LAG-3的抗体、其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及抗体领域，更具体地，本发明公开了结合人LAG-3的抗体、其制备方法和用途。

背景技术

各种类型的恶性肿瘤目前已经成为人类的主要杀手，并且发病率年年攀升。常规的手术、化疗和放疗虽有一定疗效，但是往往带给病人身体带来巨大损害和毒副作用。现阶段的靶向性单克隆抗体类药物(例如，靶向HER2的trastuzumab)以及靶向性小分子激酶抑制剂(例如，靶向某些酪氨酸激酶的imatinib)虽然在肿瘤治疗中取得了可喜的临床效果，但这类药物只对表达特定靶点的肿瘤有效，能治疗的癌症类型有限，往往客观反应率较低，应用这类抗体之后的肿瘤易产生耐药性从而复发和重新进展。肿瘤免疫治疗是应用免疫学原理和方法，激活免疫系统，打破免疫系统对肿瘤的免疫耐受状态，增强免疫细胞对肿瘤抗原的识别，激发和增强机体抗肿瘤免疫应答，从而使机体免疫系统抑制和杀伤肿瘤细胞，最终达到***的目的。肿瘤免疫治疗近来备受关注，是肿瘤治疗领域的焦点。近几年，肿瘤免疫治疗的重大好消息不断涌现。目前，在癌症免疫治疗中程序性死亡受体1(programmed death 1，PD-1)无疑是最耀眼的明星靶点，以其为靶点的免疫检查点抑制剂如nivolumab和pembrolizumab等单抗类药物已在一些肿瘤类型如黑色素瘤、非小细胞肺癌等的临床治疗中展示出了强大的抗肿瘤活性，已获得美国FDA(Food and DrugAdministration,FDA)批准临床应用。肿瘤免疫治疗由于其卓越的疗效和创新性，在2013年被《科学》杂志评为年度最重要的科学突破。肿瘤免疫治疗有望成为继手术、化疗、放疗和靶向治疗后肿瘤治疗领域的一场革命。

T细胞在免疫系统中扮演重要角色，不过T细胞的活化需依赖抗原递呈细胞将外来有害的抗原消化并重新呈现为T细胞可以识别的抗原型态。T细胞和抗原递呈细胞上有一群参与调节的蛋白质，具有辅助调节T细胞受体信号转导的功能，这些辅助性受体分为2大类，有一类是负责传递激活信号的共刺激性受体，另一类是传递抑制信号的共抑制性受体，如今这类抑制性分子被称为免疫检查点的受体和配体。上述提到的明星分子PD-1就是典型的免疫检查点的受体，属于CD28超家族成员，其重要配体为程序性死亡配体-1(programmeddeath ligand 1，PD-L1)。PD-1与PD-L1的结合介导T细胞活化的共抑制信号，负向调节T细胞活化和增殖。另外，华裔科学家陈列平教授首先发现PD-L1在肿瘤组织高表达，而且调节肿瘤浸润CD8+T细胞的功能。目前，以PD-1/PD-L1为靶点的免疫调节疗法已在临床抗肿瘤治疗中取得了巨大成功。

淋巴细胞活化基因-3(lymphocyte activation gene-3，LAG-3)主要表达于活化的T淋巴细胞，是一种类似于PD-1的免疫负调节分子，LAG-3的主要配体是MHC II分子家族，它能够以更高的亲和力与CD4分子竞争结合MHC II配体，并向细胞内部转导抑制信号，从而负向调节细胞的激活、增殖和动态平衡，其分子机制非常类似于PD-1。LAG-3能够帮助T细胞维持在免疫耐受状态，或使持续激活的T细胞处于耗竭的状态，具有维持内环境稳定和参与免疫负向调节的功能，与肿瘤的发生发展密切相关。目前，一些初步的研究表明，阻断LAG-3的抗体能够增强免疫反应，与PD-1抗体联用能够起到显著的协同激活作用，在癌症免疫治疗领域中潜力巨大。

目前国际上以LAG-3为靶点的单抗类药物的研发大部分尚处于初期阶段，主要研发公司都是百时美施贵宝(Bristol-Myers Squibb，BMS)、诺华(Novartis)等国际医药巨头，其中百时美施贵宝的抗LAG-3单抗BMS-986016正处于临床一期阶段，主要研究目标是与PD-1抗体nivolumab联合使用的安全性和有效性，研究结果显示，BMS-986016与nivolumab联合应用在黑色素瘤的临床治疗中展现出良好疗效。另外，抗LAG-3抗体还可以用来治疗自身免疫病，基本机制是通过抗体依赖细胞介导的细胞毒效应(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)杀伤激活的T细胞，从而起到抑制免疫反应和治疗自身免疫病的目的。然而，仍亟待开发更多新型、特异、高效的以LAG-3为靶点的药物用于免疫疗法的临床应用。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的发明人进行了大量试验，从抗原免疫、杂交瘤筛选、抗体表达纯化到生物活性鉴定，筛选获得了两个特异性结合人LAG-3的鼠源134和2-34(即5E7)号抗体，并在此基础上，进一步构建获得其嵌合抗体134-Chimeric、5E7-Chimeric以及人源化抗体134-Hu-IgG4-C91S、5E7-Hu-IgG4。本发明的研究表明鼠源134和2-34(即5E7)号抗体具有全新的与人LAG-3结合的表位。细胞水平实验结果表明人源化抗体134-Hu-IgG4-C91S、5E7-Hu-IgG4能够有效地阻断LAG-3对Raji细胞的结合和增强SEA刺激的PBMC分泌IL-2。因此，本发明开发的结合人LAG-3的抗体或其抗原结合片段可应用于制备用于癌症免疫疗法的药物。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种结合人LAG-3的抗体或其抗原结合片段。

本发明的第二个目的在于提供另一种结合人LAG-3的抗体或其抗原结合片段。

本发明的第三个目的在于提供编码所述的结合人LAG-3的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。

本发明的第四个目的在于提供含有所述的核苷酸序列的表达载体。

本发明的第五个目的在于提供含有所述的表达载体的宿主细胞。

本发明的第六个目的在于提供所述的结合人LAG-3的抗体或其抗原结合片段的制备方法。

本发明的第七个目的在于提供含有所述的结合人LAG-3的抗体或其抗原结合片段的药物组合物。

本发明的第八个目的在于提供所述的结合人LAG-3的抗体或其抗原结合片段或所述的药物组合物的用途。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明的第一个方面提供了一种结合人LAG-3的抗体或其抗原结合片段，其结合的人LAG-3表位包括以下氨基酸序列：AAAPGHPLA(SEQ ID NO：50)。

根据本发明的优选实施例，其结合的人LAG-3表位包括以下氨基酸序列：GPPAAAPGHPLA(SEQ ID NO：48)或AAAPGHPLAPGPHPAAPSS(SEQ ID NO：49)。

本发明的第二个方面提供了一种结合人LAG-3的抗体或其抗原结合片段，包括：

(a)重链互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO：11所示，和轻链互补决定区LCDR1、LCDR2、LCDR3，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO：14或SEQ ID NO：43所示；或

(b)重链互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO：17所示，和轻链互补决定区LCDR1、LCDR2、LCDR3，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO：20所示。

根据本发明，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。优选的，所述抗体为单克隆抗体。

根据本发明，所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体等。优选的，所述抗体为人源化抗体。

根据本发明，所述抗原结合片段包括Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段等。

根据本发明的优选实施例，所述结合人LAG-3的抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，选自：

(a)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；

(b)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；

(c)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示；和

(d)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示。

根据本发明的优选实施例，所述结合人LAG-3的抗体或其抗原结合片段包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4重链恒定区，所述轻链恒定区选自κ或λ轻链恒定区。优选地，所述重链恒定区为IgG4重链恒定区，所述轻链恒定区为κ轻链恒定区。更优选的，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：30所示，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示。

根据本发明的优选实施例，所述结合人LAG-3的抗体或其抗原结合片段包括重链和轻链，选自：

(a)所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：32所示，所述轻链的氨基酸序列如SEQID NO：36所示；和

(b)所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：38所示，所述轻链的氨基酸序列如SEQID NO：40所示。

本发明的第三个方面提供了一种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码如上任一项所述的结合人LAG-3的抗体或其抗原结合片段。

根据本发明的优选实施例，所述核苷酸序列包括：

(a)如SEQ ID NO：1所示编码重链可变区的核苷酸序列，如SEQ ID NO：3所示编码轻链可变区的核苷酸序列；

(b)如SEQ ID NO：5所示编码重链可变区的核苷酸序列，如SEQ ID NO：7所示编码轻链可变区的核苷酸序列；

(c)如SEQ ID NO：21所示编码重链可变区的核苷酸序列，如SEQ ID NO：23所示编码轻链可变区的核苷酸序列；或

(d)如SEQ ID NO：25所示编码重链可变区的核苷酸序列，如SEQ ID NO：27所示编码轻链可变区的核苷酸序列。

根据本发明的优选实施例，所述核苷酸序列包括如SEQ ID NO：29所示的编码重链恒定区的核苷酸序列，和如SEQ ID NO：33所示的编码轻链恒定区的核苷酸序列。

根据本发明的优选实施例，所述核苷酸序列包括：

(a)如SEQ ID NO：31所示编码重链的核苷酸序列，如SEQ ID NO：35所示编码轻链的核苷酸序列；或

(b)如SEQ ID NO：37所示编码重链的核苷酸序列，如SEQ ID NO：39所示编码轻链的核苷酸序列。

本发明的第四个方面提供了一种表达载体，所述表达载体含有如上任一项所述的核苷酸序列。

本发明的第五个方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如上所述的表达载体。

本发明的第六个方面提供了如上所述的结合人LAG-3的抗体或其抗原结合片段的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在表达条件下，培养如上所述的宿主细胞，从而表达所述的结合人LAG-3的抗体或其抗原结合片段；

(b)分离并纯化(a)所述的结合人LAG-3的抗体或其抗原结合片段。

本发明的第七个方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有如上任一项所述的结合人LAG-3的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。

根据本发明的优选实施例，所述药物组合物还包括PD-1抑制剂。优选的，所述PD-1抑制剂为结合PD-1的抗体或其抗原结合片段。

本发明的第八个方面提供了如上任一项所述的结合人LAG-3的抗体或其抗原结合片段或如上任一项所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的用途。

根据本发明，所述癌症选自黑色素瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌、经典霍奇金淋巴瘤、尿路上皮癌、结直肠癌以及肝癌等。

有益效果：

本发明公开了能够特异性结合人LAG-3的抗体或其抗原结合片段，其具有全新的与人LAG-3结合的表位以及良好的增强混合淋巴细胞反应的生物学活性，可应用于制备用于癌症免疫疗法的药物，具有良好的临床应用前景。

附图说明

图1为鼠源抗人LAG-3抗体对混合淋巴细胞反应的影响的结果，其中，图1A为第一轮筛选，图1B为第二轮筛选。

图2为抗人LAG-3抗体的人源化抗体和嵌合抗体之间的相对亲和力比较的结果。

图3为人源化抗人LAG-3抗体对PBMC分泌IL-2的增强作用的结果，其中，图3A和3B中的PBMC分别来自不同的捐献者。

图4为人源化抗人LAG-3抗体对细胞表面LAG-3的结合作用的结果。

图5为抗人LAG-3抗体表位的示意图。

图6为人源化抗人LAG-3抗体对LAG-3结合Raji细胞的阻断作用的结果。

具体实施方式

本发明中，术语“LAG-3”是指淋巴细胞活化基因3，也称作CD223。

本发明中，术语“抗体(Ab)”和“免疫球蛋白G(IgG)”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是恒定区，重链恒定区由三个结构域CH1、CH2、以及CH3构成。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区，轻链恒定区包括一个结构域CL；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC，antibody-dependentcell-mediated cytotoxicity)等。重链恒定区包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE；轻链恒定区包括κ(Kappa)或λ(Lambda)。

本发明的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)等。

本发明中，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。

本发明中，术语“抗原结合片段”是指能够与抗原(例如人LAG-3)特异性结合的抗体的片段。本发明的抗原结合片段的例子包括Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段等。Fab片段是用木瓜蛋白酶消化抗体产生的片段。F(ab’)2片段是用胃蛋白酶消化抗体产生的片段。Fv片段是由抗体的重链可变区和轻链可变区紧密非共价关联的二聚物组成。

本发明中，术语“Fc段”是指木瓜蛋白酶可将抗体裂解为两个完全相同的Fab段和一个Fc段，Fc段即可结晶片段(fragment crystallizable，Fc)，由抗体的CH2和CH3结构域组成。Fc段无抗原结合活性，是抗体与效应分子或细胞相互作用的部位。

本发明中，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于重链可变区和轻链可变区中称为互补决定区(complementarity-determining region，CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为框架区(frame region，FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669页(1991))。

本发明的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体等。

本发明中，术语“鼠源抗体”是指来源于大鼠或小鼠的抗体，优选小鼠。本发明的鼠源抗体为使用人LAG-3的胞外域为抗原免疫小鼠并进行杂交瘤细胞筛选获得。优选的，本发明的鼠源抗体为134号和2-34(即5E7)号抗体。

本发明中，术语“嵌合抗体”是指包含来源于一个物种的重链可变区和轻链可变区序列以及来源于另一个物种的恒定区序列的抗体，例如具有与人恒定区连接的鼠重链可变区和轻链可变区的抗体。优选的，本发明的嵌合抗体是由鼠源134号和2-34(即5E7)号抗体的重链可变区和轻链可变区序列分别与人的恒定区拼接获得。更优选的，本发明的嵌合抗体的重链是由鼠源134号和2-34(即5E7)号抗体的重链可变区序列分别与人的IgG4重链恒定区拼接获得，轻链是由鼠源134号和2-34(即5E7)号抗体的轻链可变区序列分别与人的Kappa轻链恒定区拼接获得。最优选的，本发明的嵌合抗体包括134-Chimeric和5E7-Chimeric。

本发明中，术语“人源化抗体”是指其CDR来源于非人物种(优选小鼠)抗体，抗体分子中残余的部分(包括框架区和恒定区)来源于人抗体。此外，框架区残基可被改变以维持结合亲和性。优选的，本发明的人源化抗体由鼠源134号和2-34(即5E7)号抗体的CDR区和来源自人抗体的非CDR区重组，并对包埋残基、与CDR区有直接相互作用的残基，以及对134号和2-34(即5E7)号抗体的VL和VH的构象有重要影响的残基进行回复突变获得。更优选的，本发明的人源化抗体包括134-Hu-IgG4-C91S和5E7-Hu-IgG4。

本发明中，术语“表位”和“人LAG-3表位”是指位于人LAG-3上并与抗体特异性结合的区域。优选的，本发明的人LAG-3表位位于人LAG-3的胞外域内，所述的人LAG-3的胞外域包括如SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列。更优选的，本发明的人LAG-3表位包括以下氨基酸序列：AAAPGHPLA(SEQ ID NO：50)。最优选的，本发明的人LAG-3表位包括以下氨基酸序列：GPPAAAPGHPLA(SEQ ID NO：48)或AAAPGHPLAPGPHPAAPSS(SEQ ID NO：49)。

本发明中，术语“结合人LAG-3的抗体”或“抗人LAG-3抗体”是指与人LAG-3表位特异性结合的抗体。术语“特异性结合”是指抗体以小于1×10^-7M或更小、优选为1×10^-8M或更小、更优选为1×10^-9M或更小的亲和力(KD)结合。

本发明中，术语“表达载体”可以为pTT5，pSECtag系列，pCGS3系列，pCDNA系列载体等，以及其它用于哺乳动物表达系统的载体等，表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。

本发明中，术语“宿主细胞”是指适用于表达上述表达载体的细胞，可以是真核细胞，如哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统均可用于本发明的融合蛋白的表达，CHO(中国仓鼠卵巢，Chinese Hamster Ovary)，HEK293，COS，BHK以及上述细胞的衍生细胞均可适用于本发明。

本发明中，术语“药物组合物”是指本发明的结合人LAG-3的抗体或其抗原结合片段可以和药学上可以接受的载体一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的结合人LAG-3的抗体或其抗原结合片段的氨基酸核心序列的构象完整性，同时还保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。

以下实施例、实验例是对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因***到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2ndedition，Cold spring Harbor Laboratory Press。

实施例1.人LAG-3蛋白以及抗LAG-3阳性对照抗体的制备

人LAG-3胞外段氨基酸序列来自https://www.uniprot.org/uniprot/P18627，氨基酸序列如SEQ ID NO：41所示，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行密码子优化并合成基因，然后将合成的基因片段克隆到pUC57载体中。设计引物，用PCR(Polymerase ChainReaction)法扩增LAG-3胞外段(Extracellular Domain，ECD)编码区(SEQ ID NO：41)和人免疫球蛋白IgG1的Fc段编码区(SEQ ID NO：51)；将上述扩增出的片段回收，通过重组PCR将上述片段拼接在一起，同时引入信号肽(MGVKVLFALICIAVAEA，SEQ ID NO：42)编码区，并在两端引入相应的酶切位点；用限制性内切酶切割pTT5表达载体(购自NRC BiotechnologyResearch Institute)和前述重组PCR片段；两组酶切产物纯化后，用连接酶连接后转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞中，涂布于LB(Amp抗性)平板培养基中过夜培养；挑取单克隆菌落，培养扩增之后抽提质粒，用限制性内切酶切割质粒以鉴定是否有目的基因片段***；挑选合格的阳性克隆测序；选取序列完全正确的克隆扩增之后抽提质粒。利用聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine，PEI)将上述构建好的LAG-3表达载体转入HEK293E细胞(购自NRCBiotechnology Research Institute)中进行表达，5天后收取细胞上清，利用Protein A亲和层析纯化，所得蛋白命名为LAG-3-ECD-hFc，用于免疫小鼠及后续筛选过程。HEK293E细胞在化学成分限定的无血清培养基FreeStyle 293Expression Medium(购自Thermo FisherScientific)中培养。蛋白定量通过紫外分光光度法进行。

作为阳性对照的抗LAG-3单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列来自美国专利申请US20140093511A1中的SEQ ID NO：12和14，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行密码子优化并合成基因，重链可变区和轻链可变区基因分别与人IgG4重链恒定区(核苷酸序列如SEQ ID NO：29所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：30所示)和人Kappa轻链恒定区(核苷酸序列如SEQ ID NO：33所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示)连接，并引入信号肽序列(SEQ ID NO：42)，构建成完整的重链和轻链基因，然后按照上述类似的方法将完整的重链和轻链基因分别克隆到pTT5表达载体中。用同样的方法将含有重链和轻链基因的pTT5表达载体组合后，转入HEK293E细胞中进行表达，5天后收取细胞上清，利用Protein A亲和层析纯化抗体，所得抗体命名为Anti-LAG3.5。HEK293E细胞在化学成分限定的无血清培养基FreeStyle 293Expression Medium(购自Thermo Fisher Scientific)中培养。蛋白定量通过紫外分光光度法测定。

实施例2.用人LAG-3-ECD-hFc作为抗原免疫小鼠以及杂交瘤的制备和筛选

将实施例1中制备LAG-3-ECD-hFc用生理盐水稀释至合适浓度后，与等体积弗氏完全佐剂(购自Sigma)混合，超声乳化后对4-5周龄的Balb/c小鼠(购自上海灵畅生物科技有限公司，动物生产许可证号：SCXK(沪)2013-0018)进行多点皮下注射；三周后，用生理盐水稀释LAG-3-ECD-hFc并与等体积弗氏不完全佐剂(购自Sigma)混合，超声乳化完全后对小鼠进行多点皮下注射；两周后再次重复此步骤；所有小鼠在第三次免疫后的第七天取少量血样分离血清，利用常规ELISA法检测血清滴度；选取血清抗体效价>10000的小鼠，七天后每只小鼠通过尾静脉注射10μg抗原蛋白。

静脉注射抗原蛋白后的第三天，选取一定数量的小鼠，处死并解剖取出脾脏，研磨后收集脾脏细胞并计数，用于制备杂交瘤。在此选取骨髓瘤Sp2/0细胞(来源自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)作为细胞融合配体。Sp2/0细胞在细胞培养箱(37℃，5％CO₂)中培养，所用培养基为RPMI-1640完全培养基(配制方法如下：在RPMI-1640基础培养基中添加10％的胎牛血清和1％的Penicillin-Streptomycin，上述材料均购自ThermoFisher Scientific)，细胞融合前一天更换培养基，使细胞处于较好的生长状态。在此采取电融合法制备杂交瘤细胞。电融合法与杂交瘤筛选过程如下：按照脾脏细胞：Sp2/0细胞＝2：1的比例混合两种细胞，离心后弃上清液；然后用细胞融合缓冲液(购自BTX)洗涤细胞三次；细胞沉淀以1×10⁷/ml的密度悬浮于细胞融合缓冲液中；加2ml细胞悬液于细胞融合池中，置于电融合仪ECM2001(购自BTX)上，按一定条件(AC60V，30S；DC 1700V，40μS，3X；POSTAC 60V，3S)进行处理；然后轻轻地将处理后的细胞转移至37℃预热的RPMI-1640完全培养基中，室温放置1小时；将处理后的细胞按10⁴/孔的密度接种入96孔板，每孔100μl；次日每孔补加100μl含有2×HAT(50×HAT购自Thermo Fisher Scientific，使用时按照需要用培养基适当稀释)的RPMI-1640完全培养基；分别在第四天和第七天用新鲜的含有1×HAT的RPMI-1640完全培养基置换旧培养液；于融合后第九天取样进行ELISA检测，鉴定阳性克隆。

阳性克隆(能够分泌抗LAG-3抗体的克隆)的检测通过ELISA方法进行：利用LAG-3-ECD-hFc抗原包被酶标板，包被量为100ng/孔；室温孵育2小时后用PBST(含0.05％Tween-20的PBS)清洗；每孔加入200μl含1％牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)的PBST溶液进行封闭，室温下孵育1小时；用PBST洗涤后排干，放置冰箱中保存待用。检测时在酶标板中加入杂交瘤培养上清100μl/孔，孵育1小时左右；用PBST洗涤3遍；用含有1％BSA的PBST适当稀释HRP-Goat-Anti-Mouse IgG抗体(购自KPL)，室温孵育1小时左右；PBST洗涤3遍；每孔加100μl显色液(以TMB为底物)显色；随后每孔加入2M H₂SO₄终止液终止反应；立即用酶标仪(Molecular Device)在450nm波长处测量各孔OD值；分析数据，确定阳性克隆。

筛选出的阳性克隆并一定是单克隆，并且有些克隆可能不稳定，因此需要及时进行亚克隆，并最终获得单克隆。亚克隆采用有限稀释法完成，过程如下：制备阳性克隆的杂交瘤细胞悬液，用HT培养基(HT培养基配制方法如下：用RPMI-1640完全培养基将100×HT溶液稀释至所需浓度，100×HT购自Thermo Fisher Scientific)将细胞密度调整至10或20个细胞每毫升的稀释度；每个稀释度接种96孔板一块，每孔量为0.2ml，每孔的杂交瘤细胞数平均为2或4；置于CO₂细胞培养箱中培养7-10天，出现肉眼可见的克隆时，在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作ELISA检测(检测方法如上所述)；取ELISA检测为阳性的孔在24孔板中进行扩大培养，并用有限稀释法继续进行新一轮亚克隆，挑选不少于24个克隆孔，进行ELISA检测，当检测呈100％阳性时，即为稳定表达目的抗体的单克隆杂交瘤细胞株；将单克隆杂交瘤细胞株进行扩大培养，并进行冻存保种。

将稳定的单克隆细胞株扩大培养，在无血清培养基HybriGRO SF(购自Corning)中培养5-7天左右，细胞培养上清经过离心和过滤除去沉淀后，用Protein G(购自GEHealthcare)纯化鼠源抗体。经过若干次融合和筛选，本发明成功建立了200多株稳定的杂交瘤单克隆细胞株，并且纯化得到了相应的鼠源抗体，用于进一步的实验。

实施例3.鼠源抗人LAG-3抗体对混合淋巴细胞反应的影响

在此采用混合淋巴细胞反应(Mixed Lymphocyte Reaction，MLR)对鼠源抗人LAG-3抗体的活性进行评估，并加入Anti-LAG3.5作为阳性对照。

MLR实验方法描述如下：用Histopaque(购自Sigma)从人血液中分离出外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，缩写PBMC)，将PBMC中的单核细胞亚群通过贴壁法分离出来，然后用IL-4和GM-CSF联合诱导单核细胞分化成诱导的树突状细胞(p38MAPK-inhibited dendritic cells induce superior antitumour immuneresponses and overcome regulatory T-cell-mediated immunosuppression.NatCommun.2014Jun 24；5:4229.doi:10.1038/ncomms5229.)；七天之后，消化收集上述诱导的树突状细胞；从另外供体的血液中用上述方法分离出PBMC，然后用MACS磁铁和CD4MicroBeads(购自Miltenyi Biotec)从中分离CD4阳性T细胞；将诱导的树突状细胞(10⁴个/孔)和分离出的CD4阳性T细胞(10⁵个/孔)按10：1的比例混匀后接种到96孔板中，每孔150μl；2小时后，在上述96孔板中加入50μl用AIM-V培养基稀释好的鼠源抗LAG-3抗体；同时设置阳性对照抗体Anti-LAG3.5，以及不结合LAG-3的无关同型对照抗体；将96孔板置于细胞培养箱(37℃，5％CO₂)中孵育3-4天，取适量培养上清，用双抗夹心ELISA检测IL-2的分泌量(相关检测试剂购自BD Biosciences)；用多功能酶标仪(Molecular Device)读取OD450，用GraphPad Prism6进行数据分析和作图。本实施例中使用无血清培养基AIM-V(购自Thermo Fisher Scientific)培养细胞。

实验结果如图1A和1B所示，通过两轮筛选(图1A和1B)，获得两个能够明显增强MLR分泌IL-2的鼠源抗人LAG-3抗体，分别是134号和2-34(即5E7)号单抗。

实施例4.优选鼠源抗人LAG-3抗体的核苷酸和氨基酸序列的测定

根据实施例3的筛选结果，最终挑取了134号和5E7号单抗作为先导抗体。使用TRIzol(购自Thermo Fisher Scientific)从134和5E7对应的杂交瘤单克隆细胞株中提取总RNA，用逆转录试剂盒(购自Takara公司)将mRNA逆转录成cDNA，通过文献报道的引物组合(《Antibody Engineering》Volume 1，Edited by Roland Kontermann and Stefan Dübel；引物组合的序列来自第323页)用PCR扩增鼠源的抗人LAG-3抗体的轻链可变区和重链可变区基因，然后将PCR产物克隆入pMD18-T载体，测序并分析可变区基因序列。

134号克隆的序列信息如下：重链可变区基因序列全长360bp，编码120个氨基酸残基，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；轻链可变区基因序列全长321bp，编码107个氨基酸残基，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，氨基酸序列如SEQ IDNO：4所示。

134号克隆的重链可变区的氨基酸序列

EVQLQQSGPVLVKPGASVKMSCKASGYTLTAYYMNWVKQSRGKSLEWIGVINPYNGDSSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELNSLTSEDSAVYYCARDDGYYRWYFDVWGTGTTVTVSS(SEQ ID NO：2)

134号克隆的轻链可变区的氨基酸序列

DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQDIGSRLNWLQQGPDGSIKRLIYATSSLESGVPKRFSGSRSGSDYFLTISSLESEDFVDYYCLQCGSSPPTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：4)

5E7号克隆的序列信息如下：重链可变区基因序列全长348bp，编码116个氨基酸残基，核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；轻链可变区基因序列全长321bp，编码107个氨基酸残基，核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，氨基酸序列如SEQ IDNO：8所示。

5E7号克隆的重链可变区的氨基酸序列

EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDDYMAWFRQTPEKRLEWVASISHGGDYIYYADNLKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAIYFCSRDRRSIDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO：6)

5E7号克隆的轻链可变区的氨基酸序列

DIQMTQITSSLSASLGDRVTITCRASQDISNYLSWYQQKPDGTIKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISDLEQEDIATYFCQQGKTLPYTFGGGTKLERK(SEQ ID NO：8)

实施例5.鼠源抗人LAG-3抗体的人源化

对实施例4中的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列进行分析，依据Kabat编码规则分别确定134和5E7号抗体重链和轻链的3个抗原互补决定区(CDR)和4个框架区(FR)。

其中，134号克隆的重链互补决定区的氨基酸序列为HCDR1：AYYMN(SEQ ID NO：9)、HCDR2：VINPYNGDSSYNQKFKG(SEQ ID NO：10)和HCDR3：DDGYYRWYFDV(SEQ ID NO：11)，轻链互补决定区的氨基酸序列为LCDR1：RASQDIGSRLN(SEQ ID NO：12)、LCDR2：ATSSLES(SEQ IDNO：13)和LCDR3：LQCGSSPPT(SEQ ID NO：14)。

其中，5E7号克隆的重链互补决定区的氨基酸序列为HCDR1：DDYMA(SEQ ID NO：15)、HCDR2：SISHGGDYIYYADNLKG(SEQ ID NO：16)和HCDR3：DRRSIDY(SEQ ID NO：17)，轻链互补决定区的氨基酸序列为LCDR1：RASQDISNYLS(SEQ ID NO：18)、LCDR2：YTSRLHS(SEQ IDNO：19)和LCDR3：QQGKTLPYT(SEQ ID NO：20)。

在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/中，将134号抗体重链可变区氨基酸序列与人免疫球蛋白可变区胚系(Germline)序列进行同源性比较，选择与134号同源性最高的IGHV1-46*01为重链可变区人源化模板，用鼠源134号重链CDR替换IGHV1-46*01中对应的CDR，构建成重链CDR移植可变区。同样地，经过同源性比较，选择IGKV1-39*01胚系序列为轻链可变区人源化模板，将鼠源134号轻链CDR替换IGKV1-39*01中对应的CDR，构建成轻链CDR移植可变区。然后在重链和轻链CDR移植可变区的基础上，对一些框架区内的氨基酸位点进行回复突变。回复突变就是将CDR移植可变区的框架区内的某些氨基酸(对维持抗体结构和亲和力比较重要的氨基酸)突变成鼠源框架区对应位置上的氨基酸。在进行回复突变时，依据Kabat规则将氨基酸序列编码，每个氨基酸的位置由Kabat编码指示。优选的，将重链CDR移植可变区44位的G回复突变为S，48位的M突变为I，67位的V突变为A，69位的M突变为L，71位的R突变为V，73位的T突变为K，78位的V突变为A。优选的，将轻链CDR移植可变区36位的Y回复突变为L，第43位的A突变为S，第44位的P突变为I，第46位的L突变为R，第66位的G突变为R，第69位的T突变为S，第71位的F突变为Y。需要注意的是，134号抗体轻链CDR3(SEQ IDNO：14)中含有一个多余的半胱氨酸(Kabat编码的91位，C91)，其可能导致抗体结构异常，故在此将其突变成丝氨酸(C91S，SEQ ID NO：43)。在携带上述回复突变的重链和轻链CDR移植可变区的末端分别加上氨基酸序列：WGQGTKVEIK(SEQ ID NO：44)和FGQGTKVEIK(SEQ IDNO：45)，构建成完整的人源化的重链和轻链可变区，相关基因序列由生工生物工程(上海)股份有限公司进行密码子优化和基因合成。

最终获得的134人源化重链可变区(134-Hu-VH)基因序列全长354bp，编码118个氨基酸残基，核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示；134人源化轻链可变区(134-Hu-VL-C91S)基因序列全长321bp，编码107个氨基酸残基，核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示。

134人源化重链可变区(134-Hu-VH)的氨基酸序列

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTAYYMNWVRQAPGQSLEWIGVINPYNGDSSYNQKFKGRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDGYYRWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：22，其中下划线部分为重链互补决定区)

134人源化轻链可变区(134-Hu-VL-C91S)的氨基酸序列

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSRLNWLQQKPGKSIKRLIYATSSLESGVPSRFSGSRSGSDYTLTISSLQPEDFATYYCLQSGSSPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：24，其中下划线部分为轻链互补决定区)

用同样的方法对5E7号抗体进行人源化。选择与5E7号同源性最高的IGHV3-21*01为重链可变区人源化模板，用鼠源5E7号重链CDR替换IGHV3-21*01中对应的CDR，构建成重链CDR移植可变区。同样地，经过同源性比较，选择IGKV1-33*01胚系序列为轻链可变区人源化模板，将鼠源5E7号轻链CDR替换IGKV1-33*01中对应的CDR，构建成轻链CDR移植可变区。然后在重链和轻链CDR移植可变区的基础上，对一些框架区内的氨基酸位点进行回复突变。在进行回复突变时，依据Kabat规则将氨基酸序列编码，每个氨基酸的位置由Kabat编码指示。优选的，将重链CDR移植可变区37位的V回复突变为F，44位的G突变为R，49位的S突变为A，91位的Y突变为F，93位的A突变为S。优选的，将轻链CDR移植可变区43位的A突变为T，第44位的P突变为I，第71位的F突变为Y，第87位的Y突变为F。在携带上述回复突变的重链和轻链CDR移植可变区的末端分别加上氨基酸序列：WGQGTKVEIK(SEQ ID NO：44)和FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：45)，构建成完整的人源化的重链和轻链可变区，相关基因序列由生工生物工程(上海)股份有限公司进行密码子优化和基因合成。

最终获得的5E7人源化重链可变区(5E7-Hu-VH)基因序列全长354bp，编码118个氨基酸残基，核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示；5E7人源化轻链可变区(5E7-Hu-VL)基因序列全长321bp，编码107个氨基酸残基，核苷酸序列如SEQ IDNO：27所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示。

5E7人源化重链可变区(5E7-Hu-VH)的氨基酸序列

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDDYMAWFRQAPGKRLEWVASISHGGDYIYYADNLKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYFCSRDRRSIDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：26，其中下划线部分为重链互补决定区)

5E7人源化轻链可变区(5E7-Hu-VL)的氨基酸序列

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLSWYQQKPGKTIKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYFCQQGKTLPYTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：28，其中下划线部分为轻链互补决定区)

将上述人工合成的134人源化重链可变区与人免疫球蛋白IgG4恒定区(核苷酸序列如SEQ ID NO：29所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：30所示)相连，构建成完整的134人源化重链，命名为134-Hu-IgG4-HC(核苷酸序列如SEQ ID NO：31所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：32所示)；134人源化轻链可变区与人免疫球蛋白Kappa链恒定区(核苷酸序列如SEQ ID NO：33所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示)相连，构建成完整的134人源化轻链，命名为134-Hu-LC-C91S(核苷酸序列如SEQ ID NO：35所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：36所示)。

人免疫球蛋白IgG4恒定区的氨基酸序列

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：30)

134人源化重链134-Hu-IgG4-HC的氨基酸序列

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTAYYMNWVRQAPGQSLEWIGVINPYNGDSSYNQKFKGRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDGYYRWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：32，其中下划线部分为重链互补决定区)

人免疫球蛋白Kappa链恒定区的氨基酸序列

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：34)

134人源化轻链134-Hu-LC-C91S的氨基酸序列

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSRLNWLQQKPGKSIKRLIYATSSLESGVPSRFSGSRSGSDYTLTISSLQPEDFATYYCLQSGSSPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO：36，其中下划线部分为轻链互补决定区)

将上述人工合成的5E7人源化重链可变区与人免疫球蛋白IgG4恒定区(核苷酸序列如SEQ ID NO：29所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：30所示)相连，构建成完整的5E7人源化重链，命名为5E7-Hu-IgG4-HC(核苷酸序列如SEQ ID NO：37所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：38所示)；5E7人源化轻链可变区与人免疫球蛋白Kappa链恒定区(核苷酸序列如SEQ ID NO：33所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示)相连，构建成完整的5E7人源化轻链，命名为5E7-Hu-LC(核苷酸序列如SEQ ID NO：39所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：40所示)。

5E7人源化重链5E7-Hu-IgG4-HC的氨基酸序列

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDDYMAWFRQAPGKRLEWVASISHGGDYIYYADNLKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYFCSRDRRSIDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQID NO：38，其中下划线部分为重链互补决定区)

5E7人源化轻链5E7-Hu-LC的氨基酸序列

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLSWYQQKPGKTIKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYFCQQGKTLPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO：40，其中下划线部分为轻链互补决定区)

将上述134-Hu-IgG4-HC和134-Hu-LC-C91S基因分别构建到pTT5表达载体中，用PEI将构建好的表达载体共同转染至HEK293E细胞中进行瞬时表达。HEK293E细胞在FreeStyle 293Expression Medium(购自Thermo Fisher Scientific)无血清培养基中培养，5天后离心并收取细胞上清，利用Protein A亲和层析纯化抗体，最终制备所得抗体命名为134-Hu-IgG4-C91S。用同样的方法构建5E7人源化重链和轻链的表达载体，用同样的方法表达和纯化抗体，最终制备所得抗体命名为5E7-Hu-IgG4。

另外，分别将鼠源134号抗体的重链可变区和轻链可变区利用重组PCR法分别与人免疫球蛋白IgG4重链恒定区(核苷酸序列如SEQ ID NO：29所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：30所示)和Kappa轻链恒定区(核苷酸序列如SEQ ID NO：33所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示)拼接，分别构建到pTT5表达载体中，用上述方法表达并纯化抗体，制备的嵌合抗体命名为134-Chimeric。用同样方法获得5E7抗体的嵌合抗体5E7-Chimeric。

采用ELISA法检测人源化改造对抗体和抗原之间的亲和力产生的影响。用LAG-3-ECD-His(带有His标签的LAG-3胞外段，购自Sino Biological Inc.)包被酶标板(10ng/孔)，室温孵育2小时后用PBST(含0.05％Tween-20的PBS)清洗；每孔加入200μl封闭液(含1％BSA的PBST溶液)进行封闭；用PBST洗涤酶标板后拍干；在酶标板中加入在封闭液中梯度稀释的抗人LAG-3抗体，室温孵育1小时左右，然后洗涤酶标板；加入用封闭液稀释的Goat-Anti-Human IgG(Fc specific)二抗(购自Sigma)，室温孵育1小时左右，然后洗涤酶标板；每孔加100μl显色液(TMB底物)显色；随后每孔加入50μl 2M H₂SO₄终止显色反应；用SpectraMax 190(Molecular Device)在450nm波长处测量各孔OD值；用GraphPad Prism6进行数据分析和作图，并计算EC50。

实验结果如图2所示，Anti-LAG3.5、134-Chimeric、134-Hu-IgG4-C91S、5E7-Chimeric和5E7-Hu-IgG4均能有效结合LAG-3，EC50分别为27.63ng/ml、8.685ng/ml、8.782ng/ml、9.741ng/ml和9.078ng/ml，对应的人源化抗体与嵌合抗体的EC50基本一致，表明人源化改造没有降低抗体抗原间的亲和力。其中，同种型对照为不结合LAG-3的IgG4抗体。

实施例6.检验人源化抗人LAG-3抗体对PBMC分泌IL-2的增强作用

葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal Enterotoxin A，SEA)是一种超抗原，能够交联抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cell，APC)的MHC II类分子和T细胞表面的T细胞受体(T cell receptor，TCR)，从而激活大量的T细胞克隆，强烈刺激免疫反应。T细胞激活后表达LAG-3，LAG-3可与APC表面的MHC II类分子结合，从而发挥免疫抑制作用。本实施例中，用SEA刺激PBMC之后，加入抗人LAG-3抗体，通过检测IL-2的分泌，评估人源化抗人LAG-3抗体的功能活性。

实验方法描述如下：将带有组氨酸标签的SEA基因克隆到pET28a载体中，用大肠杆菌系统表达此蛋白，然后用镍亲和层析柱对SEA进行纯化；用Histopaque从人血液中分离PBMC，用PBS洗涤后离心；用RPMI-1640培养基(含10％胎牛血清)重悬细胞，加入上述自制的SEA(SEQ ID NO：52)至终浓度为1ng/ml，然后将PBMC接种至圆底96孔细胞培养板中，每孔2×10⁵个细胞，每孔体积为150μl；然后在每孔中加入50μl梯度稀释的抗人LAG-3抗体，将96孔板置于细胞培养箱(37℃，5％CO₂)中孵育2天；取适量培养上清，用双抗夹心ELISA检测IL-2的分泌量(相关检测试剂购自BD Biosciences)；用酶标仪(Molecular Device)读取OD450，用GraphPad Prism6进行数据分析和作图。

图3A和3B中的PBMC分别来自不同的捐献者。实验结果显示，Anti-LAG3.5、134-Hu-IgG4-C91S和5E7-Hu-IgG4均能有效增强SEA刺激的PBMC分泌IL-2。图3A所示实验中Anti-LAG3.5、134-Hu-IgG4-C91S和5E7-Hu-IgG4的EC50分别为98.09ng/ml、50.71ng/ml和78.12ng/ml；图3B所示实验中上述三个抗体的EC50分别为16.21ng/ml、10.85ng/ml和3.068ng/ml。两次实验结果均显示，134-Hu-IgG4-C91S和5E7-Hu-IgG4刺激活化PBMC分泌IL-2的功能活性均强于Anti-LAG3.5。其中，同种型对照为不结合LAG-3的IgG4抗体。

实施例7.人源化抗人LAG-3抗体对细胞表面LAG-3的结合作用

超抗原SEA能够激活PBMC中的T细胞克隆，激活的T细胞会表达LAG-3。本实施例用流式细胞法测定本发明的人源化抗人LAG-3抗体对细胞表面LAG-3的结合作用。

实验步骤描述如下：用Histopaque从人血液中分离PBMC，用PBS洗涤2遍，离心收集细胞；用RPMI-1640培养基(含10％胎牛血清)重悬细胞，加入SEA至终浓度为1ng/ml，然后将PBMC接种至圆底96孔细胞培养板中，每孔2×10⁵个细胞；将96孔板置于细胞培养箱(37℃，5％CO₂)中孵育2天；用PBS洗涤96孔板中的细胞，离心后弃掉上清；用Biotin N-hydroxysuccinimide ester(货号/规格：H1759-100MG，购自Sigma)对抗体进行生物素化，具体操作按照生产商提供的说明书进行；加入梯度稀释的用生物素标记的抗人LAG-3抗体，孵育1小时左右，然后用PBS洗涤细胞2遍；用含1％BSA的PBS适当稀释的PE-Streptavidin(购自BD Biosciences)，加入上述细胞中，孵育1小时左右，然后用PBS洗涤细胞2遍；加入4％的多聚甲醛固定细胞；在流式细胞仪上(CytoFLEX Cytometer System，购自BeckmanCoulter)检测细胞的PE荧光强度；用流式细胞仪分析软件处理实验数据并计算平均荧光强度；用GraphPad Prism6进行数据分析和作图，计算EC50。

实验结果如图4所示，Anti-LAG3.5、134-Hu-IgG4-C91S和5E7-Hu-IgG4均能有效结合细胞表面的LAG-3，EC50分别为71.68ng/ml、80.45ng/ml和53.13ng/ml，三者的结合能力基本一致。其中，同种型对照为不结合LAG-3的IgG4抗体，纵坐标为平均荧光强度。

实施例8.抗人LAG-3抗体的表位分析

LAG-3胞外段的第一个免疫球蛋白样结构域含有一段暴露的“extra loop”，其氨基酸序列为：GPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRY(SEQ ID NO：46)。据文献报道，该肽段对LAG-3与MHC-II类分子的结合起重要作用(Baixeras E,Huard B,Miossec C,etal.Characterization of the lymphocyte activation gene 3-encoded protein.A newligand for human leukocyte antigen class II antigens.[J].Journal ofExperimental Medicine,1992,176(2):327-337.)。为检验本发明的抗人LAG-3抗体与该肽段的结合情况，并确定每个抗体的结合表位，实施了如下肽段扫描实验：通过化学方法合成一系列部分重叠的肽段，这些部分重叠的肽段覆盖整个“extra loop”区，在这些肽段的N端连接生物素标签；用Streptavidin包被酶标板(200ng/孔)，洗涤酶标板后用封闭液(含1％BSA的PBST溶液)封闭；用封闭液将生物素化的肽段稀释至1μg/ml后加入酶标板中，室温孵育1小时，使之被Streptavidin捕获，然后洗涤酶标板；在其中加入用封闭液梯度稀释的抗人LAG-3抗体，室温孵育1小时左右，然后洗涤酶标板；加入在封闭液中适当稀释的Goat-Anti-Human IgG(Fc specific)二抗(购自Sigma)检测抗人LAG-3抗体对肽段的结合，室温孵育1小时左右；每孔加100μl显色液(TMB底物)显色，随后每孔加入50μl 2M H₂SO₄终止液终止反应；用SpectraMax 190(Molecular Devices,Inc.)在450nm波长处测量各孔OD值；用GraphPad Prism6进行数据分析和作图，并计算EC50。肽段扫描实验的结果总结在表1中。

表1.肽段扫描实验的结果汇总

备注：“-”表示无明显结合，“+”表示有明显结合，“+”越多表示结合越强；EC50越小“+”越多。

如果抗体与多条肽段均明显结合，那么重叠的最短的肽段就是该抗体的表位。表1实验结果显示，Anti-LAG3.5抗体的表位是PHPAAPSSW(SEQ ID NO：47)，134号抗体的表位是GPPAAAPGHPLA(SEQ ID NO：48)；而5E7号抗体的表位是AAAPGHPLAPGPHPAAPSS(SEQ ID NO：49)。相关结果展示在图5中。

实施例9.人源化抗人LAG-3抗体对LAG-3结合Raji细胞的阻断作用

Raji细胞是一种Burkitt淋巴瘤细胞，起源于B淋巴细胞，高表达MHC-II类分子。本实施例用流式细胞法测定本发明的人源化抗人LAG-3抗体对LAG-3结合Raji细胞表面MHC-II类分子的阻断作用。

实验步骤如下：用PBS将Raji细胞(购自American Type Culture Collection，缩写为ATCC；CCL-86^TM)洗涤2遍，然后接种至圆底96孔细胞培养板中，每孔2×10⁵个细胞，离心后弃掉上清；用含1％BSA的PBS将生物素化LAG-3(购自ACROBiosystems)稀释至0.5μg/ml，然后再在此溶液中梯度稀释抗人LAG-3抗体，然后将配好的含有生物素化LAG-3和抗人LAG-3抗体的混合溶液加入上述细胞中，室温孵育1小时左右，用PBS洗涤细胞2遍；用含1％BSA的PBS适当稀释PE-Streptavidin(购自BDBiosciences)，加入上述细胞中，孵育1小时左右，用PBS洗涤细胞2遍；加入4％的多聚甲醛固定细胞；在流式细胞仪上(CytoFLEXCytometer System，购自Beckman Coulter)检测细胞的PE荧光强度；用流式细胞仪分析软件处理实验数据并计算平均荧光强度；用GraphPad Prism6进行数据分析和作图，计算EC50。

实验结果如图6所示，Anti-LAG3.5和134-Hu-IgG4-C91S均能有效阻断LAG-3对Raji细胞的结合，IC50分别为256.9ng/ml和288.8ng/ml，两者的阻断能力基本一致。5E7-Hu-IgG4对LAG-3结合Raji细胞的影响不同于Anti-LAG3.5和134-Hu-IgG4-C91S：在高浓度时，5E7-Hu-IgG4只能部分阻断LAG-3对Raji细胞的结合；在低浓度时，5E7-Hu-IgG4反而能促进LAG-3对Raji细胞的结合。其中，同种型对照为不结合人LAG-3的IgG4抗体，阴性对照表示没有LAG-3存在时Raji细胞的背景荧光值。

序列表

<110> 三生国健药业（上海）股份有限公司

<120> 结合人LAG-3的抗体、其制备方法和用途

<130> 2019

<160> 52

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 360

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 1

gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgtg ctggtgaagc ctggggcttc agtaaagatg 60

tcctgtaagg cttctggata cacactcact gcctactata tgaactgggt gaagcaaagt 120

cgtggaaaga gccttgagtg gattggagtt attaatcctt acaacggtga ttctagctac 180

aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgttgaca agtcctccag cacagcctac 240

atggagctca acagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagggatgat 300

ggttactacc gatggtactt cgatgtctgg ggcacaggga ccacggtcac cgtctcctca 360

<210> 2

<211> 120

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 2

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Ala Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Arg Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Arg Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

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<210> 3

<211> 321

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 3

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctctgggaga aagagtcagt 60

ctcacttgtc gggcaagtca ggacattggt agtagattaa actggcttca gcagggacca 120

gatggaagta ttaaacgcct gatctacgcc acatccagtt tagaatctgg tgtccccaaa 180

aggttcagtg gcagtaggtc tgggtcagat tactttctca ccatcagcag ccttgagtct 240

gaagattttg tagactatta ctgtctacag tgtggtagtt ctcctccgac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa a 321

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Arg

20 25 30

Leu Asn Trp Leu Gln Gln Gly Pro Asp Gly Ser Ile Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Phe Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Val Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Cys Gly Ser Ser Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 348

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 5

gaagtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt gacgattaca tggcttggtt tcgccagact 120

cctgagaaaa ggctggagtg ggtcgcatcc attagtcatg gtggtgatta catctactat 180

gcagacaatt tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240

ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatat atttctgttc aagagatcgg 300

cgatccattg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctca 348

<210> 6

<211> 116

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asp

20 25 30

Tyr Met Ala Trp Phe Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser His Gly Gly Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Asn Leu

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys

85 90 95

Ser Arg Asp Arg Arg Ser Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 7

<211> 321

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 7

gatatccaga tgacacagat tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcacttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa gctggtatca gcagaaacca 120

gatggaacta ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcga cctggagcaa 240

gaagatatcg ccacttactt ttgccaacag ggtaaaacgc ttccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggaaagaaa a 321

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ile Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Lys Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

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<211> 5

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 9

Ala Tyr Tyr Met Asn

1 5

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 10

Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 11

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 11

Asp Asp Gly Tyr Tyr Arg Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 12

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Arg Leu Asn

1 5 10

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<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 13

Ala Thr Ser Ser Leu Glu Ser

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 14

Leu Gln Cys Gly Ser Ser Pro Pro Thr

1 5

<210> 15

<211> 5

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 15

Asp Asp Tyr Met Ala

1 5

<210> 16

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 16

Ser Ile Ser His Gly Gly Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Asn Leu Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 17

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 17

Asp Arg Arg Ser Ile Asp Tyr

1 5

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<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 18

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Ser

1 5 10

<210> 19

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 19

Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser

1 5

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 20

Gln Gln Gly Lys Thr Leu Pro Tyr Thr

1 5

<210> 21

<211> 360

<212> DNA

<213> Synthetic

<400> 21

caagtgcagc tggtgcagtc cggcgccgaa gtgaagaagc ctggcgcctc cgtgaaggtg 60

agctgcaagg cttccggcta caccctgacc gcctactaca tgaactgggt gaggcaggcc 120

cctggccagt ccctggaatg gatcggcgtg atcaacccct acaacggcga ctcctcctat 180

aaccagaagt tcaagggccg ggccaccctg accgtggaca agtccaccag caccgcctac 240

atggagctgt cctccctgag gtccgaggac accgccgtct actactgcgc cagggacgac 300

ggctactaca ggtggtactt cgacgtgtgg ggccagggca ccctggtgac agtgtcctcc 360

<210> 22

<211> 120

<212> PRT

<213> Synthetic

<400> 22

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Ala Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Arg Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln

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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

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<210> 23

<211> 321

<212> DNA

<213> Synthetic

<400> 23

gacatccaga tgacccagtc cccttcctcc ctgtccgctt ccgtgggcga cagggtgacc 60

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ggcaagtcca tcaagcggct gatctacgcc acctcctccc tggagtccgg cgtgccttcc 180

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gaggacttcg ccacctacta ctgcctgcag tccggctcct cccctcctac cttcggccag 300

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<210> 24

<211> 107

<212> PRT

<213> Synthetic

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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Arg

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Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Ile Lys Arg Leu Ile

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Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Gly Ser Ser Pro Pro

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<210> 25

<211> 348

<212> DNA

<213> Synthetic

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cctggaaaga ggctggagtg ggtggcttcc atctcccacg gcggcgacta catctactac 180

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<210> 26

<211> 116

<212> PRT

<213> Synthetic

<400> 26

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asp

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Tyr Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val

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Ala Ser Ile Ser His Gly Gly Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Asn Leu

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<212> DNA

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<210> 28

<211> 107

<212> PRT

<213> Synthetic

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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

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Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Ile Lys Leu Leu Ile

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Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

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Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Lys Thr Leu Pro Tyr

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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 29

<211> 981

<212> DNA

<213> Homo

<400> 29

gcaagtacca agggacctag tgttttccct cttgcacctt gctccaggtc aacatcagag 60

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tggaactccg gagctttgac aagcggcgtt catacattcc cagctgtgtt gcagagttct 180

gggttgtaca gtttgagctc agtggtgacc gtgccttcat cttctttggg cactaagacc 240

tacacctgca acgtggatca caagccaagc aacaccaagg tggataagag ggtggagtcc 300

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ctgtctctga gtctgggcaa a 981

<210> 30

<211> 327

<212> PRT

<213> Homo

<400> 30

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

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290 295 300

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305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 31

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<212> DNA

<213> Synthetic

<400> 31

caagtgcagc tggtgcagtc cggcgccgaa gtgaagaagc ctggcgcctc cgtgaaggtg 60

agctgcaagg cttccggcta caccctgacc gcctactaca tgaactgggt gaggcaggcc 120

cctggccagt ccctggaatg gatcggcgtg atcaacccct acaacggcga ctcctcctat 180

aaccagaagt tcaagggccg ggccaccctg accgtggaca agtccaccag caccgcctac 240

atggagctgt cctccctgag gtccgaggac accgccgtct actactgcgc cagggacgac 300

ggctactaca ggtggtactt cgacgtgtgg ggccagggca ccctggtgac agtgtcctcc 360

gcaagtacca agggacctag tgttttccct cttgcacctt gctccaggtc aacatcagag 420

tccacagctg ctcttggatg tctcgttaag gactacttcc cagagccagt taccgtatcc 480

tggaactccg gagctttgac aagcggcgtt catacattcc cagctgtgtt gcagagttct 540

gggttgtaca gtttgagctc agtggtgacc gtgccttcat cttctttggg cactaagacc 600

tacacctgca acgtggatca caagccaagc aacaccaagg tggataagag ggtggagtcc 660

aagtacggcc caccatgtcc tccatgtcca gcccctgaat ttttgggcgg gccttctgtc 720

tttctgtttc ctcctaaacc taaagatacc ctgatgatca gccgcacacc cgaagtcact 780

tgtgtggtcg tggatgtgtc tcaggaagat cccgaagtgc agtttaactg gtatgtcgat 840

ggcgtggaag tgcataatgc caaaactaag ccccgcgaag aacagttcaa cagcacttat 900

cgggtcgtgt ctgtgctcac agtcctccat caggattggc tgaatgggaa agaatataag 960

tgcaaggtga gcaataaggg cctccccagc agcatcgaga agactattag caaagccaaa 1020

gggcagccac gggaacccca ggtgtacact ctgcccccct ctcaggagga gatgactaaa 1080

aatcaggtct ctctgacttg tctggtgaaa gggttttatc ccagcgacat tgccgtggag 1140

tgggagtcta atggccagcc cgagaataat tataagacaa ctccccccgt cctggactct 1200

gacggcagct ttttcctgta ttctcggctg acagtggaca aaagtcgctg gcaggagggc 1260

aatgtcttta gttgcagtgt catgcatgag gccctgcaca atcactatac acagaaaagc 1320

ctgtctctga gtctgggcaa a 1341

<210> 32

<211> 447

<212> PRT

<213> Synthetic

<400> 32

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Ala Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Arg Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 33

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo

<400> 33

cgcactgtgg ctgcccccag tgttttcata tttcccccca gtgatgagca actgaagtcc 60

ggcacagcct ctgttgtatg tctgctgaat aatttttatc cacgggaggc caaggtgcag 120

tggaaggtgg acaatgccct gcagtctggg aactctcaag agagtgtgac agagcaggac 180

agtaaagaca gcacctatag cctcagcagc accctgaccc tgtctaaagc cgactatgaa 240

aaacacaaag tgtatgcctg cgaagtgacc catcaggggc tcagctctcc cgttaccaag 300

agctttaacc gaggcgaatg t 321

<210> 34

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo

<400> 34

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 35

<211> 642

<212> DNA

<213> Synthetic

<400> 35

gacatccaga tgacccagtc cccttcctcc ctgtccgctt ccgtgggcga cagggtgacc 60

atcacctgta gggcctccca ggacatcggc tccaggctga actggctgca gcagaagccc 120

ggcaagtcca tcaagcggct gatctacgcc acctcctccc tggagtccgg cgtgccttcc 180

aggttctccg gctccaggtc cggctccgac tacaccctga ccatctcctc cctgcagccc 240

gaggacttcg ccacctacta ctgcctgcag tccggctcct cccctcctac cttcggccag 300

ggcaccaagg tggagatcaa gcgcactgtg gctgccccca gtgttttcat atttcccccc 360

agtgatgagc aactgaagtc cggcacagcc tctgttgtat gtctgctgaa taatttttat 420

ccacgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaatgccc tgcagtctgg gaactctcaa 480

gagagtgtga cagagcagga cagtaaagac agcacctata gcctcagcag caccctgacc 540

ctgtctaaag ccgactatga aaaacacaaa gtgtatgcct gcgaagtgac ccatcagggg 600

ctcagctctc ccgttaccaa gagctttaac cgaggcgaat gt 642

<210> 36

<211> 214

<212> PRT

<213> Synthetic

<400> 36

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Arg

20 25 30

Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Ile Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Gly Ser Ser Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 37

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<212> DNA

<213> Synthetic

<400> 37

gaagtgcagc tggtggagtc cggaggcgga ctggtgaagc ctggaggctc cctgaggctg 60

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gctttgacaa gcggcgttca tacattccca gctgtgttgc agagttctgg gttgtacagt 540

ttgagctcag tggtgaccgt gccttcatct tctttgggca ctaagaccta cacctgcaac 600

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ccatgtcctc catgtccagc ccctgaattt ttgggcgggc cttctgtctt tctgtttcct 720

cctaaaccta aagataccct gatgatcagc cgcacacccg aagtcacttg tgtggtcgtg 780

gatgtgtctc aggaagatcc cgaagtgcag tttaactggt atgtcgatgg cgtggaagtg 840

cataatgcca aaactaagcc ccgcgaagaa cagttcaaca gcacttatcg ggtcgtgtct 900

gtgctcacag tcctccatca ggattggctg aatgggaaag aatataagtg caaggtgagc 960

aataagggcc tccccagcag catcgagaag actattagca aagccaaagg gcagccacgg 1020

gaaccccagg tgtacactct gcccccctct caggaggaga tgactaaaaa tcaggtctct 1080

ctgacttgtc tggtgaaagg gttttatccc agcgacattg ccgtggagtg ggagtctaat 1140

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ctgggcaaa 1329

<210> 38

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<212> PRT

<213> Synthetic

<400> 38

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asp

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Tyr Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser His Gly Gly Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Asn Leu

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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ser Arg Asp Arg Arg Ser Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

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Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

245 250 255

Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

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Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

275 280 285

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Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

325 330 335

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

340 345 350

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

355 360 365

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

370 375 380

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

385 390 395 400

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

405 410 415

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

420 425 430

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

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<210> 39

<211> 642

<212> DNA

<213> Synthetic

<400> 39