阅读说明：本技术 一种多糖及其制备方法和应用 (Polysaccharide and preparation method and application thereof ) 是由 丁侃 曾晖 厉飘飘 于 2020-05-13 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种多糖及其制备方法和应用。本发明通过药理实验表明上述多糖可以剂量依赖性地抑制稳定转染APP和BACE1的CHO/APPBACE1细胞中和稳定转染APP Switish突变的HEK293-APP<Sup>sw</Sup>细胞中Aβ<Sub>42</Sub>的生成,并且所述多糖能明显抑制Aβ<Sub>42</Sub>的聚集；同时具有潜在的治疗阿尔兹海默症的作用,能开发成治疗阿尔兹海默症的糖类药物。(The invention provides a polysaccharide and a preparation method and application thereof. Pharmacological experiments show that the polysaccharide can inhibit the neutralization of CHO/APPABCE 1 cells stably transfected with APP and BACE1 and HEK293-APP with APP Switish mutation stably transfected sw A β in cells 42 And the polysaccharide can obviously inhibit A β 42 (ii) aggregation of (ii); meanwhile, the compound has the potential effect of treating the Alzheimer's disease and can be developed into a carbohydrate medicament for treating the Alzheimer's disease.)

一种多糖及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种多糖及其制备方法和应用。

背景技术

阿尔兹海默症(AD)是一种老年人多发，易导致行为和认知障碍的渐行性神经退行性疾病。随着全球老龄化问题日渐严重，AD的患病率逐年上升， AD将成为全世界不可忽视的卫生和社会问题。AD的发病机制复杂，根据淀粉样级联假说，淀粉样蛋白(Aβ)是AD的主要病理特征之一，由β-分泌酶和γ-分泌酶共同切割淀粉样前体蛋白产生，Aβ聚集、沉积形成老年斑进一步损伤神经系统。因此，以Aβ为靶点，寻找能够预防和根治阿尔兹海默症的药物，是目前研究的重点(例如可参见Mattson M P.Pathways towards and away fromAlzheimer's disease[J].Nature,2004,430(7000):631-639.)。

远志为远志科远志属植物远志(Polygala tenuifolia Willd.)的干燥根，据《中药大辞典》记载，其有安神助眠，抗衰老，抗痴呆等神经保护作用，在中国已有两千多年的药用历史。多糖作为远志的主要成分之一，被报道具有抗肿瘤、抗氧化等作用，然而远志多糖在治疗阿尔兹海默症的作用，尚无报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种多糖。本发明通过从远志的干燥根中提取分离得到一种果胶多糖RP02-1，药理实验表明制得的多糖RP02-1能够显著减少并可以剂量依赖性地抑制稳定转染APP和BACE1的CHO/APPBACE1 细胞中和稳定转染APP Switish突变的HEK293-APP^sw细胞中Aβ₄₂的生成。 RP02-1无明显细胞毒性，并且能明显抑制Aβ₄₂的聚集；具有治疗阿尔兹海默症的作用，可开发成为一种治疗阿尔兹海默症的糖类候选药物。

本发明的另一个目的是提供上述多糖的制备方法。

本发明的再一个目的是提供上述多糖的应用。

因此，根据一个方面，本发明提供了一种多糖RP02-1，其具有以下结构：

其中，a和b各自独立表示1,5-***糖(1,5-Ara)的数目，且a+b＝21；n为1-33的整数，例如为16-17。

本发明中，优选地，上述多糖RP02-1的重均分子量的范围为11-239kDa。

本发明中，优选地，上述多糖RP02-1的单糖组成包括***糖、半乳糖、鼠李糖和半乳糖醛酸，其中各单糖摩尔比为63.5:19.8:8.3:8.4。

根据另一个方面，本发明提供了一种从远志中提取多糖RP02-1的方法，包括以下步骤：

(1)多糖提取：将远志干药材用乙醇水溶液(优选95％乙醇水溶液) 浸泡(例如，两至三周)脱脂，脱脂后倾去乙醇干燥(例如自然风干)；用沸水(例如，以1kg/4L的用量)提取，(例如，每次提取4-6h)，至硫酸-苯酚法检测无明显反应(例如，合计提取4-6次)；经过离心、滤液浓缩、透析、再浓缩操作，加入1-20倍(优选5倍)于浓缩液体积的乙醇水溶液(优选95％乙醇水溶液)，离心后得沉淀；所得沉淀再经无水乙醇与丙酮交替洗涤(例如，共3次)，最后(例如在真空干燥箱中)干燥得远志粗多糖；

(2)多糖纯化：取远志粗多糖，加10-15倍重量的水溶解，离心，对上清液(例如，经DEAE阴离子交换柱)进行分级纯化，依次用H₂O、0.05M NaCl、0.1M NaCl、0.2M NaCl洗脱，之后收集0.2M NaCl洗脱组分，浓缩，透析，干燥(例如冷冻干燥)，得到初步纯化的多糖RP02；将所得的多糖RP02 溶于0.2M NaCl中，离心，对上清液(例如，经Sephacryl HR S-300柱)进行分离，再以0.2M NaCl洗脱，收集洗脱组分，进行浓缩、透析、干燥(例如冷冻干燥)处理，得到多糖RP02-1。

本发明上述方法中，优选地，所述步骤(1)中透析操作为将浓缩后的滤液置于透析袋中，用流动的自来水透析2-3天。

本发明上述方法中，优选地，所述步骤(1)中干燥采用真空干燥，真空干燥的操作温度是40-60℃。

在本发明的方法中，例如可以用分子截留量为3,500Da的透析袋进行透析。

本发明上述方法中，优选地，所述步骤(2)中，洗脱速度是3-6mL/15min。

本发明上述方法中，优选地，所述步骤(2)中离心时间为10min，转速为4000r/min。

本发明上述方法中，优选地，所述步骤(2)中冷冻干燥处理的制冷温度为-50℃，后每小时升温5℃，最终温度为40℃，并持续干燥48h。

根据再一个方面，本发明提供多糖RP02-1的具体用途，包括：多糖RP02-1 在制备预防和/或治疗神经退行性疾病的药物或保健品中的用途；多糖RP02-1 在制备用于抑制Aβ₄₂的生成和聚集的药物或保健品中的用途；以及多糖 RP02-1在制备预防和/或治疗阿尔兹海默症的药物或保健品中的用途。

本发明通过药理实验表明上述多糖可以剂量依赖性地抑制稳定转染APP 和BACE1的CHO/APPBACE1细胞中和稳定转染APP Swedish突变的 HEK293-APP^sw细胞中Aβ₄₂的生成，并且所述多糖能明显抑制Aβ₄₂的聚集；同时具有潜在的治疗阿尔兹海默症的作用，能开发成治疗阿尔兹海默症的糖类药物。

附图说明

图1A为多糖RP02-1的特征¹³C NMR图谱；

图1B为多糖RP02-1的DEPT135图谱；

图2为多糖RP02-102I的特征HMBC图谱；

图3为多糖RP02-1的特征HMBC图谱；

图4A和4B分别为多糖RP02-1抑制HEK293-APP^sw细胞和 CHO/APPBACE1细胞中Aβ₄₂分泌量的柱状图；

图5A和5B分别为多糖RP02-1对HEK293-APP^sw细胞和 CHO/APPBACE1细胞活力影响的柱状图；

图6为多糖RP02-1抑制Aβ₄₂的聚集的折线图。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体说明。应当理解，以下文字仅仅用以描述本发明的一种或几种具体的实施方式，并不对本发明具体请求的保护范围进行严格限定。

实施例1：从远志中提取多糖的方法

(1)多糖提取：远志干药材5000g用95％乙醇水溶液浸泡两周脱脂，脱脂后倾去乙醇自然风干。用沸水(20升)提取，每次提取4h，至硫酸-苯酚法检测无明显反应，合计提取6次。使用GM-21离心机在8000rpm/min 条件下离心15min，弃去沉淀，滤液浓缩至小体积，再用分子截留量为3500Da 的透析袋对流动水透析3天，将透析内液加热浓缩至3L，离心弃去沉淀，将上清液在搅拌下加入15L的95％乙醇水溶液，静置过夜，离心得沉淀，所得沉淀经无水乙醇与丙酮交替洗涤各3次，离心分离，沉淀置于50℃下真空干燥，得水提取远志粗多糖68g；

(2)多糖纯化：取上述制备的水提远志粗多糖6g，加60mL的去离子水溶解，4000r/min离心10min除去不溶物，取上清液经DEAE Sepharose^TM Fast Flow阴离交换柱进行初步分级纯化，依次H₂O、0.05M NaCl、0.1M NaCl、 0.2M NaCl洗脱，硫酸-苯酚检测，并绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集合并 0.2M NaCl洗脱组分，使用1000mL的圆底烧瓶盛装0.2M洗脱组分，用旋转蒸发仪进行浓缩，并使用分子截留量为3,500Da的透析袋对去离子水透析 3天，后用冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到初步纯化的多糖RP02；

取200mg多糖RP02溶于4mL的0.2M NaCl中，4000r/min离心10min，取上清液经Sephacryl HR S-300凝胶色谱柱分离，再以0.2M NaCl洗脱并控制流速在3-6mL/15min。硫酸-苯酚法检测，在490nm波长下绘制洗脱曲线，从洗脱曲线得3个吸收峰，收集合并第1个吸收峰经HPGPC检测，重均分子量在11-239kDa且为单一对称的吸收峰即为组分多糖RP02-1，经过浓缩，透析，冷冻干燥，得远志多糖RP02-1约62mg。

实施例2：多糖RP02-1的结构鉴定及解析

将实施例1得到的多糖RP02-1进行结构鉴定及解析：

①采用高效凝胶渗透色谱系统，Sugar KS-802(排阻限：1×10⁴Da)； Sugar KS-804(排阻限：4×10⁵Da)串联柱，以用不同分子量的T-系列标准葡聚糖(Dextran)制作标准曲线；设定柱温为40℃，以0.1M NaNO₃作为流动相，流速为5mL/min，多糖RP02-1样品浓度为2mg/mL，测定多糖 RP02-1的分子量。经测定多糖RP02-1相对分子质量为116.0kDa。将其进行单糖组成分析，即将多糖完全水解、还原、乙酰化、萃取、浓缩后送入气相色谱分析。单糖组成分析结果显示，多糖RP02-1主要含有***糖，半乳糖，鼠李糖和半乳糖醛酸。结合部分酸水解、甲基化和核磁共振分析，如图 1、图2、图3，确定RP02-1为一果胶。

②单糖组成分析表明多糖RP02-1的单糖组成为：***糖、半乳糖、半乳糖醛酸和鼠李糖的质量比为63.5:19.8:8.4:8.3。

③多糖的部分酸水解：取200mg多糖RP02-1溶解于20mL的0.2M CF₃COOH中，密封后于100℃水解1h。反应完毕后，用甲醇反复减压蒸干，后用去离子水透析3次，每次1L(透析袋的截留分子量为3,500Da)，透析内外液浓缩、冷冻干燥得到部分酸水解产物RP02-102I(透析内液)和 RP02-102O(透析外液)。

④NMR分析

取30mg的多糖RP02-102I和30mg的多糖RP02-1，分别加D₂O 0.45mL 溶解，加2.5μL丙酮为内标(δ_H＝2.29ppm，δ_C＝31.5ppm)，于Bruker AVANCE III 500M核磁共振仪上，25℃分别测定一维和二维核磁共振谱，并参考核磁图谱对多糖RP02-1进行结构确证，结果如图2和图3所示。根据图2的 HMBC谱(异核多碳相关谱)和图3的HMBC谱(异核多碳相关谱)对多糖RP02-1进行结构确证。

¹³C-NMR谱中，如图1A所示，位于δ109-δ107的端基碳信号，分别为1,3,5-***糖，1,5-***糖和末端α构型***糖C1信号；位于δ106 -δ105的端基碳信号，分别为1,4-半乳糖、1,3-半乳糖、1,6-半乳糖、1,3,6- 半乳糖及末端半乳糖的C1信号；位于δ102.72的端基碳信号，为末端β构型***糖C1信号；位于δ101-δ99的端基碳信号，分别为1,2,4-鼠李糖和1,4-半乳糖醛酸的C1信号；在δ17.93为1,2,4-鼠李糖的甲基碳的信号峰。从上述结果可以发现RP02-1为一果胶多糖。

如图2所示在RP01-102I的HMBC图谱中，可以确定糖苷键之间的连接顺序。信号A(δ4.50/99.80)表明了1,4-连接的半乳糖醛酸的H-4和1,2,4- 连接的鼠李糖的C-1相关联。信号点B(δ78.80/5.32)表明了1,4-连接的半乳糖醛酸的C-4和1,2,4-连接的鼠李糖的H-1相关联。信号点C(δ99.80/4.50) 说明了1,2-连接的鼠李糖的C-1和1,4-连接的半乳糖醛酸的H-4相关联，并且信号D(δ78.80/5.32)说明1,4-连接的半乳糖醛酸的C-4与1,2-连接的鼠李糖的H-1耦合相关。这表明1,4-连接的半乳糖醛酸、1,2-连接的鼠李糖及 1,2,4-鼠李糖交替相连，分支取代在1,2,4-连接的鼠李糖的C-4位，推测其为一RG-I型果胶结构。信号E(δ3.76/104.65)表明了1,2,4-连接的鼠李糖的H-4和1,3,6-半乳糖的C-1耦合相关。信号F(δ4.12/104.65)和G(δ 70.50/4.51)分别表明了1,3,6-连接的半乳糖的H-6和1,6-连接的半乳糖的 C-1耦合相关，以及1,3,6-连接的半乳糖的C-6和1,6-连接的半乳糖的H-1 耦合相关。信号H(δ4.68/83.15)和I(δ104.65/4.87)表明了末端半乳糖的 H-1和1,3,6-连接的半乳糖的C-3耦合相关，以及末端半乳糖的C-1和1,3,6- 连接的半乳糖的H-3耦合相关，说明了末端半乳糖与1,3,6-连接的半乳糖的 C-3处相连。信号J(δ3.99/104.65)和K(δ70.50/4.51)说明1,6-连接的半乳糖的H-6和1,6-连接的半乳糖的C-1耦合相关，1,6-连接的半乳糖的C-6 和1,6-连接的半乳糖的H-1耦合相关。信号L(δ4.68/70.50)和M(δ 104.65/4.12)分别表明了末端半乳糖的H-1和1,6-连接的半乳糖的C-6相关联，以及末端半乳糖的C-1和1,6-连接的半乳糖的H-6相关联。在RP02-102I 的¹³C-NMR谱中，***糖的糖残基(末端α构型***糖，末端β构型***糖，1,5-连接的***糖和1,3,5-连接的***糖)消失，更加证明了其在酸水解时被降解。此外，1,4-连接的半乳糖和1,3-连接的半乳糖的连接方式也不再出现在RP02-102I中，这可以从RP02-1的HMBC谱(图3)来解释。通过分析RP02-1的HMBC谱，可进一步了解RP02-1的结构。信号a 和b分别位于δ4.70/78.74和δ3.75/105.60，分别表明了1,4-连接的半乳糖的 H-1和1,2,4-连接的鼠李糖的C-4相关联，以及1,2,4-连接的鼠李糖的H-4 和1,4-连接的半乳糖的C-1耦合相关，这提示我们1,4-连接的半乳糖通过1, 2,4-连接的鼠李糖的C-4位与其直接相连位于侧链上。信号c(δ5.16/78.06) 和d(δ4.24/107.67)表明了末端α构型***糖的H-1和1,4-连接的半乳糖的C-4相关联，以及1,4-连接的半乳糖的H-4和末端α构型***糖的C-1 相关联，这也提示我们末端α构型***糖通过1,4-连接的半乳糖的C-4位与其相连。信号e位于δ3.75/105.50表明了1,2,4-连接的鼠李糖的H-4和1, 3-链接的半乳糖的C-1相关联。信号f(δ5.22/80.82)和g(δ3.86/108.11) 表明了1,5-连接的***糖的H-1和1,3-连接的半乳糖的C-3相关联，以及 1,3-连接的半乳糖的H-3和1,5-连接的***糖的C-1相关联，这表明了1,5- 连接的***糖与1,3-连接的半乳糖相连接。信号h(δ108.11/3.87)和i(δ 5.25/67.41)分别表明了1,5-连接的***糖的C-1和相邻的1,5-连接的***糖的H-5相关联，以及1,5-连接的***糖的H-1和相邻的1,5-连接的***糖的C-5相关联，这也表明了在RP02-1中存在连续连接的1,5-连接的***糖。信号j(δ5.16/67.41)和k(δ3.87/107.67)分别表明了末端α构型***糖的H-1和1,5-连接的***糖的C-5相关联，以及1,5-连接的***糖的H-5和末端α构型***糖的C-1相关联。信号l(δ5.25/78.74) 和m(δ5.22/78.74)表明了1,5-连接的***糖的H-1与1,2,4-连接的鼠李糖的C-4相关联，这也进一步说明有一部分1,5-连接的***糖通过1,2,4- 连接的鼠李糖的C-4与其直接相连。信号n(δ108.11/3.97)和o(δ5.25/67.64) 表明了1,5-连接的***糖的C-1和1,3,5-连接***糖的H-5相关联，以及1,5-连接的***糖的H-1和1,3,5-连接的***糖的C-5相关联，说明 1,3,5-连接的***糖与1,5-连接的***糖直接相连。信号p(δ5.15/85.13) 和q(δ4.03/102.81)分别表明了末端β构型***糖的H-1和1,3,5-连接的***糖的C-3相关联，以及1,3,5-连接的***糖的H-3和末端β构型***糖的C-1相关联，表明了末端β构型***糖通过1,3,5-连接的***糖的C-3位与之直接相连。信号r位于δ4.54/69.90说明了1,3-连接的半乳糖的H-1和1,6-连接的半乳糖的C-6相关联。信号s位于δ3.86/107.67说明了1,3-连接的半乳糖的H-3和末端α构型***糖的C-1相关联。在部分酸水解的过程中，1,3-连接的半乳糖，1,4-连接的半乳糖和Ara从1,2,4-连接的鼠李糖的C-4位被降解，相应地出现了1,2-连接的鼠李糖的连接方式。基于以上分析结果，可推测出RP02-1的结构如下所示：

其中，a和b各自独立表示1,5-***糖(1,5-Ara)的数目，且a+b＝21； n为16-17的整数。

实施例3：多糖RP02-1抑制Aβ42的生成实验

HEK293-APP^sw和CHO/APPBACE1细胞中Aβ₄₂的ELISA检测

HEK293-APP^sw细胞(中国科学院上海药物研究所章海燕课题组惠赠)培养在包含10％胎牛血清(美国Gibco公司)，200μg/mL G418(美国Sigma 公司)的DMEM培养基(美国Hylcone公司)中；CHO/APPBACE1细胞(中国科学院上海药物研究所)所使用的培养基为含有10％胎牛血清，1％青霉素和链霉素的Ham’s F12培养基(美国Hylcone公司)。细胞均培养在37℃恒温湿润的含有5％二氧化碳的培养箱中。当HEK293-APP^sw和 CHO/APPBACE1细胞长至80％-90％汇合度时，将细胞以2×10⁵个/mL的密度接种于24孔板中，培养过夜后加入浓度分别为0mg/mL，0.125mg/mL， 0.25mg/mL，0.5mg/mL，1mg/mL的RP02-1溶液处理24h，收集上清液并加入蛋白酶抑制剂为实验样品。使用人Aβ₄₂ELISA试剂盒(Invitrogen公司) 来检测上清液中的Aβ₄₂含量。

1)上样：将不同浓度的标准品溶液和上述实验样品分别加入到已包被好捕获抗体的ELISA孔板(试剂盒自带)中，每孔加入50μL溶液；

2)每孔加入50μL检测抗体，于室温下孵育3h；

3)去除上清，加入1×washing buffer洗涤四次，每孔加入100μL标记辣根过氧化酶的兔抗工作液，于室温下孵育30min；

4)去除上清，加入1×washing buffer洗涤四次，每孔加入100μL 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺二盐酸显色底物(TMB)，于室温下避光孵育30min；

5)每孔加入50μL stop solution，用酶标仪检测450nm处的吸光度值，绘制标准曲线并计算Aβ₄₂的含量。

结果如图4所示，多糖RP02-1可以显著减少HEK293-APP^SW细胞(A)和 CHO/APPBACE1细胞(B)中Aβ₄₂的生成。其中，p＜0.05，*；p＜0.01，**； p＜0.001，***；表示与对照组(0mg/mL)相比的显著性差异程度。

细胞增殖实验检测多糖RP02-1对CHO/APPBACE1细胞生长的影响

HEK 293-APP^sw细胞用CCK8法检测细胞增殖情况。细胞以3×10³个/ 孔的密度接种于96孔板中，培养过夜后分别加入浓度为0mg/mL(对照组)， 0.0625mg/mL，0.125mg/mL，0.25mg/mL，0.5mg/mL，1mg/mL的RP02-1 处理48h后，去除上清，加入5mg/mL的CCK8溶液反应1h，用酶标仪检测490nm处的吸光度值。

CHO/APPBACE1细胞用MTT法检测细胞存活率。细胞以3×10³个/孔的密度接种于96孔板中，培养过夜后分别加入浓度为的RP02-1处理48h后，去除上清，加入5mg/mL的MTT(美国Sigma公司)溶液避光反应4h，每孔加入100μL DMSO溶解产生的甲瓒，用酶标仪检测490nm处的吸光度值。空白组设置为无细胞只有培养基的组。

细胞存活率＝(实验组OD值－空白组OD值)/(对照组OD值－空白组OD值)×100％。

结果如图5所示，不同浓度的多糖RP02-1分别处理细胞48h后，细胞的存活率分别均超过80％，说明多糖RP02-1无明显细胞毒性。

硫磺素T结合实验检测Aβ₄₂的聚集

Aβ₄₂粉末在冰上用110μL无水DMSO充分溶解，配成浓度为2mM的母液，保存于-80℃冰箱备用。黑色96孔板中每孔加入19μL纤维形成溶液 (50mM磷酸钠，pH＝7.5；100mM氯化钠，用超纯水配制，经0.22μm滤膜过滤后使用)和1μL Aβ₄₂溶液，并加入浓度为0mg/mL，0.2mg/mL，0.4 mg/mL，0.8mg/mL多糖溶液共同孵育30min后，加入80μL浓度为6.25μM 的硫磺素T溶液(用50mM甘氨酸溶液溶解并将pH调至8.5)，用酶标仪检测时间点为0h，12h，24h，30h，36h，48h时激发光为450nm和发射光为483nm处的吸光度值。

结果如图6所示，随着检测时间点的推移，不同浓度的多糖RP02-1能不同程度地降低ThT的荧光强度，且浓度越高抑制越明显，表明RP02-1抑制Aβ₄₂的聚集呈现一定的浓度依赖性。

综上，通过实施例可知，远志多糖RP02-1可以显著减少HEK293-APP^sw细胞和CHO/APPBACE1细胞中Aβ₄₂的生成并且可以抑制Aβ₄₂的聚集，无明显细胞毒性，表明多糖RP02-1成为治疗阿尔兹海默症的多糖类候选药物。

上面结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在获知本发明中记载内容后，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对其作出若干同等变换和替代，这些同等变换和替代也应视为属于本发明的保护范围。