具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种治疗视网膜变性相关疾病的靶向药物, 所述的靶向药物的靶点为溶酶体的调节因子v-ATPase。

所述的药物为用于修复视网膜色素上皮细胞上的溶酶体功能受损的药物。

根据权利要求1所述的靶向药物，所述的药物包括溶酶体的调节因子v-ATPase的激动剂。

所述的溶酶体的调节因子v-ATPase的激动剂为小分子化合物EN6（化学式C₁₉H₁₄F₂N₄O₂）。

所述的靶向药物为含有小分子化合物EN6的滴眼液。

一种溶酶体的调节因子v-ATPase的激动剂在制备治疗视网膜变性相关疾病的靶向药物上的应用。

所述的溶酶体的调节因子v-ATPase的激动剂为小分子化合物EN6。

所述的视网膜变性相关疾病为视网膜细胞功能障碍引起的视网膜变性相关疾病。

试验分析

材料和方法：

光损伤诱导小鼠视网膜变性相关疾病。

本研究所使用的小鼠均为2月龄的C57BL/6J野生型小鼠（后面简称野生型或WT小鼠）。为了诱导视网膜变性，野生型在第一天晚上8点到第二天早上8点置于黑暗环境中，随后马上利用18000 Lux的强光进行连续7天的处理，诱导视网膜退变。同时在处理的不同时间点取样，如4小时、1天、2天、3天等。

体内RPE吞噬能力检测。

视网膜外核层（ONL）的光感受器细胞是视觉光信号转导和维持视觉功能的关键细胞。光感受器细胞为了维持其生理功能，每天需要进行大量的代谢活动，由此产生了大量的毒性代谢产物。为了维持生理稳定，视网膜光感受器细胞通过频繁的切除其细胞外节（POS）来舍弃这些有毒的代谢产物。这些POS必需由RPE迅速的吞噬并清除，否则会引发炎症和自身免疫反应，造成视网膜退变。Rhodopsin是POS高表达的蛋白，在POS被RPE吞噬后可以在RPE的早期吞噬体中被检测到，通过Rhodopsin的免疫荧光可以分析RPE是否能正常吞噬并降解POS，以验证其吞噬能力。对不同处理的小鼠眼球样本利用Richardson固定液固定后，石蜡包埋并切片。获得石蜡切片后，脱蜡处理，0.04% Triton X-100透膜，10%山羊血清封闭后，利用Rhodopsin抗体进行免疫荧光染色，Zeiss LSM880激光共聚焦显微镜观察RPE中Rhodopsin阳性的吞噬体的情况。

EN6药物存储和给药方法。

以DMSO溶解EN6，并以5mM的浓度储存，临用前用磷酸缓冲盐溶液稀释到10 μM，以滴眼液式的给药方式，每只小鼠眼球给予2.5 μL药物，每天两次，间隔8小时或以上。

苏丹黑B染色。

不同处理的小鼠眼球样本经石蜡切片后，脱蜡处理，利用10%双氧水处理30分钟去色素，利用苏丹黑B染液显示脂褐质颗粒，并用核固染染液显示细胞核。

视网膜结构分析。

不同处理的小鼠眼球样本经石蜡切片后，脱蜡处理，行经典的苏木精伊红染色（HE染色）。利用Zeiss光学显微镜观察并拍照视网膜结构图象。以经过视神经的视网膜切片为基础，以视神经乳头（ONH）为中心点，间隔300微米计量视网膜外核层（ONL）的厚度，以显示视网膜光感受器细胞层的变化。

暗适应视网膜电生理检测（ERG）。

该检测反应小鼠视网膜的视觉功能。进行检测前，小鼠要暗室中过夜，随后利用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉，托吡卡胺散瞳后，用带有定制的Ganzfeld圆环的RETIport系统记录其视网膜电生理（ERG），包括a波和b波。

结果：

本研究利用国际公认的强光(18000 lux)诱导视网膜变性相关疾病的小鼠模型，分析视网膜变性中视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium, RPE）吞噬能力的变化及其在视网膜稳态维持中的功能，并利用该动物模型分析小分子药物EN6在维持高效的RPE吞噬功能从而抑制视网膜变性中的功能。

正是基于RPE吞噬的重要作用，为了检测视网膜变性过程中RPE吞噬能力的变化，以及RPE的吞噬能力是否与视网膜变性相关，我们首先利用光损伤诱导小鼠视网膜退变的模型，分析了相关生物学过程的变化。如图1A所示，强光诱导视网膜损伤后，随着损伤时间的延长，可以观察到RPE中出现了大量的Rhodopsin⁺的绿色荧光信号（见下排放大图），表明Rhodopsin⁺的吞噬体在RPE内出现显著的堆积，表明吞噬体降解异常。此一现象在损伤第七天时最为显著，表明RPE吞噬降解能力严重受损。与此相对应的，光损伤7天后，苏丹黑B染色显示吞噬体无法被正常降解后，造成了如白色箭头所示的蓝棕色毒性物质脂褐质的堆积（图1B），而在正常对照组中并未发现这一现象。现有的研究表明脂褐质会造成RPE功能进一步退化，是视网膜退变的重要因素。我们的结果也提示这些现象伴随着视网膜退变的出现，尤其在损伤第七天时，视网膜退化现象最为显著，这与RPE吞噬降解能力受损程度相一致（图1C，D）。其中图1C为苏木精伊红染色显示视网膜结构的结果，图1D为利用与C图中相似的重复实验结果，统计分析ONL厚度变化（One-way ANOVA, n=6），可见光损伤7天后，ONL出现明显退化。*表示P< 0.05。 标尺为20 μM. LD，light damage，光损伤。这些结果表明RPE吞噬能力的障碍与视网膜退变存在相关性。

基于上述的实验结果，同时考虑到溶酶体在RPE吞噬降解过程中的重要作用以及溶酶体在维持视网膜稳态的重要功能，我们推测视网膜变性中RPE吞噬降解能力的缺陷是由于溶酶体功能受损，而通过恢复溶酶体功能或许能挽救RPE吞噬能力从而抑制视网膜变性。基于上述的假设，我们利用了溶酶体重要的调节因子v-ATPase的激动剂EN6，分析了这一小分子药物对RPE吞噬能力和视网膜变性的影响。如图2A所示，与溶剂处理组相比，未经强光诱导视网膜损伤的小鼠经EN6处理后，Rhodopsin⁺的绿色荧光信号并未发生显著改变，提示EN6并未显著影响野生型小鼠正常生理条件下的RPE吞噬能力，但是在强光损伤7天时，与溶剂处理组相比，EN6显著的减少了RPE中绿色荧光信号所代表的Rhodopsin的堆积，表明EN6处理显著减少了Rhodopsin⁺的吞噬体，同时苏丹黑B染色显示脂褐质（白色箭头所指）沉积减少（图2B），表明EN6能够在视网膜损伤情境下，恢复RPE的吞噬能力，防止毒性物质脂褐质的产生。苏木精伊红染色则进一步证明，EN6能够有效的防止视网膜的退化，其中视网膜外核层的光感受器细胞得到明显的保存（图2C，D），表明EN6确实发挥了抑制视网膜变性的进展，保护视网膜的治疗效果。此外，图3A为暗适应视网膜电生理（ERG）检测的结果，证明EN6能够在视网膜退变条件下，有效保护视网膜的电生理功能。其中，与溶剂处理组相比，视网膜电生理的检测结果表明，野生型小鼠在强光损伤7天后，EN6处理组暗反应的a波和b波均显著高于溶剂对照组（图3A，B），表明EN6能够有效的避免视网膜变性件下的视网膜电生理功能的退化，发挥保护视功能的治疗效果。

结论：

EN6能够有效的恢复视网膜退变情境下视网膜色素上皮细胞的吞噬能力，促进光感受器细胞外节的清除，维持视网膜稳态，有效保存视网膜结构和视觉功能，发挥治疗视网膜变性相关疾病的效果。

各位技术人员须知：虽然本发明已按照上述具体实施方式做了描述，但是本发明的发明思想并不仅限于此发明，任何运用本发明思路的改装，都将纳入本专利专利权保护范围内。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。