具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另有说明，用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本发明的教导。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。

本发明中用端点表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数，以及所引述的端点。

本发明涉及特异性抑制CLRN3基因转录或翻译，或能够特异性抑制CLRN3蛋白的表达或活性的分子在制备防治肿瘤的药物中的用途；

其中所述肿瘤选自肠癌、肺癌和胃癌。

容易理解，根据本发明所记载的内容，从蛋白水平或者mRNA水平对CLRN3基因的表达进行抑制都将是有效的。抑制可以是部分减弱CLRN3基因的表达，也可以是使得其表达沉默。

术语“防治肿瘤”是指对预防、治疗或辅助治疗肿瘤、或抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和/或存活。

所述分子应当理解为包括但不限于核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白和干扰慢病毒，优选自核酸分子、抗体药或干扰慢病毒。

在一些实施方式中，所述核酸分子选自：反义寡核苷酸、dsRNA、micro RNA、siRNA或者shRNA。

在本发明中，所述siRNA，即小干扰RNA(small interfering RNA)是一种双链小RNA分子，其由完全互补的第一链和第二链组成，由Dicer(RNAaseⅢ家族中对双链RNA具有特异性的酶)加工而成。所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与CLRN3基因中的靶序列相同，或者为与该靶序列在高等严紧条件下杂交的序列。所述双链RNA第一链和第二链的长度均为10～30个核苷酸；优选地，长度均为15～27个核苷酸；更优选19～23个核苷酸，也可以选择20、21或者22个核苷酸。siRNA是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是指内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的细胞内mRNA发生特异性降解，从而导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型缺失的现象。

在一些实施方式中，所述siRNA包含第一链和第二链，所述第一链和第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列包含选自1)～3)所示的序列中的一种：

1)SEQ ID NO：1～3至少一种所示的序列；

2)与1)中的序列在高等严紧条件下杂交的序列；

3)与1)或2)所述序列互补的序列。

本发明的siRNA可通过本文实施例中公开的方法或者本领域已知的方法筛选。

在本发明中，“杂交条件”根据测量杂交时所用条件的“严紧性”程度来分类。严紧性程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)为依据。例如，“最大严紧性”典型地发生在约Tm-5℃(低于探针Tm 5℃)；“高等严紧性”发生在Tm以下约5℃～10℃；“中等严紧性”发生在探针Tm以下约10℃～20℃；“低严紧性”发生在Tm以下约20℃～5℃。作为替代，或者进一步地，杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和/或一或多次的严紧性洗涤为依据。例如，6×SSC＝极低严紧性；3×SSC＝低至中等严紧性；1×SSC＝中等严紧性；0.5×SSC＝高等严紧性。从功能上说，可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严紧同一或近严紧同一的核酸序列；而采用高等严紧性条件确定与该探针有约80％或更多序列同一性的核酸序列。

对于要求高选择性的应用，典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体，例如，选择相对低的盐和/或高温度条件。Sambrook等(Sambrook,J.等(1989)分子克隆，实验室手册，Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.)提供了包括中等严紧性和高等严紧性在内的杂交条件。

为便于说明，用于检测本发明的多核苷酸与其它多核苷酸杂交的合适的中度严紧条件包括：用5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)溶液预洗；在50-65℃下在5×SSC中杂交过夜；随后用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC在65℃下各洗涤两次20分钟。本领域技术人员应当理解，能容易地操作杂交严紧性，如改变杂交溶液的含盐量和/或杂交温度。例如，在另一个实施方案中，合适的高度严紧杂交条件包括上述条件，不同之处在于杂交温度升高到例如60℃～65℃或65℃～70℃。

在本发明中，所述shRNA，即小发卡或短发卡RNA(a small hairpin RNA orshorthairpin RNA，shRNA)是一段具有紧密发卡环(tight hairpin turn)的RNA序列，其包含正义链片段、反义链片段以及连接正义链片段和反义链片段的茎环结构，常被用于RNA干扰沉默靶基因的表达。其中正义链和反义链的序列互补，并且所述正义链片段的序列与CLRN3基因中10～30个连续的核苷酸序列相同，优选地，所述正义链片段与CLRN3基因中15～27个连续的核苷酸序列相同；更优选地，所述正义链片段与CLRN3基因中19～23个核苷酸相同，也可以选择19、20或者21个连续的核苷酸序列相同，或者为与上述各序列在高等严紧条件下杂交的序列。shRNA的发卡结构可被细胞机制切割成siRNA，然后siRNA结合到RNA诱导沉默复合物上(RNA-inducedsilencing complex，RISC)，该复合物能够结合到目的mRNAs并将其降解。

在一些实施方式中，所述shRNA包含正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列包含1)～3)所示的序列中的一种：

1)SEQ ID NO：1～3至少一种所示的序列；

2)与1)中的序列在高等严紧条件下杂交的序列；

3)与1)或2)所述序列互补的序列。

进一步地，所述shRNA的茎环结构的序列可为本领域的常规选择，例如选自以下任一种序列：UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CUCGAG、AAGCUU和CCACACC。

根据本发明的再一方面，还涉及核酸构建体在制备防治肿瘤的药物中的用途；

其中所述肿瘤选自肠癌、肺癌和胃癌；

所述核酸构建体包含如上所定义的siRNA、或如上所定义的shRNA。

在本发明中，所述核酸构建体是指包括复制系统以及能够在给定的靶细胞内转录和翻译多肽编码序列的序列。

当核酸构建体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，其也被称为载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。进一步地，所述载体还含有编码细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列；所述可被检测的标记物例如为绿色荧光蛋白(GFP)。

在一些实施方式中，所述核酸构建体为慢病毒载体。

在本发明中，所述慢病毒载体的种类为本领域所公知，例如选自：pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ。

根据本发明的再一方面，还涉及药物组合物在制备防治肿瘤的药物中的用途；

其中所述肿瘤选自肠癌、肺癌和胃癌；

所述药物组合物含有如上所定义的siRNA、如上所定义的shRNA、如上所定义的核酸构建体中的至少一种，以及药学上药学上可接受的载体或赋形剂。

在制备这些药物组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括:湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。

所述药物组合物用于预防或治疗对象体内肿瘤时，需要将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。采用该方法，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的部分被抑制。

所述方法的施用对象可以为动物，优选哺乳动物，优选灵长类动物，更优选为人。

根据本发明的再一方面，还涉及分离的CLRN3基因或CLRN3蛋白在筛选防治肿瘤的药物中的用途；

其中所述肿瘤选自肠癌、肺癌和胃癌。

在一些实施方式中，所述CLRN3基因为全长基因的部分片段，至少包含1)～3)所示的序列中的一种：

1)SEQ ID NO：1～3至少一种所示的序列；

2)与1)中的序列在高等严紧条件下杂交的序列；

3)与1)或2)所述序列互补的序列。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例1针对人CLRN3基因RNAi慢病毒的制备

1)筛选针对人CLRN3基因的有效的shRNA靶点

从Genbank调取CLRN3(NM_152311)基因信息；设计针对CLRN3基因的有效的shRNA靶点。

最终所设计的shRNA的序列如表1所示。

表1

2)慢病毒载体的制备

针对shRNA靶点合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列，使其线性化，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段，所用体系如表2所示。

表2

通过T4 DNA连接酶将双酶切线性化的载体DNA和纯化好的双链DNA Oligo连接，酶切体系，37℃，反应1h。在适当的缓冲体系中于16℃连接过夜，回收连接产物。将连接产物转化氯化钙制备的新鲜的大肠杆菌感受态细胞。在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下，溶于10μl LB培养基，混匀取1μl作为模板；在以慢病毒载体中RNAi序列的上下游，设计通用PCR引物，进行PCR鉴定实验。对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的克隆即为构建成功的针对表达RNAi的载体，命名为pCMV-GFP-CLRN3-siRNA。

构建pCMV-GFP-NC-siRNA阴性对照质粒，阴性对照siRNA靶序列为与实验组相同碱基组成的无意义序列TCACCGAGATGAAGATATC，pCMV-GFP-NC载体的空载载体图谱如图1所示。构建pCMV-GFP-NC-siRNA阴性对照质粒时，针对ScrsiRNA靶点合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列，其余构建方法、鉴定方法及条件均同pCMV-GFP-CLRN3-siRNA。

通过T4DNA连接酶将双酶切线性化的载体，酶切体系如表3所示，37℃，反应1h。

表3

3)包装CLRN3-siRNA慢病毒

以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取RNAi质粒pCMV-GFP-CLRN3-siRNA的DNA，配制成100ng/μl储存液。

转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的人胚肾细胞293T细胞，以含10％胎牛血清的DMEM完全培养基调整细胞密度为1.5×10⁵细胞/ml，接种于6孔板，37℃，5％CO₂培养箱内培养。待细胞密度达70％～80％时即可用于转染。转染前2h，吸出原有培养基，加入1.5ml新鲜的完全培养基。按照Sigma-aldrich公司的MISSION Lentiviral Packaging Mix试剂盒的说明，向一灭菌离心管中加入Packing Mix(PVM)20μl，PEI 12μl，无血清DMEM培养基400μl，取20μl上述抽提的质粒DNA，加至上述PVM/PEI/DMEM混合液。

将上述转染混和物在室温下孵育15min，转移至人胚肾细胞293T细胞的培养基中，37℃，5％CO₂培养箱内培养16h。弃去含有转染混和物的培养介质，PBS溶液洗涤，加入完全培养基2ml，继续培养48h。收集细胞上清液，Centricon Plus-20离心超滤装置(Millipore)纯化和浓缩慢病毒，步骤如下：(1)4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；(2)0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；(3)4000g离心，10-15min，至需要的病毒浓缩体积；(4)离心结束后，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开，将过滤杯倒扣在样品收集杯上，离心2min离心力不超过1000g；(5)把离心杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中的即为病毒浓缩液。将病毒浓缩液分装后于-80℃保存。对照慢病毒的包装过程同CLRN3-siRNA慢病毒，仅以pCMV-GFP-NC-siRNA载体代替pCMV-GFP-CLRN3-siRNA载体。

实施例2实时荧光定量RT-PCR法检测CLRN3基因的沉默效率

处于对数生长期的人肠癌RKO细胞、肺癌A549细胞，胃癌BGC-823细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为2×10⁵/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数(MOI，RKO∶10，A549∶20，BGC-823∶20)值，加入适宜量的实施例1制备的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到3d后，收集细胞。根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书，抽提总RNA。根据Promega公司的M-MLV操作说明书，将RNA逆转录获得cDNA，逆转录反应体系见表4，42℃反应1h，然后在70℃水浴锅中水浴10min使逆转录酶失活。

表4

采用TP800型Real time PCR仪(TAKARA)进行实时定量检测。

设定程序为两步法Real-time PCR：预变性95℃，15s；之后每一步变性95℃，5s；退火延伸60℃，30s；共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。PCR结束后，95℃变性1min，然后冷却至55℃，使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4s，同时读取吸光值，制作熔解曲线。采用2^-ΔΔCt分析法计算侵染了CLRN3 mRNA的表达丰度。侵染对照病毒(Lv-NC-shRNA)的细胞作为对照。

实验结果如图2所示。从图2A中可以看出，三种shRNA对于三种肿瘤细胞中CLRN3mRNA具有很强的抑制作用，且shCLRN3-3效果最佳，因而后续实验均只对shCLRN3-3进行检测。图2B为qRT-PCR检测人肠癌RKO细胞、肺癌A549细胞，胃癌BGC-823细胞感染shCLRN3-3后，细胞中CLRN3的敲减效率，均大于50％。

实施例3检测侵染了CLRN3-shRNA慢病毒的肿瘤细胞的增殖能力

处于对数生长期的人肠癌RKO细胞、肺癌A549细胞，胃癌BGC-823细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×10⁴/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数(MOI，RKO:10，A549:20，BGC-823：20)，加入适宜量的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5d后，收集处于对数生长期的各实验组细胞。完全培养基重悬成细胞悬液(2×10⁴/ml)，以细胞密度约为2000个/孔，接种96孔板。每组3-5个复孔，每孔100μl。铺好板后，置37℃、5％CO₂培养箱培养。从铺板后第二天开始，培养终止前2～4h加入10μLCCK-8试剂于孔中，无需换液。4h后96孔板置于振荡器上振荡2-5min，酶标仪450nm检测OD值。

结果如图3所示：CCK8检测显示相对于对照组，感染shCLRN3-3后，人肠癌RKO细胞(图3A)、肺癌A549细胞(图3B)，胃癌BGC-823(图3C)细胞的增殖被明显抑制。

实施例4侵染慢病毒的肿瘤细胞克隆形成能力的检测

将人肠癌RKO细胞、肺癌A549细胞、胃癌BGC-823细胞胰酶消化后接种于12孔板中，细胞密度为10-15％。第二天换为新鲜的培养基，内含5ug/ml polybrene。将CLRN3-shRNA慢病毒按照MOI，RKO:10，A549:20，BGC-823：20加入到培养板中，感染12-24h后换新鲜的培养基。感染72h后，荧光显微镜下观察荧光，感染效率达到90％。

将处于对数生长期的感染病毒后的细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液；细胞计数后接种于6孔板中(800个细胞/孔，每个实验组设置3个复孔)，将接种好的细胞于培养箱中继续培养到14d或绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止，中途隔3d进行换液并观察细胞状态；实验终止前荧光显微镜下对细胞克隆进行拍照；实验终止时用PBS洗涤细胞1次，多聚甲醛固定细胞30～60min，PBS洗涤细胞1次，每孔加入洁净、无杂质GIEMSA染液500μL，染细胞20min，ddH₂O洗细胞数次，直至洗净板上背景，晾干，显微镜下拍照单克隆，数码相机拍照整张板，克隆计数。

结果如图4所示，克隆形成实验表明，相比于对照组，感染shCLRN3的的细胞克隆数明显降低。

实施例5侵染慢病毒的肿瘤细胞细胞凋亡水平检测

人肠癌RKO细胞、肺癌A549细胞、胃癌BGC-823细胞胰酶消化后接种于12孔板中，细胞密度为10-15％。第二天换为新鲜的培养基，内含5ug/ml polybrene。将CLRN3-shRNA慢病毒按照MOI，RKO:10，A549:20，BGC-823：20加入到培养板中，感染12-24h后换新鲜的培养基。感染72h后，荧光显微镜下观察荧光，感染效率达到90％。

收集感染后各实验组细胞培养上清于5ml离心管中，D-Hanks洗涤细胞一次，胰酶消化细胞，培养上清终止化，收集细胞于同一5ml离心管中。每组设三个复孔；1500rmp 5min离心，弃去上清；PBS洗涤细胞沉淀一次，1500rmp5min离心，收集细胞；1×binding buffer洗涤细胞沉淀一次，1500rmp 5min离心，收集细胞；1ml(根据细胞沉淀量决定加入染色缓冲液体积，使细胞悬液最终密度为1×10⁶～1×10⁷cell/ml)1×staining buffer重悬细胞沉淀；取细胞悬液100ul(1×10⁵～1×10⁶细胞)，加入5ul annexin V-APC染色，室温避光10～15min；转移至流式上机管中，上机检测。

实验结果如图5所示，流式凋亡检测结果显示，相比于对照组，感染shCLRN3的细胞凋亡数目明显增加。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 上海粒成生物科技有限公司

<120> CLRN3基因作为肿瘤治疗靶点的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

catgatactg tttgtggcga a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 2

gagtagtgaa gaattgagtc a 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 3

cagtacaatt gctgttagag a 21