阅读说明：本技术 一种基于钒酸铋的光电化学检测miRNA-21含量的方法 (Bismuth vanadate-based method for photoelectrochemical detection of miRNA-21 content ) 是由 王光丽 刘田利 顾萌萌 孙冬雪 于 2020-06-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于钒酸铋的光电化学检测miRNA-21含量的方法,属于分析检测领域。本发明方法结合miRNA-21介导的滚环扩增、内切酶特异性识别水解反应与亚甲基蓝或耐尔蓝对双链DNA的特异性嵌入所造成的BiVO<Sub>4</Sub>修饰电极的光电信号激发,构建信号“增强型”检测。本发明方法在0.005-10000pM浓度范围内可实现高灵敏检测miRNA-21,检测限低至0.3fM。与传统方法相比,本发明所提出的无标记光电化学检测方法具有成本低,操作简便灵活,试剂用量小,灵敏度高,背景信号小等优点,有望成为有效检测miRNA-21的方法之一。(The invention discloses a bismuth vanadate-based method for photoelectrochemical detection of miRNA-21 content, and belongs to the field of analysis and detection. The method combines miRNA-21 mediated rolling circle amplification, endonuclease specific recognition hydrolysis reaction and BiVO (BiVO) caused by specific embedding of methylene blue or Nerlan to double-stranded DNA (deoxyribonucleic acid) 4 And (3) exciting a photoelectric signal of the modified electrode to construct signal 'enhanced' detection. The method can realize high-sensitivity detection of miRNA-21 within the concentration range of 0.005-10000pM, and the detection limit is as low as 0.3 fM. Compared with the traditional method, the label-free photoelectrochemical detection method provided by the invention has the advantages of low cost, simple and flexible operation, small reagent dosage, high sensitivity, small background signal and the like, and is expected to become one of the methods for effectively detecting miRNA-21.)

一种基于钒酸铋的光电化学检测miRNA-21含量的方法

技术领域

本发明属于分析检测领域，涉及一种基于钒酸铋的光电化学检测miRNA-21含量的方法。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是内源的、进化上保守的、非编码的单链RNA[He L,HannonG.J.Nat.Rev.Genet.2004,5:522–531.]，其在调节转录中起着至关重要的作用，并在多种生物过程(如细胞增殖，分化，凋亡和造血中)起重要的调节作用[Wang Y,Li Z H,Weber TJ,Hu D H,Lin C T,Li J H,Lin Y H.Anal.Chem.2013,85:6775–6782；Wang Y,Tang L H,Li Z H,Lin Y H,Li J H.Nat.Nat.Protoc.2014,9:1944–1955.]。研究表明，miRNA的表达可能与许多人类疾病密切相关[Esquela-Kerscher A,Slack F J.Nat.Rev.Cancer 2006,6:259–269；Gupta A,Gartner J J,Sethupathy P,Hatzigeorgiou A G,Fraser NW.Nature 2008,451:600–600.]，其可以作为疾病诊断的生物标志物[Grosshans H,Filipowicz W.Nature 2008,451:414–416.]。传统的miRNA检测方法样品预处理耗时，实验过程复杂和实验成本高，严重限制了它们的实际应用[Jia H,Li Z,Liu C,ChengY.Angew.Chem.Int.Ed.2010,49:5498–5501.]。因此，开发检测miRNA的高灵敏检测方法具有重要意义。

发明内容

光电化学(PEC)分析是基于光激发下的光活性材料与待分析物之间的直接或间接相互作用而建立起来的一种新型分析方法。在检测过程中，外加激发光源所产生的电信号可以有效被区分，因此背景信号可以明显降低，传感器的性能较高。近年来光电化学生物传感器得到了快速发展并且被广泛应用到很多领域。

本发明采用的光电材料为绿色环保的铋基化合物BiVO₄[Li H,SunH.Curr.Opin.Chem.Biol.2012,16:74-83.]。铋基化合物由(Bi₂O₂)²⁺主体层和其他客体离子层形成的层状结构，该层状结构有助于光生电子在层间的迁移，有效减少光生电子-空穴的复合，进而提高光生载流子的利用效率。BiVO₄在LED光源激发下，价带上电子跃迁至导带，同时空穴留在价带，导带上传到电极，产生阳极光电流。电子供体存在下可以有效消耗BiVO₄价带上的空穴，降低了空穴电子的复合效率，使得光电流大大提高。本发明构建的传感器在目标分子miRNA存在时，引发滚环扩增反应，在核酸内切酶的辅助下，产生许多单链DNA；并且可与固定在电极上的DNA杂交成双链DNA，将信号分子嵌入电极上的双链DNA中，激发BiVO₄的光电流信号，产生的光电流信号变化差值与目标物浓度相关，进而达到检测miRNA的目的。该方法使用的生物探针均不需繁琐且昂贵的标记，因此大大节省试验成本，提高了检测的方便性，灵敏度高，选择性好。

本发明的目的在于提供一种快速、高效的miRNA光电化学检测方法，该方法具有线性范围宽、检测限低(灵敏度高)、特异性强、使用方便、成本低廉等优点。

基于此目的，本发明设计思路为：目标物存在下引发的RCA反应、内切酶消化反应以及电极表面的DNA杂交反应导致大量的信号分子通过双链DNA固定到电极表面，可测得高光电流信号；无目标物时，上述的反应被抑制，电极表面仅存在单链DNA，引入EXOⅠ消化水解单链DNA，成功降低背景信号，测得光电流信号较低。

本发明提供了一种光电化学检测miRNA-21含量的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)BiVO₄/ITO电极的制备：将BiVO₄分散于水中，形成BiVO₄悬浊液；然后再ITO电极表面滴涂BiVO₄悬浊液，干燥，即得BiVO₄/ITO电极；

(2)生物识别及信号放大反应：对不同miRNA-21浓度的样品分别进行扩增反应，然后加入核酸内切酶进行酶切反应，得到含有较多单链DNA的裂解液；

(3)电极表面杂交识别反应和光电流测定：通过戊二醛交联反应将胺官能团化的探针DNA固定到BiVO₄/ITO电极上；然后将步骤(2)所得裂解液、缓冲液体系加入到电极表面，先进行杂交反应，然后加入EXO I继续反应，最后加入信号分子溶液进行孵育；孵育完成后，以该电极作为工作电极，采用三电极体系，进行光电流测定，得到不同已知浓度的miRNA-21体系相应的光电流值；

(4)线性模型构建：通过步骤(3)所得的不同miRNA-21浓度的样品和miRNA-21浓度为0的样品所得的光电流值计算得到不同浓度相应的光电流差值ΔI(ΔI，为有、无miRNA-21存在时的光电流相减所得的差值)；然后利用光电流差值与miRNA-21的浓度构建线性模型。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中BiVO₄悬浊液的浓度为1mg/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中BiVO₄可通过如下方法制备得到：

将铋盐溶液与钒酸盐溶液混合，两种溶液的物质的量浓度之比为1:1，混匀后，移入高压反应釜中，一定温度下反应一定时间；自然冷却至室温后，无水乙醇与蒸馏水交替洗涤产物，并在干燥箱中烘干过夜，得到粉末状产物。

在本发明的一种实施方式中，制备BiVO₄时采用的钒酸盐为偏钒酸铵或钒酸钾中的一种；铋盐为硝酸铋。

在本发明的一种实施方式中，制备BiVO₄时的反应温度100-200℃，反应时间为8-20h。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中扩增反应包括如下过程：

在含有10mM MgCl₂的pH＝7.5 40mM Tris-HCl缓冲溶液中，将锁式探针与不同浓度的miRNA-21混合，在37±0.5℃下杂交孵育1小时；然后，加入T4 DNA连接酶以及含有10mMMgCl₂、0.5mM ATP的pH＝7.5 40mM Tris-HCl缓冲溶液中，在22±0.5℃下孵育1小时；接下来，加入phi29 DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸以及含有10.0mM MgCl₂、50mM KCl、5mM(NH₄)₂SO₄的pH＝7.5 40.0mM Tris-HCl缓冲溶液中，在30±0.5℃下进行2小时的扩增反应。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中酶切反应包括如下过程：

加入核酸内切酶以及含有50mM NaCl、5mM MgCl₂、0.5mM二硫苏糖醇的pH＝7.925mM Tris-HCl缓冲溶液中，在55±0.5℃下进行1小时的酶切反应。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中具体是通过戊二醛交联反应将胺官能团化的探针DNA固定到BiVO₄/ITO电极上，4±0.5℃潮湿环境中下孵育过夜。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中缓冲液体系为含有0.1M NaCl、1mMMgCl₂的pH＝7.4 10mM Tris-HCl缓冲溶液。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中是将裂解液、缓冲体系滴加至电极表面，在37±0.5℃下进行1小时的杂交反应；引入EXO I，在37±0.5℃下反应30分钟；最后，取10μM信号分子溶液在电极表面37±0.5℃下孵育15分钟。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中的光电流测定是采用三电极体系，通过电流-时间技术，以所制备的电极作为工作电极，置于pH＝7的Tris-HCl中，在相对于Ag/AgCl参比电极为0V的电压下进行测定。

在本发明的一种实施方式中，生物识别及信号放大反应中用到的miRNA-21碱基序列为5'–UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A–3'；锁式探针的碱基序列为5'–TGA TAA GCTACC ACC TCC GCG CGA AGT CTC AAC ATC AGT C–3'；固定电极上的探针DNA碱基序列为5'–NH₂–C₆ CCA CCT CCG CGC GAA GTC TCA A–3'。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中信号分子为亚甲基蓝(MB)和/或耐尔蓝(NB)。

在本发明的一种实施方式中，所述方法还包括：按照步骤(2)处理待测样品，得到相应的裂解液，然后通过步骤(3)测得待测样品的光电流值；然后通过步骤(4)所得线性模型，计算得到待测样品中miRNA-21的浓度。

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体包括如下步骤：

a、BiVO₄的制备：将20mL硝酸铋溶液与20mL钒酸盐溶液混合，两种溶液的物质的量浓度之比为1:1，搅拌30分钟后，移入高压反应釜中，一定温度下反应一定时间；自然冷却至室温后，无水乙醇与蒸馏水交替洗涤产物，并在干燥箱中烘干过夜，得到粉末状产物；

b、BiVO₄修饰ITO电极的制备：称取上述制备好的BiVO₄粉末加入到水中，超声得到1mg/mL的悬浊液；在预先清洗处理过的ITO电极表面滴涂30μL BiVO₄悬浊液，在40℃下烘干2小时备用；

c、生物识别及信号放大反应：在含有10mM MgCl₂的pH＝7.5 40mM Tris-HCl缓冲溶液中，将锁式探针与不同浓度的miRNA-21混合，在37℃下杂交孵育1小时；然后，加入T4DNA连接酶以及含有10mM MgCl₂、0.5mM ATP的pH＝7.5 40mM Tris-HCl缓冲溶液中，在22℃下孵育1小时；接下来，加入phi29 DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸以及含有10.0mMMgCl₂、50mM KCl、5mM(NH₄)₂SO₄的pH＝7.5 40.0mM Tris-HCl缓冲溶液中，在30℃下进行2小时的扩增反应；最后，加入核酸内切酶以及含有50mM NaCl、5mM MgCl₂、0.5mM二硫苏糖醇的pH＝7.9 25mM Tris-HCl缓冲溶液中，在55℃下进行1小时的酶切反应；

d、电极表面DNA杂交识别反应及光电流的测定：通过戊二醛交联反应将胺官能团化的探针DNA固定到BiVO₄/ITO电极上，4℃潮湿环境中下孵育过夜，取步骤c最终裂解液与含有0.1M NaCl、1mM MgCl₂的pH＝7.4 10mM Tris-HCl缓冲溶液中，然后滴加在电极表面，在37℃下进行1小时的杂交反应；引入EXOⅠ，在37℃下反应30分钟；最后，取10μM信号分子溶液在电极表面37℃下孵育15分钟；采用三电极体系，通过电流-时间技术，将步骤d制备电极作为工作电极，置于pH＝7的Tris-HCl中，在相对于Ag/AgCl参比电极为0V的电压下，进行光电流测定。

在本发明的一种实施方式中，当待测样品中存在目标miRNA-21时，miRNA-21与锁式探针结合引发恒温滚环扩增，短时间内核酸呈指数式扩增产生一条长长的单链DNA，引入核酸内切酶来消化水解RCA产生单链DNA成短小cDNA，cDNA与电极上固定的探针DNA杂交成双链DNA可将信号分子有效嵌入，未杂交探针DNA引入EXOⅠ进行消化水解，有效降低背景；利用信号分子与BiVO₄之间产生的光电流信号，达到检测目的。

本发明有益效果：

本发明检测方法快速、高效，具有线性范围宽(0.005-10000pM)、检测限低至0.3fM(灵敏度高)、特异性强、使用方便、成本低廉等优点，具有非常广阔的应用前景。

附图说明

图1是BiVO₄修饰的电极加入MB之前(a)和之后(b)的光电流比对图。

图2A)不同浓度的MB(a到i依次为0,0.005,0.01,0.05,0.1,0.5,1,5,10μmol/L)对实施实例1制备的BiVO₄光电流影响；B)光电流变化差值与MB浓度的对数的线性关系图。

图3是实施实例1制备的BiVO₄对不同浓度的miRNA-21(a到k依次0,0.005,0.01,0.05,0.1,0.5,1,10,100,1000,10000pM)的响应变化图。

图4是实施实例1的方法中得到的光电流变化与miRNA-21浓度的对数的线性关系图。

具体实施方式

实施例1

a、BiVO₄的制备：称取2.0g硝酸铋溶于20mL乙二醇中，磁力搅拌直至溶解，作为溶液A；称取0.5g偏钒酸铵20mL 80℃去离子水中，磁力搅拌直至溶解，作为溶液B；将溶液B逐滴加入到溶液A中，搅拌30分钟，移入高压釜中，在100℃加热15小时；自然冷却至室温后，无水乙醇与蒸馏水交替洗涤至上清液呈中性，并在干燥箱中60℃烘干过夜；

b、BiVO₄修饰ITO电极的制备：称取上述制备好的BiVO₄粉末加入到去离子水中，超声得到1mg/mL的悬浊液；在预先清洗处理过的ITO电极表面滴涂30μL BiVO₄悬浊液，在40℃下烘干2小时备用；

c、生物识别及信号放大反应：将20μL，1μM锁式探针与10μL不同浓度的miRNA-21混合在50μL含有10mM MgCl₂的pH＝7.5 40mM Tris-HCl缓冲溶液中，在37℃下反应1小时；然后，加入40U T4DNA连接酶以及50μL含有10mM MgCl₂、0.5mM ATP的pH＝7.5 40mM Tris-HCl缓冲溶液中，在22℃下进行1小时的连接反应；接下来，加入10U phi29DNA聚合酶、4.4μL，10mM脱氧核糖核苷三磷酸以及50μL含有10.0mM MgCl₂、50mM KCl、5mM(NH₄)₂SO₄的pH＝7.540.0mM Tris-HCl缓冲溶液中，在30℃下进行2小时的扩增反应；最后，加入20U Nt.BstNBⅠ核酸内切酶和20μL含有50mM NaCl、5mM MgCl₂、0.5mM二硫苏糖醇的pH＝7.9的25mM Tris-HCl缓冲溶液中，在55℃下进行1小时的酶切反应；

d、电极表面DNA杂交识别反应及光电流的测定：将15μL，2μM胺基官能团化的探针DNA通过戊二醛交联反应固定到BiVO₄/ITO电极上，4℃下过夜孵育；接下来，取15μL，1mM单乙醇胺37℃，对电极进行避光1小时的封闭反应；然后，取15μL步骤c最终裂解液和15μL含有0.1M NaCl、1mM MgCl₂的pH＝7.4 10mM Tris-HCl杂交缓冲混合后滴加在电极表面在37℃下进行杂交反应1小时；接着，引入3U EXOⅠ和18μL含有67mM甘氨酸-KOH(pH＝9.5)、6.7mMMgCl₂、10mM二硫苏糖醇的pH＝7.4 10mM Tris-HCl缓冲溶液，在37℃下进行30分钟的消化水解反应，去除电极表面未杂交的单链DNA；最后，取28μL，10μM MB溶液在电极表面37℃下孵育15分钟；采用三电极体系，通过电流-时间技术，将步骤d制备电极作为工作电极，置于pH＝7的Tris-HCl中，在相对于Ag/AgCl参比电极为0V的电压下，进行光电流测定。

其中，光电流测定是以铂丝电极作为对电极，以500W氙灯作为激发光源(装有400nm截止滤光片)，通过电化学工作站记录工作电极的光电流。

结果如图3-4所示，该方法对miRNA具有灵敏的响应，线性方程为ΔI(nA)＝145.5log[C_miRNA-21(pM)]+2127.7，线性范围为0.005到10000pM，线性相关系数R²为0.992，检测限为0.3fM。

实施例2

a、BiVO₄的制备：称取2.0g硝酸铋溶于20mL甘油水溶液(50v/v％)中，磁力搅拌直至溶解，计作溶液A；称取0.8g钒酸钾20mL去离子水中，磁力搅拌直至溶解，计作溶液B；将溶液B逐滴加入到溶液A中，用硝酸调节混合溶液pH为3.0，搅拌30分钟，移入高压釜中，在180℃加热8小时；自然冷却至室温后，无水乙醇与蒸馏水交替洗涤至上清液呈中性，并在干燥箱中80℃烘干过夜；

b、BiVO₄修饰ITO电极的制备：称取上述制备好的BiVO₄粉末加入到去离子水中，超声得到1mg/mL的悬浊液；在预先清洗处理过的ITO电极表面滴涂30μL BiVO₄悬浊液，40℃下烘干2小时备用；

c、生物识别及信号放大反应：将20μL，1μM锁式探针与10μL不同浓度的miRNA-21混合在50μL含有10mM MgCl₂的pH＝7.5 40mM Tris-HCl缓冲溶液中，在37℃下反应1小时；然后，加入40U T4DNA连接酶以及50μL含有10mM MgCl₂、0.5mM ATP的pH＝7.5 40mM Tris-HCl缓冲溶液中，在22℃下进行1小时的连接反应；接下来，加入10U phi29DNA聚合酶、4.4μL，10mM脱氧核糖核苷三磷酸以及50μL含有10mM MgCl₂、50mM KCl、5mM(NH₄)₂SO₄的pH＝7.540mM Tris-HCl缓冲溶液中，在30℃下进行2小时的扩增反应；最后，加入20U Nt.BstNBⅠ核酸内切酶和20μL含有50mM NaCl、5mM MgCl₂、0.5mM二硫苏糖醇的pH＝7.9的25mM Tris-HCl缓冲溶液中，在55℃下进行1小时的酶切反应；

d、电极表面DNA杂交识别反应及光电流测定：将15μL，2μM胺基官能团化的探针DNA通过戊二醛交联反应固定到BiVO₄/ITO电极上，4℃下过夜孵育；接下来，取15μL，1mM单乙醇胺37℃，对电极进行避光1小时的封闭反应；然后，取15μL步骤c最终裂解液和15μL含有0.1MNaCl、1mM MgCl₂的pH＝7.4 10mM Tris-HCl杂交缓冲混合后滴加在电极表面在37℃下进行杂交反应1小时；接着，引入3U EXOⅠ和18μL含有67mM甘氨酸-KOH(pH＝9.5)、6.7mM MgCl₂、10mM二硫苏糖醇的pH＝7.4 10mM Tris-HCl缓冲溶液，在37℃下进行30分钟的消化水解反应，去除电极表面未杂交的单链DNA；最后，取28μL，10μM NB溶液在电极表面37℃下孵育15分钟；采用三电极体系，通过电流-时间技术，将步骤d制备电极作为工作电极，置于pH＝7的Tris-HCl中，在相对于Ag/AgCl参比电极为0V的电压下，进行光电流测定。