阅读说明：本技术 生物矿化型固定脂肪酶的制备方法及其在催化合成opo中的应用 (Preparation method of biomineralization type immobilized lipase and application of biomineralization type immobilized lipase in catalytic synthesis of OPO ) 是由 谢恬 王安明 李宁宁 张静 于 2020-07-17 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种生物矿化型固定脂肪酶的制备方法及在催化合成OPO中的应用,在磷酸盐缓冲液中,加入脂肪酶和一定比例的氯化钙溶液,随后将混合物静置于1～8℃,得到固定化脂肪酶,并将其应用于催化合成1,3-二油基-2-棕榈酰甘油酯。本发明工艺简单,制备得到的固定化脂肪酶的温度稳定性得到明显提高,用于催化合成1,3-二油基-2-棕榈酰甘油酯时,催化产率高；本发明可以有效改善脂肪酶的热稳定性和催化活性。(The invention relates to a preparation method of biomineralization type immobilized lipase and application of the biomineralization type immobilized lipase in catalytic synthesis of OPO (oriented ordered).A lipase and a calcium chloride solution in a certain proportion are added into a phosphate buffer solution, then a mixture is stood at 1-8 ℃ to obtain the immobilized lipase, and the immobilized lipase is applied to catalytic synthesis of 1, 3-dioleyl-2-palmitoyl glyceride. The method has simple process, the temperature stability of the prepared immobilized lipase is obviously improved, and the catalytic yield is high when the immobilized lipase is used for catalytically synthesizing 1, 3-dioleyl-2-palmitoyl glyceride; the invention can effectively improve the thermal stability and catalytic activity of lipase.)

生物矿化型固定脂肪酶的制备方法及其在催化合成OPO中的 应用

技术领域

本发明涉及一种酶的固定化方法，尤其是涉及一种生物矿化型固定脂肪酶的制备及其在催化合成OPO中的应用。

背景技术

酶是催化生物和化学反应的一种蛋白质，其广泛的存在于植物、动物和微生物中。具有催化活性高、选择性强、专一性好、成本低、反应条件温和以及可被生物降解等优点。因此酶在精细化学、药物化学、食品或能源等各个领域都有很高的应用。生物催化过程作为一种合理、高效的转化方法受到了广泛的关注。酶促工艺在支持可持续绿色化工中的发挥了重要作用。然而，天然酶在实际应用中普遍操作和储存稳定性较差、酶的回收和重复利用困难、成本高，而且还会受到反应液的影响。因此，固定化在酶催化中是常用的改善的方法。

在实际应用中，固定化酶在稳定性、生物催化剂负载、可回收性等方面具有优势。固定化是成功实现以酶为基础的工业过程的关键技术，特别是用于生产绿色和可持续能源或生物衍生的催化转化化学品(工业化)。酶的固定化可以改变酶的活性、特异性或选择性，这为增加酶在底物上的可用性提供了一个良好的基础。如今，仿生矿化已被开发为制备仿生材料的便捷方法。

具有纳米尺度特征的有机-无机杂化纳米材料是一类由金属离子和有机组分(蛋白质、多肽、氨基酸到DNA/RNA等生物分子)自组装而成的花状纳米材料。2012年，Zare等人首次发现并报道了一种使用硫酸铜(II)作为无机成分以及包含蛋白质来创建蛋白质-无机杂化纳米花的方法，该成分增强了活性和稳定性。随着技术的不断发展，目前用于制备杂化无机纳米花的无机金属离子也已从Cu²⁺扩展到Co²⁺，Ca²⁺，Mn²⁺等，可应用于在生物医学领域，包括生物传感、生物催化和癌症治疗等方面。重金属的危害已对人类健康和环境造成潜在危害，引起了全世界的广泛关注,绿色理念是发展化学的根本。自然界中一半以上的生物矿物质是含钙的矿物质，包括骨骼因此，Ca²⁺用来固定酶是更具有生物相容性的。Amjad及其合作者研究了蛋白酶-无机杂化纳米复合材料([email protected]₄)用于大豆分离蛋白水解，提高酶的稳定性和催化能力，并且催化能力是游离酶的1.5倍。Zhang等人研究了一种新型固定化脂肪酶ZC12/Ca₃(PO₄)₂杂化纳米花，该纳米花使kcat/Km值是游离的206％和2.31倍酶活性，并且在较低的温度下比活性更高。Tian等人制备了CaHPO₄-PGUS1杂化纳米复合材料，在最佳条件下，1.2mg的CaHPO₄-PGUS1混合纳米沉淀的固定化效率为71.2％，并具有118％的相对活性。通过上述方法合成的纳米复合材料具有良好的活性和稳定性，又由于Ca²⁺具有很大的生物相容性，在食品工业和生物技术中有很大的应用前景。

生物矿化的主要过程是在有机体的精确控制下，选择性地将无机元素沉积在特定的有机大分子上，并将溶液中的离子转化为固相矿物。其广泛存在于如骨骼，牙齿和贝壳等生物组织中。在此过程中，酶可以作为生物大分子参与体内磷酸钙形成，并通过降低矿物质的溶解度，对矿化过程产生巨大影响。采用共沉淀法制备了蛋白质-无机杂化纳米复合材料，通常包括四个过程:配位、共沉淀、自组装和尺寸生长。蛋白质(多肽或氨基酸)的胺基团与金属离子(II)(Cu²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Co²⁺)通过配位反应相互作用，成为形成金属(II)磷酸盐初级纳米颗粒的成核位点。与此同时，蛋白质作为一种封盖剂，帮助这些颗粒保持纳米花的板状形态。在合成过程中优化合成条件，包括合成时间、温度、pH值和各组分等的浓度，以获得理想的纳米尺寸。

生物矿化在固定化中的应用，不仅对固定化的酶的酶活没有影响，酶活还有所提高，说明该方法更加具有生物相容性，且绿色环保，固定方法简便可行性较高。纳米复合材料具有良好的活性和稳定性，同时Ca²⁺具有很大的生物相容性，在食品工业和生物医药行业中有很大的应用前景。

发明内容

为了提高游离酶的利用效率以及节约成本，本发明提供了一种生物矿化型固定脂肪酶的制备方法及其在催化合成OPO(1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯)中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种生物矿化型固定脂肪酶的制备方法，在磷酸盐缓冲液中，加入脂肪酶和一定比例的氯化钙溶液，随后将混合物静置于1～8℃，得到固定化脂肪酶。

作为优选，所述脂肪酶为疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(TLL)。

作为优选，脂肪酶通过下述方法得到：首先，在pPIC9K载体上构建疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶基因，然后将重组质粒转移至毕赤酵母菌株GS115中，诱导表达后获得脂肪酶。

作为优选，磷酸盐缓冲液的浓度为0.02mol·L^-1，pH为7.0。

作为优选，加入的脂肪酶的终浓度为0.05～0.25mg·mL^-1。

作为优选，加入的氯化钙溶液的浓度为0.2mol·L^-1，磷酸盐缓冲液体积与氯化钙溶液体积比为40～60：1。

作为优选，所述生物矿化型固定脂肪酶的制备方法，具体包括下述步骤：在100mL磷酸盐缓冲液中，加入终浓度为0.1mg·mL^-1的脂肪酶和2mL氯化钙溶液，随后将混合溶液放置在4℃下放置24小时，10000rpm离心10min，得到固定化脂肪酶，即为[email protected]羟基磷灰石纳米花([email protected])。并用磷酸盐缓冲液洗涤后，用于后续检测和催化。

本发明还提供了上述生物矿化型固定脂肪酶在催化合成OPO中的应用。

将脂肪酶TLL利用生物矿化的方式固定，将脂肪酶分散在在磷酸盐缓冲液中，加入一定比例的CaCl₂溶液，有明显白色沉淀生成，随后将混合物静置，得到固定化酶，并应用于催化合成1,3-二油基-2-棕榈酰甘油酯(OPO)。其反应化学式为：

作为优选，所述生物矿化型固定脂肪酶在催化合成OPO中的应用，包括下述步骤：加入底物三棕榈酸甘油酯、油酸、固定化脂肪酶、正己烷，在摇床中反应得到OPO(1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯)。

作为优选，所述三棕榈酸甘油酯、油酸的摩尔比为1：2～10，反应中含水量为2％；摇床反应条件为：温度25～55℃，转速220rpm。

将固定化酶用于催化合成1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯中，改变催化反应中的含水量、溶剂、反应温度、反应时间、底物比例、加入的酶量，提高产物的含量。

本发明利用与生物更相容的羟基磷灰石对重组蛋白在温和的条件下进行固定化，用于对催化反应条件及产率的改善和提高。利用真菌毕赤酵母表达重组蛋白TLL，基于生物矿化方法，将TLL固定化，用于OPO的催化合成，改善脂肪酶催化位置的选择性，进而提高目标产物OPO在反应中的含量。固定化酶在40℃，50℃水浴5小时后，残留的相对酶活性均可以保持在90％以上，游离酶的酶活剩余为40％左右。在70℃时，前1h内游离酶活性迅速下降至23％左右，[email protected]仅损失了约30％的酶活。在最佳催化条件下，反应液中OPO含量可达50.6％。因此该固定方法的选用，可以改善了脂肪酶的热稳定性和催化活性。

附图说明

图1是本发明的制备流程图；

图2是本发明的磷酸钙与固定化脂肪酶的扫描电镜对比图；

图3是本发明的固定化酶的温度稳定性结果图；

图4是本发明的反应液的液相检测谱图；

图5是本发明的循环催化图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做出进一步的说明，这些实施例并非是对本发明的限定，依照本领域现有的技术，本发明的实施方式并不限于此，凡依照本发明公开内容所做出的本领域的等同替换，均属本发明的保护内容。

实施例1

参照图1，将脂肪酶TLL利用生物矿化的方式固定，将脂肪酶分散在在磷酸盐缓冲液中，加入一定比例的CaCl₂溶液，有明显白色沉淀生成，随后将混合物静置于4℃，得到固定化脂肪酶，并应用于催化合成1,3-二油基-2-棕榈酰甘油酯(OPO)。

在该发明中，通过生物矿化过程，使用一种简单的方法与磷酸钙共同生产TLL-羟基磷灰石纳米花([email protected])复合物，并将其应用于OPO的合成，首先，在pPIC9K载体上构建TLL基因，然后将重组质粒转移至巴斯德毕赤酵母菌株GS115中，诱导表达后获得脂肪酶TLL。

[email protected]羟基磷灰石纳米花([email protected])的制备

首先将纯化并浓缩后的脂肪酶蛋白浓度通过Bradford蛋白质检测试剂盒检测，当测得其浓度为10mg·mL^-1时，取6mL酶溶液加入600mL磷酸盐缓冲液(PBS，20mM，pH 7.0)中混合均匀，加入12mL CaCl₂(0.2mol·L^-1)溶液，然后将混合物放置在4℃下放置24小时后10000rpm离心10min，收集得到的混合物为[email protected]羟基磷灰石纳米花。将其冻干后，用扫描电镜进行检测，如图2所示，羟基磷灰石(图2a)，[email protected]羟基磷灰石纳米花(图2b)。在加入生物大分子后，同样的处理方式，则形成了规则的花瓣的形状，随着时间的延长它们堆叠在一起，导致尺寸增大。

酶活检测方法：将25μL的稀释酶溶液添加到1.4mL磷酸盐缓冲溶液(20mM，pH 6.5)中，在37℃，220rpm下孵育3分钟，然后加入75μL对硝基苯酚乙酸酯(50mM)。在摇床中反应3min后，移出并快速加入1.5mL丙酮以终止反应。最后，用分光光度计在405nm处检测反应溶液。

[email protected]温度稳定性检测

取10mL 2mg·mL^-1的游离酶和固定化酶分别置于40℃，50℃，60℃和70℃的水浴中，每间隔1h取出500μL的游离酶和[email protected]稀释成1mL(酶终浓度为1mg·mL^-1)用于测酶活性。每组数据均平行测试三次。实验结果如图3所示，使用生物矿化法固定脂肪酶是一种有效的固定方法。从图3a可以看出，在40℃下，实验中出现一些导致数据出现一些波动，但[email protected]可以保证5h内酶活性几乎没有损失，游离酶的相对剩余活性仅为54％。图3b显示出在50℃水浴里，固定化酶的相对残留酶活在5h内保稳定在90％左右，而游离酶的残留酶活性的相对值仅为41.7％。在60℃(图3c)和70℃(图3d)的较高温度下，游离酶和固定化酶之间的活性对比更加明显。在70℃时，前1h内游离酶活性迅速下降至23％左右，[email protected]仅损失了约30％的酶活，温育6小时后，残留的相对酶活性仍有63.6％，而游离酶仅残存16.1％。在固定后，温度稳定性显着提高，酶的活性不受影响，但高于游离酶。可能是由于纳米花中较高的表面积和酶的限制所致，纳米花增大了固定化载体的表面积，可以使脂肪酶的活性位点更容易与底物接触，减少了酶的限制。

实施例2

[email protected]羟基磷灰石纳米花催化合成OPO

将[email protected]用作三棕榈酸甘油酯(PPP)与油酸(OA)的酶法酸解以生产OPO的生物催化剂。研究了不同反应条件对产物的影响，包括含水量，反应温度，反应物摩尔比等。

催化酯交换反应如下：PPP(0.24mmol)，OA(0.48～2.40mmol)，[email protected]羟基磷灰石纳米花(5～25mg·mL^-1)加入不同溶剂(总体积6mL，正戊烷，正己烷，正庚烷，正辛烷，环己烷和丙酮)溶解，反应中含水量2％，反应温度为25～55℃下，并以220rpm的速度在摇床中反应12h。反应中使用的正己烷等溶剂需要用分子筛干燥24小时以上。每个样品取500μL，然后加入500μL色谱级正己烷混合。所有实验均重复三次。混合溶液通过0.22μm滤膜过滤，并通过高效液相色谱法(HPLC，Agilent 1260)进行检测。流动相为正己烷和乙腈(99.15：0.85v/v，超声混合)的混合溶液，所用色谱柱为银离子色谱柱(ChromSpher 5Lipids,250x4.6mm，粒径为5μm，Agilent Technologies)，流速为1mL·min^-1，进样量为10μL，柱温箱温度为30℃。所有产物均用标准品绘制了峰面积与标准品浓度之间的关系，以获得校准曲线。每个样品平行测量三次，反应液的液相检测谱图如图4所示，反应中含水量为2％，底物PPP/OA摩尔比为1：6，加入6mL正己烷溶解，加入脂肪酶20mg/mL(20％)，35℃反应12h，反应液中各个产物的出峰位置反应了反应液里的各种物质。

实施例3

反应温度对催化反应的影响

主要探究了在25℃，35℃，45℃和55℃的反应温度下的催化结果，并进行了对比。在该实验中，我们发现并非所有反应都随温度升高产率也升高，但是游离酶TTL对温度升高更加敏感。在25℃和35℃时，游离酶催化的反应中OPO含量可以保持在40％以上，但是在45℃和55℃时，OPO含量则明显下降。而[email protected]羟基磷灰石纳米花的催化反应液中OPO含量变化比较平稳，且OPO含量至少在35％以上。但是温度太高也会对固定化的酶有负面影响。分析其原因可能是温度太高影响了酶的活力，而温度太低会导致底物三棕榈酸甘油酯不能完全溶解在反应溶剂中，使得酶和底物不能有效接触。最终该催化反应选择的最佳反应温度为35℃。

实施例4

含水量对催化反应的影响

脂肪酶是水溶性的，微量水对于维持脂肪酶周围的水合层(维持脂肪酶活性)是必不可少的。因此，我们研究了含水量对酯化反应的影响。将不同量的水(0％～10％)添加到平行实验中，其余反应条件保持不变。含水量对反应的产物含量影响较大，对于无水的反应，反应液中OPO含量最低为15％，当含水量达到10％时，OPO含量约为15％。但是当含水量为2％时，OPO含量最高，约为40％。原因可能是当反应中的含水量较高时，酶和疏水性底物之间的接触减少，导致酶活性降低。因此，催化反应中的最佳含水量为2％。

实施例5

反应溶剂对催化反应的影响

脂肪酶和溶剂之间可能的相互作用之一是，溶剂可以在催化反应中充当竞争性抑制剂，使用正戊烷，正己烷，正庚烷，正辛烷，环己烷和丙酮分别作为反应溶剂。在该实验中，以正己烷中作为溶剂的脂肪酶活性要强于在其他溶剂中的脂肪酶，例如异辛烷，丙酮，石油醚等，且易于除去溶剂。虽然正辛烷中的OPO含量要高于正己烷，但是正辛烷的沸点较高，相对于正己烷，不易除去。经过综合考虑，选择正己烷作为反应溶剂。

实施例6

脂肪酶用量对催化反应的影响

为了检测该反应中使用酶的量对OPO含量的影响，分别在平行的五组实验中添加5mg·mL^-1，10mg·mL^-1，15mg·mL^-1，20mg·mL^-1，和25mg·mL^-1酶催化剂作为对照实验。其反应条件为2％的含水量，PPP：OA的摩尔比为1：3，6mL的无水正己烷，反应温度为35℃，反应进行12小时。随着酶浓度的增加，反应液中OPO的含量逐渐增加，并逐渐趋于稳定。当添加酶的浓度为5mg·mL^-1时，OPO含量仅为39％。当反应中添加的酶浓度为20mg·mL^-1时，OPO含量最高达到45％。此时，如果再增加酶的量不仅造成酶的浪费，而且降低了OPO含量。该结果可能归因于脂肪酶和底物之间过度接触而引起的水解副反应－酰基迁移增加。考虑到OPO含量和经济效益，最后选择了酶催化剂的剂量为20mg·mL^-1。

本发明最优的催化条件是：反应中含水量为2％，底物PPP/OA摩尔比为1：6，加入6mL正己烷溶解，加入脂肪酶20mg/mL(20％)，35℃反应12h。

实施例7

循环催化

取6mL正己烷溶剂溶解三棕榈酸甘油酯0.24mmol和油酸1.44mmol于烧瓶中，并加入120μL水和固定化酶120mg，35℃反应12h后，离心。取上清液500μL样品并与500μL正己烷混合，过滤后通过HPLC检测反应液中OPO的生成含量。单次催化反应液中OPO含量可达50.6％，比游离TLL的催化产率高约1.3倍。在循环催化中，将离心所得的沉淀用正己烷洗涤3次，干燥后用于下一个循环反应。在循环实验中，如图5所示，经过5个循环后，各循环产物中OPO的相对含量接近，保持在90％以上，酶活力损失小。

1,3-二油基-2-棕榈酰甘油酯(OPO)属于三酰基甘油酯，是人乳脂肪的重要组成部分之一，是婴幼儿配方奶粉中常用的重要添加剂之一。本发明选用毕赤酵母菌株GS115表达TLL脂肪酶，开发了一种简便的方法，在生物矿化作用下经过共沉淀固定脂肪酶，合成[email protected]羟基磷灰石纳米花([email protected])。在40℃水浴放置5h，[email protected]可以保证酶活性几乎没有损失，游离酶的相对剩余活性仅为54％。在70℃时，前1h内游离酶活性迅速下降至23％左右，[email protected]仅损失了约30％的酶活，温度稳定性明显提高。在最佳催化条件下，反应中含水量为2％，底物PP/OA摩尔比为1：6，加入6mL正己烷溶解，加入脂肪酶20mg·mL^-1(20％)，35℃反应12h，产物中OPO含量可达到50.6％，比游离TLL的催化产率高约1.3倍。在循环催化5次后，反应液中OPO含量仍在90％以上。因此该固定方法的选用，改善了脂肪酶的热稳定性和催化活性。[email protected]羟基磷灰石纳米花的优异稳定性，良好的催化能力和钙结合能力将对婴儿配方奶粉中添加剂的合成起到重要作用。

上述实施例仅例示性说明本发明的较佳方案，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不超出记载的技术方案的范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。