阅读说明：本技术 一种威氏海链藻TwPEPC1基因及应用和培育高产水稻的方法 (Haematococcus willi Twpec 1 gene, application thereof and method for cultivating high-yield rice ) 是由 林拥军 陈太钰 于 2020-06-22 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种威氏海链藻TwPEPC1基因以及应用和培育高产水稻的方法,属于植物基因工程技术领域,所述威氏海链藻TwPEPC1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明提供的威氏海链藻TwPEPC1基因具有提高水稻产量的作用,克服了双细胞C<Sub>4</Sub>植物来源的C<Sub>4</Sub>基因对花环型结构的依赖。实验结果表明,威氏海链藻TwPEPC1基因在水稻中获得了表达,转基因植株相对于原水稻植株,PEPC酶的活性提高了2～3倍,光合作用速率有明显的提高,产量具有明显提升。(The invention provides a Haematococcus willebrand Twpec 1 gene and application thereof and a method for cultivating high-yield rice, belonging to the technical field of plant genetic engineering, wherein the nucleotide sequence of the Haematococcus willebrand Twpec 1 gene is shown as SEQ ID No. 1. The invention provides a Haichia wegiana TwPEPC1 gene which has the function of improving the yield of rice and overcomes the defect of double-cell C 4 C of plant origin 4 Dependence of the gene on the floral ring type structure. The experimental results show that the Haematococcus WeiThe TwPEPC1 gene is expressed in rice, compared with original rice plants, the activity of the PEPC enzyme of the transgenic plants is improved by 2-3 times, the photosynthesis rate is obviously improved, and the yield is obviously improved.)

一种威氏海链藻TwPEPC1基因及应用和培育高产水稻的方法

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及一种威氏海链藻TwPEPC1基因以及应用和培育高产水稻的方法。

背景技术

随着人口的增长，人类对食物的需求总量持续上升，而耕地面积却因为城镇化而减少，这就要求农作物具有更高的单产(Surridge，2002)。C₄植物比C₃植物具有更高的光合作用效率，更大的生物合成量，更高的NUE和WUE以及更广泛的适应性，但大部分重要农作物如水稻、小麦、马铃薯和大豆都是C₃植物(Von Caemmerer，2003)。因此利用转基因技术在C₃作物内表达C₄相关基因(特别是PEPC)也是提高C₃作物产量的潜在策略之一(张启发，2009；Hibberd et al.，2008；Zhu et al.，2010a；Zhu et al.，2010b)。

虽然大部分C₄植物都是具有花环型结构，C₄核心代谢途径是在叶肉细胞和维管束鞘细胞中完成，但是也有研究发现在有些生物中，如威氏海链藻(Thalassiosiraweissflogii)和轮叶水草(Hydrilla verticillata)。威氏海链藻(Thalassiosiraweissflogii)是威氏海链藻的一种，分类上属于海链藻属。威氏海链藻每年的碳固定大约占海洋无机碳固定量的25％以上，达到1x10¹⁶克(Granum et al.，2005)。PEPC的酶活抑制剂3，3－二氯－2－二羟基磷酸甲基－2－丙烯醇(DCDP)将极大降低威氏海链藻光合效率，高浓度CO₂和低浓度O₂可恢复其光合效率，而在C₃型威氏海链藻Chlamydomonas中却观察不到这种变化。越来越多的研究结果显示威氏海链藻确实具有CCM机制和C₄型光合生理特性(Reinfelder et al.，2000)。轮叶水草(Hydrilla verticillata)是一种淡水水生植物，原产于东南亚。轮叶水草是一种可诱导、单细胞和无“花环”结构的C₄植物。在短日照和低温的条件下，轮叶水草所表现的是一种经典的C₃型生物；但是当生活条件变成低浓度可溶性CO₂或者高温下，轮叶水草就诱导出CCM机制，具有典型C₄植物的生理生化特性(Reiskind J Bet al.，1997)。在低浓度可溶性CO₂和高温条件下，与C₄相关的重要酶类的活性，如PEPC，NADP-ME和PPDK，得到了10至16倍的增加，天冬酰胺和丙氨酸氨基转移酶也得到了快速的诱导(Salvucci and Bowes，1981；Magnin et al.，1997)。

PEPC是C₄核心循环中最为重要的酶类之一，它直接催化HCO₃ ^-与PEP的羧化反应生成OAA并且伴随着Pi的释放，其活性主要受PEPCK的磷酸化调节(Walker and Leegood，1996)。PEPC广泛地存在于生命体中，其中包括海藻、蓝藻、光合自(异)养细菌、真菌、酵母、原生动物、植物、和动物(Kai et al.，2003)。在C₃植物中，PEPC主要为三羧酸循环提供额外的OAA，同时有研究结果表明PEPC在水稻中也会参与氨基酸的吸收(Masumoto et al.，2010)。在蛋白质结构上C₄型PEPC活性受靠近N端一保守Ser残基的磷酸化和去磷酸化调节(Nimmo，2003)；研究结果显示C₄型PEPC活性也同时受到6-磷酸葡萄糖的激活和L-aspartate的抑制(Kai et al.，1999)；而⁷⁷⁴Ser对维持Flaveria PEPC的“C₄”特性非常关键(Blasing et al.，2000)。玉米C₄型PEPC基因全长约6.8kb，基因分别由10个外显子和9个内含子组成，cDNA长度约2.9kb，编码970个氨基酸残基(Lepiniec et al.，1993)。

上世纪末，有很多关于C₄-PEPC在C₃植物中异源表达的报道。Hudspeth和Grula(1992)最早将玉米来源的C₄-PEPC在烟草里超表达，结果显示，和非转基因植株相比，转基因植株细胞质中PEPC活性提高约2.2倍，但是仍远远低于玉米的内源PEPC活性(Hudspethet al.，1992)。而玉米PEPC的转基因烟草植株的CO₂同化效率和CO₂补偿点等光合特性几乎没有变化(Kogami et al.，1994)。在玉米PEPC(包含玉米基因的自身启动子、外显子和内含子)的转基因水稻中，PEPC酶活极大地提高至原来的110倍，基本上可以达到玉米植株内源PEPC活性水平，但是CO₂同化速率也同样没有明显变化，而增加PEPC活性可以降低光呼吸速率，这个结果同时也说明玉米C₄基因可以在水稻等C₃植物中正确的转录、剪切和翻译(Ku etal.，1999)。

在已有报道中，由于外源PEPC基因都是来源于双细胞C₄光合作用植物，如玉米，基因的效应依赖着其特定的“花环”型组织结构，在单个细胞中不能发挥应有的C₄效应，同时基因可能也有物种调控和修饰特异性，所以PEPC转基因植株在产量上并没有得到很好的改良。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种威氏海链藻TwPEPC1基因及应用和培育高产水稻的方法，能显著提高水稻的产量。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种威氏海链藻TwPEPC1基因，所述威氏海链藻TwPEPC1基因的核苷酸序列如SEQID No.1所示。

本发明还提供了上述技术方案所述的威氏海链藻TwPEPC1基因在提高水稻产量中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述威氏海链藻TwPEPC1基因培育高产水稻的方法，包括：

(1)将威氏海链藻TwPEPC1基因电转化入大肠杆菌，扩大培养、抽提质粒，得到克隆质粒；

(2)用Kpn I单酶酶切所述步骤(1)的克隆质粒，获得克隆质粒基因片段，用Kpn I单酶酶切载体pC1300s，获得线性载体pC1300s，将所述克隆质粒基因片段构建于线性载体pC1300s中，得到转化载体，将所述转化载体导入农杆菌中，得到转化菌株；

(3)将所述步骤(2)的转化菌株侵染水稻愈伤组织，将侵染后的水稻愈伤组织培养，得到高产水稻。

优选的，所述威氏海链藻TwPEPC1基因的获得方法包括：以假微型海链藻基因DNA为模板，利用简并引物对进行PCR扩增，得到威氏海链藻TwPEPC1基因。

优选的，所述简并引物对包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

优选的，步骤(2)所述农杆菌包括农杆菌EHA105。

优选的，步骤(3)所述侵染包括：将所述水稻愈伤组织浸泡于OD₆₀₀值为0.8～1.0的农杆菌悬液中25～35min。

优选的，步骤(3)所述水稻愈伤组织包括水稻胚性愈伤组织。

优选的，所述水稻的品种包括中花11水稻。

本发明提供了一种威氏海链藻TwPEPC1基因，所述威氏海链藻TwPEPC1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明设计简并引物对，获得的威氏海链藻TwPEPC1基因，克服了双细胞C₄植物来源的C₄基因对花环型结构的依赖。实验结果表明，威氏海链藻TwPEPC1基因在水稻中获得了表达，转基因植株相对于原水稻植株，PEPC酶的活性提高了2～3倍，光合作用速率有明显的提高，产量具有明显提升。

附图说明

图1为pC1300s过表达载体图；

图2为Southernblotting杂交结果图；

图3为种子发芽实验图，其中左中右分别为阴性、杂合和纯合家系的种子发芽实验图；

图4为RT-PCR表达量检测图；

图5为PEPC相对酶活结果图；

图6为苗期植株长势图，其中从左至右分别为野生型水稻、高产水稻家系1、高产水稻家系19和高产水稻家系46。

具体实施方式

本发明提供了一种威氏海链藻TwPEPC1基因，所述威氏海链藻TwPEPC1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：

ATGCTCTCCAATATGCTGGCTGAAGTGGTAAAGAAGGAGAATCCGGCTGTTTACGATCTATACACTACATTTCGTAGACTTGGAATGAAGAGAGCCGCCAATCCAGACGATCCAACCCCCTTCGAAGAAATGAAAAAGCTGGCCTATGATATCTCTCCCCACGATGCGCTTGGCGTCATGAAAACATTTTCCATCGCACTCAACTTAGTTAATGCTGCCGAAGTACATCACCGCATGCGTCTCGTTCGTAAAAATGAACATGCCGATGATACTCATCATATTGGTCCATTGCCAATGATCGAAGATAGCATTCGTGGAACCATGGAGATTTTGCTGGAGGATGATGGGGTGAGCCCAGATAGCATTTTTGCAGAGTTGATGAGTCAAAAATGTGAGATTGTATTGACGGCACATCCTACGGAGGTTAATCGCAAAACCATTATCAGGAAGTACCGCAATATTTCGGAATTGTTGGCACATTTGGAACGGCCTGATCTCCATCCTTTTGAATGTGCCGAGGCATTAAACAACTTGCGAGGAATCATTGCTGCGATTTGGGGATCTGATGAAATTAGACGTGTCAAACCAACGGTTCAGAAAGAAGCTGCTGGAGGGTGTGCTGTCATTGAATCTGTTCTTTGGGATGCGGTTCCGTCATATCTTCGCAAGCTCGATGCACAATGCCGCGTTACGCTCGGAAAGAAGCTACCTGTGGATGTTACCCCTGTAAAATTCGCCTCTTGGATAGGAGGAGATCGTGATGGAAATCCTAACTGTACTCCTGCTGTGACTCAAGAGGTTCTTGCTTACCAGAAACTCCGCGCTGCCAAGATGTTTTTGAATGACCTCAACTTCTTGTATTCTGAGTTGGCAATTTCCAGCCGATTCTCTCCAGAGCTAGAAGCACTCGCCGCCACAATTGAGAATTCCGACGACGAGCTCGAGAAGTACCGCCGCGTTATTGGCCATCTTCGCCGTCGTTTAGTTCGAACTGTCAAGGATTGTGAAGCCAAACTGCAATCTCTGGCGAAATCTCCTGAAACGTTGTCCGCCGAAGCTGCATTTGGAGCACTTGAAGGATGGGAAGATGTGGAACCAATCATGAAAACTGATGACTTGATGGCTCCTTTGAAGGTAATCTATGAGAGTTTGGTGACGACAGGATTTGAATTGGTGGCAGATGGACGCGTTTCGGATATTATTCGCCGCGTTGCAATCTTCGGGTTGACACTGGTGCCTCTCGATATTCGTGAGGAGTCTACTAAACATACTTTGGCTTTGGATGCAATTACTCGCCATCTGGGCATTGGAAGTTACAAGGAATGGGACGAAACAGCAAGGTTGAGCTGGTTACAATCTGAGTTGACGAGTCGACGCCCTCTTTTTCGCATAAGAGATGTTGAAAATAATTTGCTTGGGTTGGATCCTGATGTGATCAAGACTTTGATGGTATTCAAAGTAGCATCTGAGCAGGAACCGGAATCTCTGGGAGCATATGTCATTAGTCAGGCAACAAGTGCAAGCGATGTATTGGCAGTGATGTTATTGCAAAAGCAGTTTGGAATGACAAAGGCCACTGGCAAATTAATGCGTGTTGTGCCGTTGTTTGAGACTCTCGATGATTTAACTGGGTCACCGAAGCAACTCCAAACTCTTTTTGGGATCACGAGCTACATGGATGCGATCAACCGCAAACAAGAGGTAATGGTTGGATACTCTGATAGTGCAAAAGATGCAGGAAGACTCGCGGCTTGCTGGGCACAATACACTGCACAAGAAGCTATGGCGAAAGTGGCGGACAAATTTGGTGTCGAGCTGACTTTTTTCCATGGCAAGGGTGGAACTGTTGGACGAGGAGGCAACCCTGCTCTCTATCGCGCCATTCTATCCCATCCCCCAAACACTATCAATGGACGTTTCCGCGTCACTGAGCAAGGAGAAATGATCAGGCAGAACTTTGGCTCATTGGAAATCGCTGAGAGGTCATTGGATATTTACACAGCTGCATTGTTGAGAGAGCGCTTCACCAAGCATATCGAGCCGAAGCAAAAATGGAGAGATCAAATGCAACGAGTCTCCGAAGCCTCGTGTTCGAACTACCGATATCTTGTTCGAGAGGATCCACGATTTGTGCCATACTTCAGGCAGGCAACACCAGAGCTGGAGCTTGGTATATTGAACATCGGCAGTCGACCGGCCAAGCGTAATCCTAAGGGTGGTGTCGAAAGTCTGAGAGCCATTCCATGGACCTTTGCATGGGCTCAAACTCGTATGCACCTTTCAGCTTGGCTTGGTGTCGGTGCAGGGCTCAATTCTGAAAATGAAGAAGACAGAGCTACGTTGCGTGAAATGTACGAGGAGTGGCCATGGTTCAGAGAAATCATCAGTCTCATTTCCATGCTGGTATCTAAGACAGACTTTTCCATCACCAAGAACTACGACGAACTCCTTGTAGATCCAGATTTGATGAGTCTTGGCGACGAAGTGAGGACGATGCTCGTTGAAACTCGACAAGCTGTGATTGACGTGTCAGGATCTAAAGACATCAGCGGACCTCATGTTCAGTTGATGCGTGCTTCTTCAATGATTCGCAATCCCTACGTTGATAGTATCAATGTTGTGCAAGCGGAGCTTTTAAAGGTGTTGCGTGCGATGCCCGCCGATGACTCTTCTGACTTGACTCCAGAGTTAAAAGAAATCAAGAAAGTTCGTATCGATGCCCTGCTCTTGTCAATCAAGGGAATTGCTCAAGGAATGAAAAACAGTGGATAA。

本发明还提供了上述技术方案所述的威氏海链藻TwPEPC1基因在提高水稻产量中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述威氏海链藻TwPEPC1基因培育高产水稻的方法，包括：

(1)将威氏海链藻TwPEPC1基因电转化入大肠杆菌，扩大培养、抽提质粒，得到克隆质粒；

(2)用Kpn I单酶酶切所述步骤(1)的克隆质粒，获得克隆质粒基因片段，用Kpn I单酶酶切载体pC1300s，获得线性载体pC1300s，将所述克隆质粒基因片段构建于线性载体pC1300s中，得到转化载体，将所述转化载体导入农杆菌中，得到转化菌株；

(3)将所述步骤(2)的转化菌株侵染水稻愈伤组织，将侵染后的水稻愈伤组织培养，得到高产水稻。

在本发明中，所述威氏海链藻TwPEPC1基因的获得方法优选包括：以假微型海链藻基因DNA为模板，利用简并引物对进行PCR扩增，得到威氏海链藻TwPEPC1基因。本发明对所述假微型海链藻基因DNA的提取方法没有特殊限定，采用本领域技术人员常规采用的提取方法即可。本发明优选以假微型海链藻基因DNA及其PEPC蛋白N端保守序列(SEQ ID No.2)设计简并引物对。

在本发明中，所述假微型海链藻基因DNA包括假微型海链藻TpPEPC2基因，所述假微型海链藻TpPEPC2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：

ATGCTCTCCAACATGCTCGCGGAGGTTGTACTCAAGGAAAACCCCGTGGTGTACGATTACTACACGAGATTTCGCAAGTTGGGTATGGACCGCGCCGCAAATCCCGATGATACGGCGCCGTTTGAGGAGATGAAGAAGCTGGCGTATGATATTAACCCTCGCGATACTCTGGGAGTGATGAAGACGTTTTCGATCGCATTGAATTTGGTGAATGCTGCGGAGGTTCATCATCGTATTCGGTTGGTGAGGGTGAGTGAGTTGAAAGATGACGTCAATCATATTGGACCGCTGCCGATGGTGGAAGATAGTATTCGTGGTACTATGGAGATTTTGTTGGAGGGGGATTGTGATGATAAGGATAAGTTGTTTGAGAGGTTGACTACGCAAAAGTGTGAGATTGTGCTGACGGCCCATCCCACAGAGGTTAATAGGAAGACAATCATTAGCAAGTACCGTAAGATTTCAGAACTCCTCGCTTACATGGAACGTCCCGATCTTCACCCCTTTGAACGTGCGGAGGCGGTAAACAACTTGCGTGGTATCATCTCTGCTATCTGGGGTGCCGACGAGATCAGGCGTGTCAAGCCCACGGTACAAAAAGAAGCAGCCGGAGGATGTGCTGTCATTGAATCCGTCCTCTGGGACGCCGTACCCTCCTACCTCCGTAAACTCGACGCTCAATGCCGTGTCACCCTCGGTAAAAAGTTCCCCGTTGACGCTACACCCATTAAGTTTGCCTCGTGGATTGGAGGTGATCGCGACGGTAACCCCAACTGTACCCCTGAGGTTACGTTGGAGGTGGTAACACGTCAAAGGCTACGTGCGGCAAAGATGTTTTTGAATGATCTCAACATGTTGTATTCGGAGTTGGCAATCTCTAGTCGTTTCTCAAAAGAGTTGGAGGCATTGGCTGCTAGTGTAAAAAAATCAGACGACAACCGTGAGAAGTACCGCCGTGTGATTGGTCATTTGCGTCGTCGTCTAGTACGCACGGTGAAGGAGTGTGAGGCCAAGCTTCACACTCTTACCGACACGTCCGAAGTTCAGCTTGCGTCTGCGGAAAGTGCCTTTGGAAGTTTGCAGGGATGGGAGGATGTGGAACCAATCATCAAATCGGAGGAGTTGATGACTCCGCTGAGGATCATGTACGATTCGTTGGTAGAAACCGGATTTGAGCTGGTGGCAGATGGACACGTTTCTGATATCATCAGGAGGGTAGCTGTCTTTGGTATGACGTTGGTTCCTTTGGATATCCGCGAGGAGTCAACTCGGCACACAATAGCCATTGATGCAATCACTCGTCATTTGGGTATTGGAAGTTACAAGGAATGGGACGAAGAAGCTCGTTTGAACTGGCTTCAATCAGAATTAAACAACAAACGTCCTCTTTTCAGAATCCGTGACATTGAGGATAACTTGCTCGGCCTTGACCCTGATAATCGGAAGACGTTGATGGTATTCAAAGTAGCTTCTGAGCTTGACTCCGAGAGTTTGGGTGCTTATGTTATTAGTCAAGCAAATACTGCTAGTGACGTCTTGTTAGTGATGTTACTGCAGAAGCAGTTCGGAATGACTGAAAAGAACGGAAAGCTCATGAGGGTTGTACCCCTCTTTGAGACTCTTACCGACTTGACAAACTCGCCTGCGCAACTCGAGAGACTCTTCAGCATCACCAATTATTTGGGTGCTATCAACGGTAAGCAGGAGGTCATGGTTGGATACTCTGACTCTGCAAAGGATGCTGGACGACTTGCTGCATGCTGGGCTCAATACACTGCACAGGAGGCCATGGCAAACGTGGCAGACAGATACGGCGTTGAACTTACTTTCTTCCACGGAAAAGGAGGAACCGTCGGAAGAGGAGGCAACCCAGCTCTTTATCGCGCCATCCTATCTCATCCTCCCAACACAATCAACGGACGTTTCAGAGTAACTGAGCAAGGAGAGATGATTCGTCAAAACTTTGGTTCTTTGGAGATTGCCGAGCGGACTCTTGATATCTACACTGCTGCGTTGTTGAGGGAGTCTTTCACCAAGAGGGTTGAACCTAAACAGGAATGGAGAGATCAGATGGAACGTGTTTCTGAGGTGTCGTGTGCTGCCTACAGGCACACTGTTCGAGATGACCCGCGCTTCGTCCCCTATTTCCGCCAGGCGACCCCTGAGTTGGAACTTGGCAGATTGAATATTGGATCTCGCCCCGCCAAACGCAATCCTAAGGGAGGTGTTGACAGTTTGAGAGCTATTCCGTGGACATTCGCTTGGGCACAGACTCGTATGCATCTTTCTGCTTGGCTCGGAGTTGGCGATGGTCTCAGATCAGATAACGAAGAAGACATGAAGACTTTGCAGGAGATGTATGAACAGTGGCCCTGGTTCCGTGAGATCATCAGCTTGATCTCAATGCTTGTGAGTAAGACCGACTTTTCTATCACGAAGAACTATGACGATCTTCTCGTGGATTCCAATCTGAGGAGTCTCGGGGATGAAGTGAGGAACAAACTTGTGGAGACACGTCAGGCAGTGATTGACGTTTCTGGAGCAACGGATATCAGTGGACCTCATGTTCAATTGATGCGAGCGTCCTCTACTATTCGCAATCCGTATGTCGACAGTATCAACGTAGTTCAAGCGGAAATCTTGAAAGTATTGCGTTCAATGCCCGAGGACGACTCACCTGATCTCACTCCAGAATTAAGGACGATCAAGAACTGTCGTACTGACGCTTTGTTGTTGTCCATTAAGGGCATTGCTCAGGGAATGAAGAACAGTGGATAG。

在本发明中，所述简并引物对包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

在本发明中，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体如下所示：

GGTACCATG CTC TCCAAYATGYTG GCW GAR GTW GT；

其中，Y代表C或T，R代表A或G，W代表A或T；

所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体如下所示：

GGTACC TTATCCACT GTTTTT CATTCC TTGAGC。

本发明对威氏海链藻TwPEPC1基因电转化入大肠杆菌的方法没有特殊限定，采用常规将基因入大肠杆菌中的方法即可。在本发明中，所述大肠杆菌优选包括大肠杆菌DH5α。

在本发明中，步骤(2)所述Kpn I单酶来自promega公司，所述Kpn I单酶酶切过程中的反应体系及酶切条件参照promega说明书。

本发明对所述所述转化载体导入农杆菌的方法没有特殊限定，采用常规将表达载体转入农杆菌中的方法即可。在本发明中，所述农杆菌优选包括农杆菌EHA105。

在本发明中，步骤(3)所述侵染优选包括：将所述水稻愈伤组织浸泡于农杆菌的悬液中25～35min，更优选为30min。在本发明中所述农杆菌的悬液的OD₆₀₀值优选为0.8～1.0，更优选为0.9。

在本发明中，所述水稻愈伤组织优选包括水稻胚性愈伤组织。在本发明中，所述水稻的品种优选包括中花11水稻。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

威氏海链藻TwPEPC1基因的克隆

材料准备：威氏海链藻，其培养条件为温度22℃，光照照度在3000lux，光暗比为16h/8h。

营养液成分：NaNO₃ 74.8mg/L，NaH₂PO₄ 4.4mg/L，维生素母液1ml(维生素B1 0.1g/L，维生素B12 0.5 mg/L，维生素H 0.5mg/L，微量元素母液1ml(EDTA-Na₂ 4.360 g/L，FeCl₃.6H₂O 3.150g/L，CuSO₄.5H₂O 0.010g/L，ZnSO₄.7H₂O 0.022g/L，CoCl₂.6H₂O 0.010g/L，MnCl₂.4H₂O 0.180g/L，Na₂MoO₄.2H₂O 0.006g/L)，pH＝8.0，培养基用海水配制，121℃灭菌15min后使用。

步骤：

(1)威氏海链藻RNA的提取：

采用Trizol Reagent(Invitrogen,Carisbad,CA,USA)方法，得到威氏海链藻RNA。威氏海链藻RNA经0.8％琼脂糖胶电泳检测和浓度测定确认质量合格后(18S、28S两条主带清晰无拖尾，OD260/OD280＝1.8～2.0)方可进行后续试验。

(2)RNA反转录成cDNA

反转录使用的试剂盒是Promega公司的M-MLV，具体步骤见其说明书。将步骤(1)得到的威氏海链藻RNA反转录成威氏海链藻cDNA，将威氏海链藻cDNA置于-20℃冰箱保存。

(3)PCR扩增

以假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)TpPEPC2序列(如SEQ ID No.2所示)为模板，以假微型海链藻PEPC蛋白质N端保守序列设计简并上游引物(上游引物的核苷酸序列为：GGT ACC ATG CTC TCC AAYATG YTG GCW GAR GTW GT),以威氏海链藻TwPEPC1序列设计下游引物(序列为：GGT ACC TTA TCC ACT GTT TTT CAT TCC TTG AGC)。PCR反应条件：94℃5min，94℃30sec，56℃30sec，72℃3min，30个循环，72℃7min。取10μl PCR产物用0.8％琼脂糖电泳检测。剩余的PCR产物用于做克隆。使用的试剂盒为Promega公司的T-Vctor系统。反应体系为5.0μl，具体如下：PCR产物1.9μl、T-Vctor 0.3μl、2×buffer 2.5μl、T₄ ligase 0.3μl。

(4)获得克隆质粒

PCR产物于16℃低温水浴10h，然后电转化入大肠杆菌DH5α，37℃复苏40min，凃含Amp、IPTG、X-gal的平板，37℃培养过夜，挑选白斑用含Amp的LB培养基来扩大培养。抽提所摇菌的质粒，得到克隆质粒。用Kpn I单酶切来筛选阳性克隆。酶切体系为20.0μl，具体如下：质粒3.0μl、10×K buffer2.0μl、Kpn I 0.1μl、ddH₂O 14.8μl，37℃反应4h，酶切产物用0.8％琼脂糖电泳检测。挑选阳性克隆用ABI3730进行测序。测序结果显示其对应的氨基酸序列具有PEPC保守结构域。

实施例2

威氏海链藻TwPEPC1基因转化载体的构建

(1)酶切载体pC1300s

pC1300s载体是在pCAMBIA1300(该载体为CAMBIA公司公开使用的载体)的基础上改造而来，在多克隆位点两端分别引入了35s启动子和35s ployA载体图及多克隆位点等信息见图1。用Kpn I单酶切pC1300s，电泳检测其酶切为线性后进行去磷酸化反应，反应体系及条件参照promega说明书，反应产物用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司生产)回收，电泳检测其酶切完整性，置于-20℃冰箱保存。

(2)酶切TwPEPC1克隆质粒

用Kpn I单酶切测序为正确的TA克隆质粒，酶切产物用0.8％琼脂糖电泳分离，然后目标带用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司生产)回收，电泳检测其酶切完整性，置于-20℃冰箱保存。

(3)构建转化载体

将酶切回收的TwPEPC1构建到载体pC1300s上(见图1)，电转化入大肠杆菌DH5α。酶切检测与测序后将构建好的载体导入农杆碱型的根癌农杆菌EHA105菌株(该菌株为CAMBIA公司公开使用的农杆菌菌株)，构成转化菌株。

实施例3

农杆菌介导的遗传转化

本发明农杆菌介导的遗传转化方法主要参照华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室发表的“农杆菌介导的遗传转化操作手册”所示的方法(林拥军等，农杆菌介导的牡丹江8号高效转基因体系的建立，作物学报，2002，28(3)：294-300)。转化受体为水稻品种"中花11"的成熟种子所诱导产生的胚性愈伤组织。经过预培养、侵染、共培养、筛选得到具有潮霉素抗性的愈伤，再经过分化、生根、练苗和移栽，得到转基因植株。

(1)试剂和溶液缩写

本发明中培养基配制过程中所涉及到得的主要试剂的名称及缩写表示如下：

6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；

CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；

KT(Kinetin，激动素)；

NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；

IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；

2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-二氯苯氧乙酸)；

AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；

CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；

HN(Hygromycin B，潮霉素)；

DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；

N₆max(N₆大量元素成分溶液)；

N₆mix(N₆微量元素成分溶液)；

MSmax(MS大量元素成分溶液)；

MSmix(MS微量元素成分溶液)。

(2)主要溶液配方

1)N₆培养基大量元素母液(按照10倍浓缩液(10X)配制)：

将上述试剂逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000ml。

2)N6培养基微量元素母液(按照100倍浓缩液(100X)配制)：

将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000ml。

3)铁盐(Fe_2-EDTA)贮存液(按照100倍浓缩液(100X)浓缩液配制)：

将3.73g乙二胺四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)和2.78gFeSO₄·7H₂O分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000ml，至70℃温浴2h，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(按照100X浓缩液配制)：

加蒸馏水定容至1000ml，4℃保存备用。

5)MS培养基大量元素母液(按照10X浓缩液配制)：

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000ml。

6)MS培养基微量元素母液(按照100X浓缩液配制)：

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000ml。

7)2,4-D贮存液(1mg/ml)的配制：

称取2,4-D100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，于室温下保存。

8)6-BA贮存液(1mg/ml)的配制：

称取6-BA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

9)萘乙酸(NAA)贮存液(1mg/ml)的配制：

称取NAA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1mg/ml)的配制：

称取IAA100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)的配制：

称取葡萄糖125g，然后用蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液的配制：

称取AS 0.392g，加入DMSO 10ml溶解，分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液配制：

称取氢氧化钾5.6g，用蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。

(3)用于水稻遗传转化的培养基配方

1)诱导培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口后按常规方法灭菌(例如121℃下灭菌25min，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同)。

2)继代培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

3)预培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

4)共培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。

5)悬浮培养基

加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。

使用前加入1ml无菌葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。

6)选择培养基

加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，加入250μl HN(50mg/ml)和400μl CN(250mg/ml)分装倒入培养皿中(25ml/皿)。(注：第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400mg/升，第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250mg/l)。

7)预分化培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，250μl HN(50mg/ml)250μl CN(250mg/ml)，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

8)分化培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸并用蒸馏水定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

9)生根培养基

加蒸馏水至900ml，用1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

煮沸并用蒸馏水定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口，按上述方法灭菌。

(4)农杆菌介导的遗传转化步骤

1)愈伤诱导

a.将成熟的中花11水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1min，0.15％氯化汞(HgCl₂)种子表面消毒15min；

b.用灭菌水洗种子4～5次；

c.将种子放在诱导培养基上；

d.将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。

2)愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

3)预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

4)农杆菌培养

a.在带有对应抗性选择的LA培养基(LA培养基的配制参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002，北京)上预培养农杆菌EHA105(该菌株来自CAMBIA公司公开使用的农杆菌菌株)2天，温度28℃；

b.将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2～3h。

5)农杆菌侵染

a.将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；

b.调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀0.8～1.0；

c.将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30min；

d.转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

e.然后放在共培养基上培养3天，温度19～20℃。

6)愈伤洗涤和选择培养

a.灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

b.浸泡在含400mg/L羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30min

c.转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

d.转移愈伤至选择培养基上选择培养2～3次，每次2周。

7)分化

a.将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养5～7天；

b.转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照(1500～2000lux)下培养，培养温度26℃。

8)生根

剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照(1500～2000lux)下培养2～3周，培养温度26℃。

9)移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润，得到高产水稻。

10)自交繁殖

通过southern blotting检测高产水稻的拷贝数，并挑选单拷贝高产水稻进行自交繁殖。

由图2Southern blotting杂交结果图可知，高产水稻家系1、19和46均为单拷贝家系。

实施例4

发芽试验

将实施例3中单拷贝高产水稻进行自交种子去壳后，用体积分数为75％的乙醇消毒5min后用0.1％升汞处理15min。用无菌水洗3～4便后接种于含潮霉素的1/2MS培养基上，25℃光照培养室培养10天后计算发芽率。根据孟德尔遗传定律，阴性、杂合与纯合家系的发芽率接近0％，75％和100％。

由图3种子发芽实验图可知，阴性、杂合与纯合家系的潮霉素抗性种子的比例分别为约0％，75％和100％。

实施例5

RT-PCR表达量检测

(1)材料的选择

对照组1：野生型中花11水稻的分蘖期叶片；

处理组1：高产水稻家系1、19和46的分蘖期叶片。

(2)RT-PCR表达量检测

在水稻分蘖期取叶片，提取RNA后进行常规反转录实验。利用RT-PCR技术检测RNA的含量。根据图4RT-PCR表达量检测图可知，威氏海链藻TwPEPC1基因在高产水稻家系1、19和46中获得了表达。

实施例6

PEPC酶活测定

(1)材料的选择

对照组2：野生型中花11水稻分蘖盛期的叶片；

处理组2：高产水稻家系1、19和46分蘖盛期的叶片。

(2)酶活测定

取5cm长的分蘖盛期叶片，加入500μl 4℃预冷蛋白提取液(100mM Tris，10mMMgCl₂，1mM EDTA，5mM DTT，10％甘油和5％PVP,pH＝7.5)并用碾磨成匀浆后10000g离心5min，取上清即为总蛋白。

蛋白经考马斯亮进行蛋白定量后取约20μg总蛋白于200μl PEPC酶活反应液(50mMTris，10mM NaHCO₃，10mM MgCl₂，0.1mM EDTA，1mM DTT,3U MDH，0.2mM NADH，2mM PEP，pH＝7.5)中。反应温度为30℃并利用酶标仪每分钟检测反应液在340nm下NADH的吸光值。实验以消耗NADH的速率来代表PEPC的酶活。

由图5PEPC酶相对活结果图可知，高产水稻家系1、19和46的PEPC酶活性都得到了提高，其中家系19的活性最高，与实施例5结果一致。

实施例7

高产水稻植株的光合作用测定，生物量与产量考查

(1)材料的选择

对照组3：野生型水稻植株；

处理组3：高产水稻家系1、19和46植株。

(2)高产水稻植株的光合作用、农艺性状的测定

设计随机区组试验，每个材料种植3个重复，每个重复种植12*2＝24株。在分蘖盛期测定其叶片光合作用速率。同时以正常栽培条件进行水肥管理至成熟期，收取地上部分材料，晒干后分单株进行考种。

对照组3和处理组3的光合作用速率结果见表1。

表1对照组3和处理组3光合作用速率的测定结果

由表1可知，含有本发明威氏海链藻TwPEPC1基因的家系1、家系19和家系46植株比对照组2植株的光合作用速率显著提高。

对照组3和处理组3的农艺性状结果结果见表2。

表2对照组3和处理组3的农艺性状结果

由表2可知，含有本发明威氏海链藻TwPEPC1基因的家系1、家系19和家系46植株相对于对照组3植株在株高、生物重和单株产量上具有显著的优势。

由图6苗期植株长势图可知，处理组3的生物量都比对照组高，其中高产水稻家系1和9最高，与实施例5和实施例6的结果一致。

综上，在高产水稻1，9和46三个家系中，威氏海链藻TwPEPC1基因获得了表达，其中19号家系的表达量最高，46号家系最低。同时PEPC相对酶活结果也和RT-PCR结果相类似。苗期生长结果显示威氏海链藻TwPEPC1基因能显著提高转基因水稻生物学产量。农艺性状结果也显示19号家系比对照组2具有更高的产量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种威氏海链藻TwPEPC1基因及应用和培育高产水稻的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2772

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgctctcca atatgctggc tgaagtggta aagaaggaga atccggctgt ttacgatcta 60

tacactacat ttcgtagact tggaatgaag agagccgcca atccagacga tccaaccccc 120

ttcgaagaaa tgaaaaagct ggcctatgat atctctcccc acgatgcgct tggcgtcatg 180

aaaacatttt ccatcgcact caacttagtt aatgctgccg aagtacatca ccgcatgcgt 240

ctcgttcgta aaaatgaaca tgccgatgat actcatcata ttggtccatt gccaatgatc 300

gaagatagca ttcgtggaac catggagatt ttgctggagg atgatggggt gagcccagat 360

agcatttttg cagagttgat gagtcaaaaa tgtgagattg tattgacggc acatcctacg 420

gaggttaatc gcaaaaccat tatcaggaag taccgcaata tttcggaatt gttggcacat 480

ttggaacggc ctgatctcca tccttttgaa tgtgccgagg cattaaacaa cttgcgagga 540

atcattgctg cgatttgggg atctgatgaa attagacgtg tcaaaccaac ggttcagaaa 600

gaagctgctg gagggtgtgc tgtcattgaa tctgttcttt gggatgcggt tccgtcatat 660

cttcgcaagc tcgatgcaca atgccgcgtt acgctcggaa agaagctacc tgtggatgtt 720

acccctgtaa aattcgcctc ttggatagga ggagatcgtg atggaaatcc taactgtact 780

cctgctgtga ctcaagaggt tcttgcttac cagaaactcc gcgctgccaa gatgtttttg 840

aatgacctca acttcttgta ttctgagttg gcaatttcca gccgattctc tccagagcta 900

gaagcactcg ccgccacaat tgagaattcc gacgacgagc tcgagaagta ccgccgcgtt 960

attggccatc ttcgccgtcg tttagttcga actgtcaagg attgtgaagc caaactgcaa 1020

tctctggcga aatctcctga aacgttgtcc gccgaagctg catttggagc acttgaagga 1080

tgggaagatg tggaaccaat catgaaaact gatgacttga tggctccttt gaaggtaatc 1140

tatgagagtt tggtgacgac aggatttgaa ttggtggcag atggacgcgt ttcggatatt 1200

attcgccgcg ttgcaatctt cgggttgaca ctggtgcctc tcgatattcg tgaggagtct 1260

actaaacata ctttggcttt ggatgcaatt actcgccatc tgggcattgg aagttacaag 1320

gaatgggacg aaacagcaag gttgagctgg ttacaatctg agttgacgag tcgacgccct 1380

ctttttcgca taagagatgt tgaaaataat ttgcttgggt tggatcctga tgtgatcaag 1440

actttgatgg tattcaaagt agcatctgag caggaaccgg aatctctggg agcatatgtc 1500

attagtcagg caacaagtgc aagcgatgta ttggcagtga tgttattgca aaagcagttt 1560

ggaatgacaa aggccactgg caaattaatg cgtgttgtgc cgttgtttga gactctcgat 1620

gatttaactg ggtcaccgaa gcaactccaa actctttttg ggatcacgag ctacatggat 1680

gcgatcaacc gcaaacaaga ggtaatggtt ggatactctg atagtgcaaa agatgcagga 1740

agactcgcgg cttgctgggc acaatacact gcacaagaag ctatggcgaa agtggcggac 1800

aaatttggtg tcgagctgac ttttttccat ggcaagggtg gaactgttgg acgaggaggc 1860

aaccctgctc tctatcgcgc cattctatcc catcccccaa acactatcaa tggacgtttc 1920

cgcgtcactg agcaaggaga aatgatcagg cagaactttg gctcattgga aatcgctgag 1980

aggtcattgg atatttacac agctgcattg ttgagagagc gcttcaccaa gcatatcgag 2040

ccgaagcaaa aatggagaga tcaaatgcaa cgagtctccg aagcctcgtg ttcgaactac 2100

cgatatcttg ttcgagagga tccacgattt gtgccatact tcaggcaggc aacaccagag 2160

ctggagcttg gtatattgaa catcggcagt cgaccggcca agcgtaatcc taagggtggt 2220

gtcgaaagtc tgagagccat tccatggacc tttgcatggg ctcaaactcg tatgcacctt 2280

tcagcttggc ttggtgtcgg tgcagggctc aattctgaaa atgaagaaga cagagctacg 2340

ttgcgtgaaa tgtacgagga gtggccatgg ttcagagaaa tcatcagtct catttccatg 2400

ctggtatcta agacagactt ttccatcacc aagaactacg acgaactcct tgtagatcca 2460

gatttgatga gtcttggcga cgaagtgagg acgatgctcg ttgaaactcg acaagctgtg 2520

attgacgtgt caggatctaa agacatcagc ggacctcatg ttcagttgat gcgtgcttct 2580

tcaatgattc gcaatcccta cgttgatagt atcaatgttg tgcaagcgga gcttttaaag 2640

gtgttgcgtg cgatgcccgc cgatgactct tctgacttga ctccagagtt aaaagaaatc 2700

aagaaagttc gtatcgatgc cctgctcttg tcaatcaagg gaattgctca aggaatgaaa 2760

aacagtggat aa 2772

<210> 2

<211> 2778

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgctctcca acatgctcgc ggaggttgta ctcaaggaaa accccgtggt gtacgattac 60

tacacgagat ttcgcaagtt gggtatggac cgcgccgcaa atcccgatga tacggcgccg 120

tttgaggaga tgaagaagct ggcgtatgat attaaccctc gcgatactct gggagtgatg 180

aagacgtttt cgatcgcatt gaatttggtg aatgctgcgg aggttcatca tcgtattcgg 240

ttggtgaggg tgagtgagtt gaaagatgac gtcaatcata ttggaccgct gccgatggtg 300

gaagatagta ttcgtggtac tatggagatt ttgttggagg gggattgtga tgataaggat 360

aagttgtttg agaggttgac tacgcaaaag tgtgagattg tgctgacggc ccatcccaca 420

gaggttaata ggaagacaat cattagcaag taccgtaaga tttcagaact cctcgcttac 480

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atcatctctg ctatctgggg tgccgacgag atcaggcgtg tcaagcccac ggtacaaaaa 600

gaagcagccg gaggatgtgc tgtcattgaa tccgtcctct gggacgccgt accctcctac 660

ctccgtaaac tcgacgctca atgccgtgtc accctcggta aaaagttccc cgttgacgct 720

acacccatta agtttgcctc gtggattgga ggtgatcgcg acggtaaccc caactgtacc 780

cctgaggtta cgttggaggt ggtaacacgt caaaggctac gtgcggcaaa gatgtttttg 840

aatgatctca acatgttgta ttcggagttg gcaatctcta gtcgtttctc aaaagagttg 900

gaggcattgg ctgctagtgt aaaaaaatca gacgacaacc gtgagaagta ccgccgtgtg 960

attggtcatt tgcgtcgtcg tctagtacgc acggtgaagg agtgtgaggc caagcttcac 1020

actcttaccg acacgtccga agttcagctt gcgtctgcgg aaagtgcctt tggaagtttg 1080

cagggatggg aggatgtgga accaatcatc aaatcggagg agttgatgac tccgctgagg 1140

atcatgtacg attcgttggt agaaaccgga tttgagctgg tggcagatgg acacgtttct 1200

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tatgttatta gtcaagcaaa tactgctagt gacgtcttgt tagtgatgtt actgcagaag 1560

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cttaccgact tgacaaactc gcctgcgcaa ctcgagagac tcttcagcat caccaattat 1680

ttgggtgcta tcaacggtaa gcaggaggtc atggttggat actctgactc tgcaaaggat 1740

gctggacgac ttgctgcatg ctgggctcaa tacactgcac aggaggccat ggcaaacgtg 1800

gcagacagat acggcgttga acttactttc ttccacggaa aaggaggaac cgtcggaaga 1860

ggaggcaacc cagctcttta tcgcgccatc ctatctcatc ctcccaacac aatcaacgga 1920

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gttgaaccta aacaggaatg gagagatcag atggaacgtg tttctgaggt gtcgtgtgct 2100

gcctacaggc acactgttcg agatgacccg cgcttcgtcc cctatttccg ccaggcgacc 2160

cctgagttgg aacttggcag attgaatatt ggatctcgcc ccgccaaacg caatcctaag 2220

ggaggtgttg acagtttgag agctattccg tggacattcg cttgggcaca gactcgtatg 2280

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aagactttgc aggagatgta tgaacagtgg ccctggttcc gtgagatcat cagcttgatc 2400

tcaatgcttg tgagtaagac cgacttttct atcacgaaga actatgacga tcttctcgtg 2460

gattccaatc tgaggagtct cggggatgaa gtgaggaaca aacttgtgga gacacgtcag 2520

gcagtgattg acgtttctgg agcaacggat atcagtggac ctcatgttca attgatgcga 2580

gcgtcctcta ctattcgcaa tccgtatgtc gacagtatca acgtagttca agcggaaatc 2640

ttgaaagtat tgcgttcaat gcccgaggac gactcacctg atctcactcc agaattaagg 2700

acgatcaaga actgtcgtac tgacgctttg ttgttgtcca ttaagggcat tgctcaggga 2760

atgaagaaca gtggatag 2778

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtaccatgc tctccaayat gytggcwgar gtwgt 35

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtaccttat ccactgtttt tcattccttg agc 33