阅读说明：本技术 犬附红细胞体唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因的原核表达、纯化方法和应用 (Prokaryotic expression and purification method and application of canine eperythrozoon sialoglycoprotein endopeptidase osgep gene ) 是由 宋淇淇 姜阜杉 杨琳燕 秦顺义 赵瑞利 于 2020-04-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种犬附红细胞体唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因的原核表达、纯化方法,步骤如下：⑴设计扩增osgep基因的特异性引物；⑵PCR扩增获得osgep基因片段并纯化；⑶将osgep基因片段中三联密码子为TGA处点突变为TGG；⑷将突变后的osgep基因连接至原核表达载体,构建重组表达质粒；⑸重组表达载体的原核表达以及表达形式的检测；⑹纯化osgep重组蛋白。本发明方法将犬附红细胞体的唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因进行原核表达并纯化得到纯度高的osgep蛋白,此蛋白可用于制备多抗血清、单克隆抗体,也可作为抗原包被酶标板,从而为犬附红细胞体血清学检测方法的建立奠定基础。(The invention relates to a prokaryotic expression and purification method of canine eperythrozoon sialoglycoprotein endopeptidase osgep gene, which comprises the following steps of ⑴ designing a specific primer for amplifying the osgep gene, ⑵ PCR amplification to obtain osgep gene fragment and purifying, ⑶ point mutation of a triplet codon in the osgep gene fragment to TGG for TGA, ⑷ connecting the mutated osgep gene to a prokaryotic expression vector to construct recombinant expression plasmid, ⑸ detecting prokaryotic expression and expression form of the recombinant expression vector, and ⑹ purifying osgep recombinant protein.)

犬附红细胞体唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因的原核表达、纯 化方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是一种利用犬附红细胞体唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因的原核表达、纯化方法和应用。

背景技术

犬附红细胞体(Eperythrozoon canis)是一类附着于犬红细胞表面，或者游离于血浆中的不可培养的病原微生物，其寄生所引起的主要临床症状为贫血、发热、以及黄疸。临床上犬附红细胞体病的诊断最常用的方法为直接镜检法，但由于附红细胞体的形态缺乏典型性，很难进行确诊。此外，利用犬附红细胞体的16SrRNA基因进行PCR检测是目前临床上检测此种疾病较为先进和准确的方法，但此法检测成本昂贵，对检测人员的技术要求较高，且需要特定的仪器，如PCR扩增仪、琼脂糖凝胶电泳系统等，因此在临床上使用有较大的局限性。众所周知，血清学检测方法具有成本低，操作简单快速，且适用于临床大规模检测等优点，而目前市面上尚无针对于犬附红细胞体病的血清学检测方法。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种利用犬附红细胞体唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因的原核表达、纯化方法和应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种犬附红细胞体唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因的原核表达、纯化方法，步骤如下：

⑴设计扩增osgep基因的特异性引物；

⑵PCR扩增获得osgep基因片段并纯化；

⑶将osgep基因片段中三联密码子为TGA处点突变为TGG；

⑷将突变后的osgep基因连接至原核表达载体，构建重组表达质粒；

⑸重组表达载体的原核表达以及表达形式的检测；

⑹纯化osgep重组蛋白。

而且，所述步骤⑴中，根据唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因序列，设计扩增此基因的特异性引物，分别在上游和下游引物插入BamHⅠ、HindⅢ酶切位点；特异性引物序列为：

Osgep-F：SEQ NO.1，即5'-GGATCCGTGGGGAGTCTCATATTAGGAAT-3'(下划线为BamHⅠ酶切位点)；

Osgep-R：SEQ NO.2，即5'-AAGCTTCTAAATTAAAAAATAGGCGTAAT-3'(下划线为HindⅢ酶切位点)。

而且，所述步骤⑵中PCR扩增反应条件为：95℃预变性10分钟；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸60秒，35个循环；72℃过延伸10分钟；

PCR扩增反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测；将扩增产物进行凝胶回收，所回收的DNA片段进行序列测定。

而且，所述步骤⑷中原核表达载体为pET-32a。

或者，所述步骤⑶中，因犬附红细胞体在分类上属于支原体，其三联密码子中的TGA编码色氨酸，但TGA在大肠杆菌中是终止密码子，为了让osgep基因在大肠杆菌表达系统中顺利表达，需将osgep基因中第240位三联密码子TGA突变为TGG，以适应后续的原核表达系统；

具体方法为：设计碱基点突变引物，按照点突变试剂盒进行操作，最终将突变后的质粒送测，选出成功突变的osgep基因片段克隆质粒。

而且，所述步骤⑷中，将成功突变的osgep基因片段克隆质粒及pET-32a空载体质粒分别用BamHⅠ、HindⅢ限制性内切酶进行双酶切，此后分别回收酶切后的osgep基因片段以及pET-32a空载体，取离心管加入osgep基因片段、pET-32a空载体片段、T4 DNA连接酶和连接用buffer，osgep基因片段：pET-32a空载体片段：T4 DNA连接酶：连接用buffer的体积比为6：2：1：1，16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布氨苄青霉素LB平板后，37℃培养过夜；挑取平板上单个菌落，接种于5mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养8h，提取质粒后进行双酶切鉴定。

而且，所述步骤⑸中，重组表达载体的原核表达时的诱导表达条件为：37℃，摇床转速为180rpm，诱导剂IPTG的终浓度为0.1mM，诱导时间为4h；

在重组蛋白表达形式的检测中，取诱导表达的菌液1.5mL于8000r/min离心2min收集菌体，用500μL PBS溶液或者ddH₂O重悬菌体，再次离心集菌，反复洗涤菌体2-3次，以去除培养基残液；将每管500μL菌体溶液置于冰水混合物上用超声破碎仪进行破碎，15s/次，间隔30s，每管破碎8-10次，直至液体澄清具有透光性；将已破碎好的样品于4℃条件下12000r/min离心10min；取40μL上清溶液至1.5mL EP管中，加入50μL 2×SDS上样缓冲液，以及10μL DTT溶液，涡旋混匀；将沉淀中加入40μL灭菌ddH₂O，50μL 2×SDS上样缓冲液，以及10μL DTT溶液，充分涡旋混匀；将所有样品在沸水中煮10min，之后立即转入冰上静置5min；处理之后的样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳检测蛋白表达形式。

而且，所述步骤⑹中，收集诱导表达的重组表达蛋白菌体，将菌体沉淀中加入1/10体积的平衡缓冲液，重悬后进行破碎；破碎后的澄清液体于4℃条件下12000r/min离心10min，去除上清，将沉淀用包涵体平衡缓冲液室温作用2h，或4℃作用过夜，直至沉淀溶解；此后将所述溶液进行纯化，收集纯化后的蛋白；

其中，所述平衡缓冲液为：8M咪唑，0.1M NaH₂PO₄，0.01M Tris碱，溶剂为水，混匀后调节pH至8.0，用0.45μm的滤器过滤溶液，置于4℃备用。

而且，所述步骤⑹中使用镍柱亲和层析法纯化osgep重组蛋白。

如上所述的犬附红细胞体唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因的原核表达、纯化方法得到的osgep重组蛋白在免疫方面中的应用。

如上所述的犬附红细胞体唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因的原核表达、纯化方法得到的osgep重组蛋白在犬附红细胞体的临床诊断和/或检测试剂盒的开发方面中的应用。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明方法将犬附红细胞体的唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因进行原核表达并纯化得到纯度高的osgep蛋白，此蛋白可用于制备多抗血清、单克隆抗体，也可作为抗原包被酶标板，从而为犬附红细胞体血清学检测方法的建立奠定基础。

2、本发明应用PCR技术扩增获得了犬附红细胞体osgep基因序列，经过碱基点突变试验后，将其三联密码子为TGA处突变为TGG，此后将点突变成功的osgep基因连接至pET-32a表达载体中，构建重组表达质粒，将重组表达质粒于大肠杆菌原核表达系统中进行诱导表达，利用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白，并最终获得了较高纯度的osgep重组蛋白。osgep重组蛋白的高效表达和纯化为进一步制备多抗血清或单克隆抗体，以及为建立犬附红细胞体血清学检测方法奠定了基础。

3、本发明所要解决的是当前针对于犬附红细胞体病临床上尚无可用的血清学检测方法的实际问题，而提供一种犬附红细胞体osgep基因重组原核表达蛋白及其纯化方法。本发明将犬附红细胞体osgep蛋白基因进行原核表达并利用镍柱亲和层析法进行纯化，通过透析复性得到了纯度高可溶性好的osgep蛋白。表达的蛋白可用于免疫动物制备多抗血清，还可作为包被抗原建立酶联免疫吸附试验检测方法，也可为免疫荧光、免疫组化、胶体金检测卡的制备提供原材料，从而为今后对此种病原临床诊断和检测试剂盒的开发提供基础。

附图说明

图1为本发明中pET-32a-osgep重组质粒的双酶切鉴定结果图；其中，M：DL2000plus Marker；1,2：BamHⅠ和HindⅢ双酶切产物；

图2为本发明中osgep蛋白诱导表达和表达形式鉴定结果图；其中，M：蛋白质Marker；1：未加诱导剂所对应osgep表达菌液；2：添加诱导剂所对应osgep表达菌液；3：osgep表达菌液处理后上清成分；4：osgep表达菌液处理后沉淀成分；

图3为本发明中osgep蛋白纯化结果图；其中，M：蛋白质Marker；1：纯化后osgep蛋白；

图4为本发明中BCA法测定蛋白浓度的标准曲线图。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

一种犬附红细胞体唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因的原核表达、纯化方法，步骤如下：

⑴设计扩增osgep基因的特异性引物；

⑵PCR扩增获得osgep基因片段并纯化；

⑶将osgep基因片段中三联密码子为TGA处点突变为TGG；

⑷将突变后的osgep基因连接至原核表达载体，构建重组表达质粒；

⑸重组表达载体的原核表达以及表达形式的检测；

⑹纯化osgep重组蛋白。

较优地，所述步骤⑴中，根据唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因序列，设计扩增此基因的特异性引物，分别在上游和下游引物插入BamHⅠ、HindⅢ酶切位点；特异性引物序列为：

Osgep-F：SEQ NO.1，即5'-GGATCCGTGGGGAGTCTCATATTAGGAAT-3'(下划线为BamHⅠ酶切位点)；

Osgep-R：SEQ NO.2，即5'-AAGCTTCTAAATTAAAAAATAGGCGTAAT-3'(下划线为HindⅢ酶切位点)。

较优地，所述步骤⑵中PCR扩增反应条件为：95℃预变性10分钟；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸60秒，35个循环；72℃过延伸10分钟；

PCR扩增反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测；将扩增产物进行凝胶回收，所回收的DNA片段进行序列测定。

较优地，所述步骤⑷中原核表达载体为pET-32a。

或者，所述步骤⑶中，因犬附红细胞体在分类上属于支原体，其三联密码子中的TGA编码色氨酸，但TGA在大肠杆菌中是终止密码子，为了让osgep基因在大肠杆菌表达系统中顺利表达，需将osgep基因中第240位三联密码子TGA突变为TGG，以适应后续的原核表达系统；

具体方法为：设计碱基点突变引物，按照点突变试剂盒进行操作，最终将突变后的质粒送测，选出成功突变的osgep基因片段克隆质粒。

较优地，所述步骤⑷中，将成功突变的osgep基因片段克隆质粒及pET-32a空载体质粒分别用BamHⅠ、HindⅢ限制性内切酶进行双酶切，此后分别回收酶切后的osgep基因片段以及pET-32a空载体，取离心管加入osgep基因片段、pET-32a空载体片段、T4 DNA连接酶和连接用buffer，osgep基因片段：pET-32a空载体片段：T4 DNA连接酶：连接用buffer的体积比为6：2：1：1，16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布氨苄青霉素LB平板后，37℃培养过夜；挑取平板上单个菌落，接种于5mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养8h，提取质粒后进行双酶切鉴定。

较优地，所述步骤⑸中，重组表达载体的原核表达时的诱导表达条件为：37℃，摇床转速为180rpm，诱导剂IPTG的终浓度为0.1mM，诱导时间为4h；

在重组蛋白表达形式的检测中，取诱导表达的菌液1.5mL于8000r/min离心2min收集菌体，用500μL PBS溶液或者ddH₂O重悬菌体，再次离心集菌，反复洗涤菌体2-3次，以去除培养基残液；将每管500μL菌体溶液置于冰水混合物上用超声破碎仪进行破碎，15s/次，间隔30s，每管破碎8-10次，直至液体澄清具有透光性；将已破碎好的样品于4℃条件下12000r/min离心10min；取40μL上清溶液至1.5mL EP管中，加入50μL 2×SDS上样缓冲液，以及10μL DTT溶液，涡旋混匀；将沉淀中加入40μL灭菌ddH₂O，50μL 2×SDS上样缓冲液，以及10μL DTT溶液，充分涡旋混匀；将所有样品在沸水中煮10min，之后立即转入冰上静置5min；处理之后的样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳检测蛋白表达形式。

较优地，所述步骤⑹中，收集诱导表达的重组表达蛋白菌体，将菌体沉淀中加入1/10体积的平衡缓冲液，重悬后进行破碎；破碎后的澄清液体于4℃条件下12000r/min离心10min，去除上清，将沉淀用包涵体平衡缓冲液室温作用2h，或4℃作用过夜，直至沉淀溶解；此后将所述溶液进行纯化，收集纯化后的蛋白；

其中，所述平衡缓冲液为：8M咪唑，0.1M NaH₂PO₄，0.01M Tris碱，溶剂为水，混匀后调节pH至8.0，用0.45μm的滤器过滤溶液，置于4℃备用。

较优地，所述步骤⑹中使用镍柱亲和层析法纯化osgep重组蛋白。

如上所述的犬附红细胞体唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因的原核表达、纯化方法得到的osgep重组蛋白在免疫方面中的应用。

如上所述的犬附红细胞体唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因的原核表达、纯化方法得到的osgep重组蛋白在犬附红细胞体的临床诊断和/或检测试剂盒的开发方面中的应用。

具体地，相关制备及检测如下：

本发明中所使用的限制性内切酶、DNA聚合酶、dNTP、T4 DNA连接酶等均可以为大连宝生物(Takara)工程有限公司产品，胶回收纯化试剂盒、质粒提取试剂盒可以购自天根生化科技(北京)有限公司，高保真Pfu DNA聚合酶、大肠杆菌DH5α和大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞、镍柱亲和层析填料等均可购自北京全式金生物技术有限公司，碱基点突变试剂盒可购自上海碧云天生物技术有限公司，其他所用化学试剂均可为国产化学分析纯产品。

一、犬附红细胞体osgep的原核表达及纯化方法，其具体步骤为：

1.引物的设计与合成

根据GenBank中已公布的犬附红细胞体唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因序列(gi|374317610:c885667-884744)，用Primer 5.0设计扩增其全长序列的引物，分别在上游和下游引物插入限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ酶切位点，引物的合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成，引物序列为：

Osgep-F:5'-GGATCCGTGGGGAGTCTCATATTAGGAAT-3'(下划线为BamHⅠ酶切位点)

Osgep-R:5'-AAGCTTCTAAATTAAAAAATAGGCGTAAT-3'(下划线为HindⅢ酶切位点)

2.目的基因的PCR扩增

用血液/组织基因组提取试剂盒提取感染了犬附红细胞体的犬血基因组DNA，以此为模板，用上述设计的特异性引物扩增犬附红细胞体osgep基因。

PCR反应体系如下：

PCR反应程序：95℃预变性10分钟；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸60秒，35个循环；72℃过延伸10分钟，15℃保温。

PCR扩增反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测。用胶回收纯化试剂盒将PCR扩增产物进行凝胶回收，操作按试剂盒说明书进行。

3.碱基点突变试验

为了让osgep基因在大肠杆菌表达系统中顺利表达，需将osgep基因中第240位三联密码子TGA突变为TGG，以适应后续的原核表达系统。具体方法为：设计覆盖需突变碱基处的碱基点突变引物，以待突变的质粒为模板，利用设计好的突变引物以及高保真Pfu酶进行PCR扩增。

PCR反应体系如下：

PCR程序：95℃预变性2分钟；94℃变性20秒，60℃退火20秒，72℃延伸60s，共18个循环；72℃过延伸5分钟，15℃保温。

PCR反应后，直接在PCR反应体系中加入2μL DpnⅠ，混匀后37℃孵育1小时。DpnⅠ消化完毕后直接转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，或者经预冷的无水乙醇将DNA沉淀后溶于较小的体积后再进行转化。将转化后的平板挑取若干单菌落接种于LB液体培养基中180rpm振荡培养8-12h。此后将培养后的菌液进行PCR鉴定，将阳性菌液送至测序公司，选出成功突变的osgep基因片段克隆质粒。

4.重组表达载体pET-32a-osgep的构建

将成功突变的osgep基因片段克隆质粒及pET-32a空载体质粒分别用BamHⅠ、HindⅢ限制性内切酶进行双酶切，此后用胶回收试剂盒分别回收酶切后的osgep基因片段以及pET-32a空载体片段，取200μL离心管加入6μL目的基因片段，2μLpET-32a空载体片段，1μLT4 DNA连接酶和1μL连接用buffer，16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布氨苄青霉素LB平板后，37℃培养过夜；挑取平板上单个菌落，接种于5mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养8h，按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒后用BamHⅠ、HindⅢ对重组质粒进行双酶切和电泳检测。

双酶切反应体系如下：

将酶切反应体系混合均匀，置于37℃培养箱中孵育8h。经琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示，构建的重组质粒pET-32a-osgep经BamHⅠ和HindⅢ双酶切之后，产生约5900bp的载体骨架片段和924bp的osgep基因片段。

5.重组质粒pET-32a-osgep的原核表达以及表达形式的检测

将构建好的重组表达质粒pET-32a-osgep转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞，使其在平板上生长8-12h，待单菌落长出后，挑取单菌落，接种于3mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，放置于37℃摇床中180rpm振荡培养过夜。将过夜培养的菌液按1：100比例转接入5mL新鲜的含氨苄青霉素的LB液体培养基中，放置于37℃摇床中180rpm振荡培养至OD₆₀₀值在0.5-0.8之间。此时于超净台取出3mL菌液转入新的无菌细菌培养瓶，并加入IPTG诱导剂使其终浓度为0.1mM。将未加IPTG的菌液以及加入IPTG菌液做好标记，同时放入37℃摇床中180rpm继续振荡培养4h。将振荡培养完成之后的菌液分别取1mL转入1.5mL EP管中，8000r/min离心2min收集菌体。向每管菌体沉淀中加入40μL灭菌ddH₂O，50μL 2×SDS上样缓冲液，以及10μL DTT溶液，充分涡旋混匀后，于沸水中煮10min，之后立即转入冰上静置5min。处理之后的蛋白样品可以直接用于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测或者置于-20℃保存备用。

在重组蛋白表达形式的检测中，取诱导表达的菌液1.5mL于8000r/min离心2min收集菌体，用500μL PBS溶液或者ddH₂O重悬菌体，再次离心集菌，反复洗涤菌体2-3次，以去除培养基残液；将每管500μL菌体溶液置于冰水混合物上用超声破碎仪进行破碎，15s/次，间隔30s，每管破碎8-10次，直至液体澄清具有透光性；将已破碎好的样品于4℃条件下12000r/min离心10min。取40μL上清溶液至1.5mL EP管中，加入50μL 2×SDS上样缓冲液，以及10μL DTT溶液，涡旋混匀；将沉淀中加入40μL灭菌ddH₂O，50μL 2×SDS上样缓冲液，以及10μL DTT溶液，充分涡旋混匀。将所有样品在沸水中煮10min，之后立即转入冰上静置5min。处理之后的样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳检测蛋白表达形式。

重组蛋白的诱导表达结果和表达形式的鉴定结果见图2，可见与未诱导菌液相比，诱导后的表达菌液在约40kDa处出现了特异性的蛋白表达条带，且osgep蛋白主要存在于表达菌破碎后的沉淀中，是以包涵体的形式表达。

6.重组蛋白的纯化

此步骤中所需的试剂：

平衡缓冲液(包涵体蛋白专用)：8M咪唑，0.1M NaH₂PO₄，0.01M Tris碱，溶剂为水，混匀后调节pH至8.0，用0.45μm的滤器过滤溶液，置于4℃备用。

洗脱液：先配制咪唑终浓度为400mM的洗脱液原液(咪唑粉末溶于平衡缓冲液中)，再用平衡缓冲液作为稀释液将原液稀释到原浓度的5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％。

具体的蛋白纯化步骤如下：

(1)将大量诱导表达的细菌培养物于4℃条件下8000r/min离心10min，弃去上清。将沉淀用1/10体积的平衡缓冲液重悬后，用压力破碎仪破碎至液体澄清。

(2)于4℃条件下12000r/min离心10min。弃去上清，将沉淀用40mL包涵体平衡缓冲液室温作用2h，或4℃作用过夜，直至沉淀溶解。

(3)平衡：用5-10倍柱体积平衡缓冲液平衡层析柱。

(4)上样：将处理后的包涵体溶解液经微滤后上柱，进行3次反复上样，以提高目的蛋白与介质的结合率。

(5)洗涤：用5-10倍柱体积平衡缓冲液洗涤层析柱。

(6)洗脱：用不同浓度咪唑溶液洗脱目的蛋白，按咪唑浓度由低到高进行梯度洗脱，每个浓度的洗脱体积为2倍柱体积，小心收集洗脱液。

(7)将镍柱纯化过程中各步骤所得到的溶液各取40μl，按上清的处理方法进行处理后进行SDS-PAGE，检验蛋白纯化效果。

(8)根据跑胶结果将有单一目的蛋白带的洗脱液集中倒于处理过的透析袋中，在4℃条件下于PBS透析液中透析3天，每8小时换一次透析液。透析结束后用蔗糖包埋法或者超滤法将蛋白浓缩至较小的体积。测定蛋白浓度后分装于小管置于-80℃保存备用。

将浓缩后的纯化蛋白经过适当稀释后经上样缓冲液处理后进行SDS-PAGE。SDS-PAGE结果见图3，可见经镍柱纯化后的蛋白显示出了单一的约40kDa大小的目的蛋白条带。

7.重组蛋白浓度的测定

将经纯化和浓缩后的重组蛋白用BCA法进行蛋白浓度的测定，此步骤中所需试剂如下：

蛋白标准贮存液：取0.8mL蛋白标准配制液加入到20mg BSA中，充分溶解后配制成25mg/mL的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也可以-20℃长期保存。

BCA工作液：用50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50：1)配制适量BCA工作液，充分混匀。此工作液于室温24小时内稳定。

具体的蛋白浓度测定步骤如下：

(1)取适量25mg/mL蛋白标准贮存液，用0.9％NaCl或PBS溶液稀释至终浓度为0.5mg/mL。稀释后的0.5mg/mL蛋白标准也可以-20℃长期保存。

(2)将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20μL加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μL。

(3)加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20μL。

(4)各孔加入200μLBCA工作液，37℃放置20-30分钟。

(5)测定OD562值。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。

以OD562值为横坐标，以蛋白浓度(mg/mL)为纵坐标做出标准曲线，标准曲线计算结果见图4。根据标准曲线得到OD562值和蛋白浓度之间的线性关系方程式，此方程式为y＝3.829x-0.484，且R²＝0.996。三次测得样品的OD562平均值为0.458。将osgep蛋白的吸光值带入上述方程式中，得到osgep蛋白的浓度为1.27mg/mL。

二、用纯化后的犬附红细胞体osgep重组蛋白免疫小鼠制备多抗血清

1.免疫程序

共免疫三次。首免采用抗原与弗氏完全佐剂乳化后免疫小鼠，免疫剂量为100ug/只，首免后14天用抗原与弗氏不完全佐剂乳化后进行二免，免疫剂量减半，10天后以同样剂量进行三免，三免后7天可尾部少量采血测抗体效价。免疫程序结束后，采用眼眶采血法最大限度的收集小鼠血清。

2.抗体效价的检测

用间接ELISA法对免疫后小鼠血清进行抗体效价的检测，同时设空白对照，以及阴性对照(免疫前小鼠血清)

此步骤中所需试剂：

包被液(25mmol/L碳酸盐缓冲液pH9.6)：1.59g Na₂CO₃和2.93g NaHCO₃溶于1000mLddH₂O。

PBS(pH 7.4)：NaCl 8.0g，KCl 0.201g，Na₂HPO4 1.44g，KH₂PO₄ 0.24g，溶于1000mLddH₂O。

洗涤液(PBST)：在1000mL PBS中加入0.5mL Tween20，混匀后4℃保存备用。

保温液：牛血清白蛋白(BSA)0.1g溶于100mL洗涤液。

封闭液：牛血清白蛋白(BSA)或脱脂奶粉数克溶于100mL洗涤液。

0.1mol/L柠檬酸液：柠檬酸2.1g，加入ddH₂O充分溶解，定容至100mL。

底物缓冲液(磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液，pH 5.0)：25.7mL 0.2mol/L Na₂HPO₄，24.3mL 0.1mol/L柠檬酸，50mL ddH₂O。

0.2％TMB母液：TMB(3，3，5，5-四甲基联苯胺)0.2g溶于100mL无水乙醇中，溶解过程需要玻璃棒剧烈搅拌以加速溶解。

底物液显色液：需新鲜配制。TMB母液和底物缓冲液按体积比1：19的比例混合，每mL显色液加入30％H₂O₂ 0.2μL。

终止液：质量浓度0.25％氢氟酸溶液。

具体的抗体效价检测步骤如下：

(1)用包被液将抗原稀释至10μg/mL，以100uL/孔包被酶标板，4℃过夜。

(2)取出ELISA板，甩干，加入洗涤液180μL，静置三分钟，甩干，如此洗涤三次。

(3)以150uL/孔加入封闭液，37℃温育45min，甩干后拍干。

(4)以100uL/孔加入倍比稀释的待检血清(待检血清以1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200依次进行倍比稀释)，同时设立阴性及空白对照，37℃温育1h，洗涤三次。

(5)以100uL/孔加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗(1:1000)，37℃温育1h，洗涤四次。

(6)以100uL/孔加入TMB底物显色液，室温避光静置10min。

(7)以50uL/孔加入0.25％HF终止液结束反应，用酶标仪测定OD_630nm值，进行数据分析。

上述所制备的小鼠多抗血清抗体效价检测结果见表1，可见所收集的四份小鼠多抗血清效价均可达1:51200以上。

表1 osgep蛋白多抗血清抗体效价.ELISA检测结果

附：本发明所涉及的序列如下：

SEQUENCE LISTING

SEQUENCE LISTING ID No.3：犬附红细胞体唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因的DNA核苷酸序列

SEQUENCE LISTING ID No.4：犬附红细胞体唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因的蛋白质氨基酸序列

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。

序列表

<110> 天津农学院

<120> 犬附红细胞体唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因的原核表达、纯化方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA/RNA

<213> Osgep-F(Unknown)

<400> 1

ggatccgtgg ggagtctcat attaggaat 29

<210> 2

<211> 29

<212> DNA/RNA

<213> Osgep-R(Unknown)

<400> 2

aagcttctaa attaaaaaat aggcgtaat 29

<210> 3

<211> 924

<212> DNA/RNA

<213> 犬附红细胞体唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因的DNA核苷酸序列(Unknown)

<400> 3

gtggggagtc tcatattagg aattgaaact agttgtgatg acacttctgt tgctttagtt 60

cggaatggta agctaataga tgtaattact gaatcttcag cttctcttca gaattcatgg 120

ggaggagtgg ttcctgagat tgctgctaga tatcatggag ataggttggt tcccatactg 180

ggagcacttt tggatagaaa tcatctatct ttgggggata taactcacat agcttatact 240

agtcatcccg gattggcagg ctgtctactt accggacaag tctttgccaa atcccttgcc 300

ttcttaatta agaaaccgtt aattccggtt aatcatgtgt atggtcatgt tttttctgtt 360

ggtttaactc actctttaga ttttcctcat ttggctcttg tggtctctgg aaagacaact 420

tctttatttc tagttaacgg ctatagacaa atatatttat tagatgaaac caaagacaat 480

gctattgggg aggtgtatga caaagtggct agaaggttag atttgggata tccgggcgga 540

atggcaatag atgaaatgtt tgatgagaat cttaatgttc ctcaattact taagaatcgt 600

tctaatccag ctaaaccttt tagctatgct ggtattttga gtgcaactat gagaatttgt 660

gattcaatgc ctgatttgaa ggcgcaaaag ggatatgttg ccactatttt tcaaaagtga 720

gtgatagatg agttaatagt aaagataaaa tattggatag gtcagacggg agtaaatact 780

ttgactgtgt ctggtggggt cgcggcaaac aggtatttac gtgctcagat gaagagtttg 840

aatataagat ccttattggt ggatggatct tactctggag ataatgcagc tatgatagct 900

tattacgcct attttttaat ttag 924

<210> 4

<211> 307

<212> PRT

<213> 犬附红细胞体唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因的蛋白质氨基酸序列(Unknown)

<400> 4

Val Gly Ser Leu Ile Leu Gly Ile Glu Thr Ser Cys Asp Asp Thr Ser

1 5 10 15

Val Ala Leu Val Arg Asn Gly Lys Leu Ile Asp Val Ile Thr Glu Ser

20 25 30

Ser Ala Ser Leu Gln Asn Ser Trp Gly Gly Val Val Pro Glu Ile Ala

35 40 45

Ala Arg Tyr His Gly Asp Arg Leu Val Pro Ile Leu Gly Ala Leu Leu

50 55 60

Asp Arg Asn His Leu Ser Leu Gly Asp Ile Thr His Ile Ala Tyr Thr

65 70 75 80

Ser His Pro Gly Leu Ala Gly Cys Leu Leu Thr Gly Gln Val Phe Ala

85 90 95

Lys Ser Leu Ala Phe Leu Ile Lys Lys Pro Leu Ile Pro Val Asn His

100 105 110

Val Tyr Gly His Val Phe Ser Val Gly Leu Thr His Ser Leu Asp Phe

115 120 125

Pro His Leu Ala Leu Val Val Ser Gly Lys Thr Thr Ser Leu Phe Leu

130 135 140

Val Asn Gly Tyr Arg Gln Ile Tyr Leu Leu Asp Glu Thr Lys Asp Asn

145 150 155 160

Ala Ile Gly Glu Val Tyr Asp Lys Val Ala Arg Arg Leu Asp Leu Gly

165 170 175

Tyr Pro Gly Gly Met Ala Ile Asp Glu Met Phe Asp Glu Asn Leu Asn

180 185 190

Val Pro Gln Leu Leu Lys Asn Arg Ser Asn Pro Ala Lys Pro Phe Ser

195 200 205

Tyr Ala Gly Ile Leu Ser Ala Thr Met Arg Ile Cys Asp Ser Met Pro

210 215 220

Asp Leu Lys Ala Gln Lys Gly Tyr Val Ala Thr Ile Phe Gln Lys Trp

225 230 235 240

Val Ile Asp Glu Leu Ile Val Lys Ile Lys Tyr Trp Ile Gly Gln Thr

245 250 255

Gly Val Asn Thr Leu Thr Val Ser Gly Gly Val Ala Ala Asn Arg Tyr

260 265 270

Leu Arg Ala Gln Met Lys Ser Leu Asn Ile Arg Ser Leu Leu Val Asp

275 280 285

Gly Ser Tyr Ser Gly Asp Asn Ala Ala Met Ile Ala Tyr Tyr Ala Tyr

290 295 300

Phe Leu Ile

305