阅读说明：本技术 基因重组海参肽rAj-Tspin及其在制备抗肿瘤药物中的应用 (Gene recombinant sea cucumber peptide rAj-Tspin and application thereof in preparation of antitumor drugs ) 是由 周遵春 王继红 于 2019-11-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了基因重组海参肽rAj-Tspin及其在制备抗肿瘤药物中的应用,属于生物技术领域。涉及到rAj-Tspin人工合成cDNA序列的分子克隆、蛋白表达,以及rAj-Tspin通过抑制肿瘤细胞整合素信号通路、诱导肿瘤细胞发生凋亡而强效抑制肿瘤细胞的发生与发展,继而在抗肿瘤药物制备领域中的应用。(The invention discloses a gene recombinant sea cucumber peptide rAj-Tspin and application thereof in preparation of antitumor drugs, belonging to the technical field of biology. Relates to molecular cloning and protein expression of rAj-Tspin artificially synthesized cDNA sequence, and application of rAj-Tspin inhibiting generation and development of tumor cells by inhibiting tumor cell integrin signal path and inducing tumor cells to generate apoptosis, and further in the field of antitumor drug preparation.)

基因重组海参肽rAj-Tspin及其在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及基因重组海参肽rAj-Tspin及其在制备抗肿瘤药物中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

仿刺参(Apostichopus japoicus)属棘皮动物门、海参纲、楯手目、刺参科，是辽宁地区重要的海珍品经济养殖品种。近年来，由于其在民间口碑相传具有预防心血管疾病、抗肿瘤、生血养血、补肾益精、增强免疫力等功效，已成为人们喜爱的保健佳品。然而，关于其活性成分的研究还处于起步阶段。在海参的众多功效中，其抗癌作用引起了我们的关注。

目前，癌症仍是人类健康的第一大杀手，据美国国立卫生院(NIH)统计，2012年，全球新发病例为1410万，癌症相关死亡人数为820万。2012年，57％的新增癌症病例发生在世界欠发达地区，包括中美洲和非洲及亚洲部分地区，65％的癌症死亡也发生在这些地区。仅2018年，癌症新增病例就超过170万人次，到2030年，预计每年新发癌症病例数将增加到2360万。因此，寻找并研发安全强效的靶向抗肿瘤药物已刻不容缓。

目前，抗肿瘤药物分为三大类别，包括：常规化疗药物、激素治疗药物、分子靶向药物。

化疗药物：包括烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、植物类抗癌药。然而化疗药物具有对肿瘤细胞的非特异性杀伤、引起肿瘤细胞的耐药、抗肿瘤疗效提高不明显、对某些种类肿瘤治疗力不从心及毒副反应明显等重大缺陷。通过化疗可以提高生存率的癌症只不过占所有癌症的5％，而对95％的癌症来说化疗都无效；

激素治疗药物：由于某些肿瘤如乳腺瘤、***瘤、甲状腺瘤、***、卵巢癌与相应的激素失调有关，因此可应用某些激素或者其拮抗药来改变激素平衡失调状态，以抑制激素依赖性肿瘤生长。常见的激素药物有：雌雄激素、甲羟孕酮酯、糖皮质激素、他莫昔芬等。激素治疗药物具有诱发皮质功能亢进综合征、糖尿、高血压和动脉硬化、骨质疏松、肌肉萎缩等副作用，对肿瘤抑制效果不明显，只能作为抗肿瘤治疗的辅助治疗药物。

分子靶向药物：根据药物的作用靶点和性质，可将主要分子靶向治疗的药物分为以下几类：(1)小分子表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂，如吉非替尼(Gefitinib，Iressa,易瑞沙)、埃罗替尼(Erlotinib,Tarceva)；(2)抗EGFR的单抗，如西妥昔单抗(Cetuximab,Erbitux)；(3)抗HER-2的单抗，如赫赛汀(Trastuzumab,Herceptin)；(4)Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂，如伊马替尼(Imatinib)；(5)血管内皮生长因子受体抑制剂，如Bevacizumab(Avastin)；(6)抗CD20的单抗，如利妥昔单抗(Rituximab)；(7)IGFR－1激酶抑制剂，如NVP－AEW541；(7)mTOR激酶抑制剂，如CCI－779；(8)泛素－蛋白酶体抑制剂，如Bortezomib；(9)Aurora激酶抑制剂(10)组蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制剂等。

以上三类抗肿瘤药物中，分子靶向药物具有抗肿瘤疗效好、副作用小的优势，是未来抗肿瘤药物市场的发展趋势，其已占全球抗肿瘤药物市场的60％份额。而我国靶向抗肿瘤药物只占抗肿瘤药物市场的20％份额，所以发展靶向抗肿瘤药物具有较大市场提升空间，可以引领未来抗肿瘤市场发展方向。但不容忽视的是，目前分子靶向药物大多数为单抗类药物，具有拮抗肿瘤类型单一、研发代价高、生产成本高、销售价格高的特点，这严重限制了患者的广泛使用。

本科研团队在对仿刺参的cDNA文库的生物信息学分析中首次发现了一种具有能翻译出933个氨基酸的带有TSP-1结构域的金属蛋白酶。凝血酶敏感蛋白-1(thrombospondin-1，TSP-1)是人类凝血酶敏感蛋白家族第一个被确定的成员。TSP-1是一种多功能细胞外基质糖蛋白，可在多种组织中广泛表达。已有研究表明TSP-1可与β1及αv整合素、CD36、CD47等至少12种细胞黏附受体相互作用，这也是其行使多种生物学功能的作用机制。TSP-1不仅能够抑制血管新生及内皮细胞的增殖与迁移，还能够直接参与肿瘤的发生和发展，对肿瘤细胞的增殖、迁移、黏附、侵袭、凋亡及肿瘤免疫等过程都有影响^【1-2】。

仿刺参的cDNA文库中首次发现的这个由933个氨基酸组成的带有TSP-1结构域的金属蛋白酶在蛋白质一级序列上与猪、小鼠及美洲黑熊的TSP-1金属蛋白酶一致性仅为32％，与仓鸮及底鳉的该类蛋白一致性仅为30％。该海参金属蛋白酶具有10个TSP-1结构域，并且每个TSP-1结构域序列都各不相同。为了研究仿刺参TSP-1模体蛋白是否具有类似人类TSP-1蛋白的功能并进行抗肿瘤药物开发，本研究团队创新性地选取了该蛋白的第4个TSP-1结构域序列进行了其cDNA序列的人工合成，并对其进行了基因克隆。该克隆菌所表达的重组肽被命名为rAj-Tspin。rAj-Tspin肽基因人工合成序列168bp长，其肽序列由56个氨基酸组成，分子量为6.15kDa。rAj-Tspin是全新人工合成基因重组肽，研究结果表明其对肿瘤具有强效抑制作用，目前在国内外尚无研究与报道，本发明属首次发现。rAj-Tspin有望应用于抗肿瘤药物制备领域。

参考文献：

[1]Kosfeld MD,Pavlopoulos TV,Frazier WA.Cell attachment activity ofthe carboxyl-terminal domain of human thrombospondin expressed in Escherichiacoli.J Biol Chem 1991；266:24257–9.

[2]J.Lawler,R.O.Hynes,The structure of human thrombospondin anadhesive glycoprotein with multiple calcium-binding sites and homologies withseveral different proteins,J.Cell Biol.103(1986)1635–1648.

发明内容

本发明在对仿刺参的带有TSP1结构域的金属蛋白酶的cDNA序列进行了生物信息学分析后，直接选取了我们认为的最具有抗肿瘤功能潜力的第四个TSP1结构域的56个氨基酸序列组成的小肽(命名为Aj-Tspin)作为研究目标。经设计，人工合成了aj-tspin基因并将其克隆于pET-23b载体，并对其重组肽rAj-Tspin在大肠杆菌中进行了高效诱导表达。rAj-Tspin生物学活性涉及到其凭借自身所具有的类TSP-1模体，通过抑制肿瘤细胞整合素信号通路、诱导肿瘤细胞发生凋亡而强效抑制肿瘤细胞的发生与发展。

本发明提供了一种基因重组海参肽基因，所述基因重组海参肽基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种基因重组海参肽，所述基因重组海参肽的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

本发明还提供了一种含有基因重组海参肽的重组表达菌。

本发明还提供了基因重组海参肽在制备抗肿瘤药物中的应用。

进一步地，上述技术方案中，所述制备抗肿瘤药物为制备整合素信号通路抑制剂类抗肿瘤药物。

本发明涉及海参肽rAj-Tspin的基因克隆、在大肠杆菌中的表达，以及其抗肿瘤的功效。

Aj-tspin基因序列(开放阅读框)168bp长，其肽由56个氨基酸组成，理论分子量为6.15kDa。

rAj-Tspin抗肿瘤生物学活性如下：

通过CCK法检测rAj-Tspin对人肝癌BEL-7402细胞增殖呈剂量依赖性抑制，结果表明rAj-Tspin能够抑制BEL-7402肝癌细胞的增殖，48h和72h抑制作用的IC₅₀值分别为0.89μΜ、0.74μΜ。

通过对BEL-7402细胞进行AO/EB以及Hoechst染色后发现，重组海参肽rAj-Tspin可诱导肝癌BEL-7402细胞发生凋亡，且呈剂量依赖性。

通过对经rAj-Tspin作用后的BEL-7402细胞进行Western Blotting检测，研究结果表明，rAj-Tspin具有能够抑制整合素信号通路中的关键分子integrinβ1的表达及FAK、AKT磷酸化的作用。

以肝癌BEL-7402细胞荷瘤裸鼠为动物模型的体内肿瘤抑制实验结果表明，与模型组比较，低、中、高(60μg·kg^-1、120μg·kg^-1、240μg·kg^-1)剂量rAj-Tspin对瘤重抑制率分别为51.3％(P<0.001)，75.1％(P<0.001)，85.5％(P<0.001)。实验结果证明，重组海参肽rAj-Tspin能够抑制肿瘤的增长，其抑制作用呈剂量依赖性。

有益效果：

本发明的rAj-Tspin克服了现有技术存在的缺陷，其未来作为抗肿瘤药物的优势如下：

1、高效低毒、未来可用于制备靶向广谱抗肿瘤药物：rAj-Tspin为本团队首次发现于海参的整合素信号通路抑制剂类抗肿瘤活性肽，其抗肿瘤剂量为微克级，是一种以整合素为特异靶点的高效靶向抗肿瘤肽。并且，由于整合素在各种类型肿瘤细胞表面高表达而在正常细胞低表达或不表达，所以rAj-Tspin可以广谱拮抗不同类型的肿瘤增殖和转移，具有高效低毒抗肿瘤特点。

2、未来产业化成本低：因rAj-Tspin属基因重组肽且能在原核生物中大量可溶性表达，因此具有工业化成本低廉、产量大、纯度高的特点。

附图说明

图1：rAj-Tspin对人肝癌BEL-7402细胞增殖的抑制作用(其中：n＝3；与对照组比较:*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.)。

图2：rAj-Tspin作用于人肝癌BEL-7402细胞的AO/EB及Hoechs3328染色。

图3：Western Blotting检测rAj-Tspin对人肝癌BEL-7402细胞整合素β1/FAK/Akt信号通路的影响(X±SD,n＝3)；其中：A.整合素β1，FAK及Akt的表达和磷酸化；B-F.分别为p-Akt/Akt，AKT/β-actin，p-FAK/FAK，FAK/β-actin，integrinβ1/β-actin的相对灰度，与空白对照比较:*P<0.5,**P<0.01,***P<0.001。

图4：rAj-Tspin对人BEL-7402肝癌荷瘤裸鼠瘤重的抑制作用(其中：x±s,n＝3；与对照组比较:*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.)。

具体实施方式

下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

1、aj-tspin基因与pET23b载体相连接，转化入大肠杆菌后进行阳性转化子的筛选鉴定。克隆具体操作如下：

(1)目的基因(aj-tspin基因)的获得：通过仿刺参TSP-1蛋白的第4个TSP-1结构域序列，采用人工合成方法进行目的基因DNA的合成(由南京金斯瑞生物技术有限公司完成)。

(2)目的基因DNA片段与载体pET23b的连接：根据目的基因，设计两个引物，由于所设计的引物分别带有Nde I和Hind III酶切位点(见引物序列下划线部分)，而这两个酶切位点也是载体pET23b的多克隆位点，这使得将目的基因DNA片段与载体pET23b的连接成为可能。引物序列为：

P1:5’-XXCATATGGCGCCGGCGCAGTGGGTGAAA-3’

P2:5’-XXAAGCTTCCGACAATCCCCGTTGTTACA-3’

(3)连接产物CaCl₂法转化至克隆菌E.coli BL21中：宿主菌E.coli BL21接种于LB(Amp^-)中培养过夜(12h)，次日将部分菌液移至50mL LB培养液(Amp^-)中于37℃下继续培养至OD₆₀₀达到0.2-0.3之间。培养物置于冰上10min，5000rpm 4℃离心10min。弃上清，倒置离心管1min，加入5mL冰预冷的0.1M CaCl₂溶液致敏并悬浮细胞，冰上10min。5000rpm 4℃离心10min回收细胞，弃上清，每25mL的原培养物再加入2mL冰冷的0.1M CaCl₂溶液，悬浮细胞并置于冰上3h，每份200μL分装细胞。加10μL含40ng重组质粒的DNA溶液至200μL E.coliBL21感受态细胞中温和混匀，于42℃热休克90s后迅速放回冰中，将细胞冷却1～2min后，加入800μL LB(Amp^-)培养基，37℃225rpm摇荡培养细菌45～90min。取100μL转化产物铺于90mm的LB(Amp⁺)琼脂平板上，室温下放置20-30min后，倒置平皿于37℃培养12-16h，待LB(Amp⁺)琼脂平板上长出菌落后即可进行阳性转化子的筛选鉴定。

(4)阳性转化子的筛选鉴定：利用T₇通用引物法进行阳性转化子的筛选鉴定。

用灭菌牙签挑取转化菌单菌落的一部分于10μL双蒸水中煮沸10min作为模板，以T₇通用引物进行PCR扩增。T₇通用引物序列为：

P1：5’-XXAAATTAATACGACTCACTATA-3’

P2：5’-XXGCTAGTTATTGCTCAGCGGTG-3’

PCR反应条件为：94℃预变性2min后，94℃变性45s，55℃复性45s，72℃延伸45s，30个循环；最后72℃延伸6min。

rAj-Tspin的168bp基因片段***pET23b质粒后，T₇通用引物的PCR扩增产物片段长度应该为361bp，而pET23b空质粒因没有外源基因片段的***，其T₇通用引物PCR扩增产物仅有193bp，故可依据T₇通用引物的结果进行阳性重组子的判断。

2、对阳性重组子转化菌于LB(Amp⁺)培养液中进行终浓度为1mmol/L的IPTG诱导表达。诱导表达条件为30℃过夜(12h)诱导。

3、对表达的重组蛋白进行组氨酸亲和层析纯化。

(1)将表达菌的LB培养液于5000g离心10min收获菌体，弃上清，并使残液尽量流出。以每100ml的原培养液(LB(Amp⁺))加4ml 0℃的1X Binding buffer的比例重悬细胞。

(2)将步骤(1)所得样品置于冰上超声裂解细胞，直至溶液不再粘稠。

(3)14000g离心20min以去除细胞碎片，保留上清液。

(4)上清液以0.45μm的滤膜过滤。

(5)吸去His.Bind Column上室的贮液，并打开下面管口；

(6)用10ml的1x Binding Buffer对柱子进行平衡；

(7)将过滤好的上清液上样；

(8)用10ml的1x Binding Buffer洗柱；

(9)用10ml的1x Wash Buffer洗柱；

(10)用5ml的1x Elute Buffer洗脱目的蛋白，收集洗脱液，即为纯化后的目的蛋白(rAj-Tspin)，rAj-Tspin的核苷酸序列如SEQ ID NO.1，氨基酸序列如SEQ ID NO.2。

实施例2 CCK法测定rAj-Tspin对人肝癌BEL-7402细胞增殖的抑制作用

(1)生长至对数生长期的人肝癌BEL-7402细胞(ATCC10000)经胰酶消化离心后，所得细胞用1640细胞培养液稀释混匀，均匀铺于96孔板中(5×10⁴个/孔)，37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养24h。

(2)待细胞大约长至70％满时，向细胞中加入梯度浓度(0.05μM，0.1μM，0.2μM，0.4μM，0.8μM，1.6μM，3.2μM)的重组海参肽rAj-Tspin和1640培养液，其中1640培养液为对照组，细胞培养箱中分别培养24h，48h，72h。

(3)向细胞中加入细胞培养体系10％体积的CCK-8溶液，细胞培养箱中孵育1.5h。

(4)取出96孔板，酶标仪450mm测各孔吸光度值。

(5)计算细胞增殖抑制率。

杀伤率＝(对照孔的均值-试验孔均值)/对照孔均值×100％，3次实验取平均值。

如图1所示，为rAj-Tspin对人肝癌BEL-7402细胞增殖的抑制作用(注：n＝3；与对照组比较:*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。通过CCK法检测rAj-Tspin对人肝癌BEL-7402细胞增殖呈剂量依赖性抑制，结果表明rAj-Tspin能够抑制BEL-7402肝癌细胞的增殖，48h和72h抑制作用的IC₅₀值分别为0.89μΜ、0.74μΜ。

实施例3检测rAj-Tspin对人肝癌BEL-7402细胞整合素β1/FAK/Akt信号通路的影响

(1)SDS-PAGE电泳：根据不同目的蛋白分子量选择配制相应浓度的分离胶，分离胶凝固、灌入已配制的浓缩胶，***梳子凝固后待用。倒入电泳缓冲液后拔出梳子，每孔加入终浓度为0μΜ、0.4μΜ、0.8μΜ、1.6μΜrAj-Tspin处理过的人肝癌BEL-7402细胞裂解液10μL进行电泳，待溴酚蓝至凝胶末端，终止电泳。

(2)转膜：PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜)活化后，按照滤纸-膜-胶-滤纸铺在转膜仪上，恒流转膜。

(3)封闭：将上述PVDF膜置于5％的脱脂奶粉(或BSA)中，37℃封闭2h。

(4)一抗：用TBST缓冲液按一抗抗体说明书所示比例稀释一抗，将PVDF膜浸入稀释抗体溶液中，4℃过夜。

(5)二抗：次日，取出PVDF膜，清洗3次，每次10min，然后将其放入二抗稀释液中，室温孵育2h。

(6)显色及成像：PVDF膜清洗3次，每次10min。ECL显色工作液均匀滴加到洗好的PVDF膜上，静置。应用凝胶成像系统进行拍照，采用Gel-Pro Analyser 4.0软件对蛋白条带进行灰度分析，以内参校正系统误差。

(7)统计方法

实验数据以均数±标准差(X±SD)表示，两组均数比较采用t检验，多组均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)，采用SNK法进行多重比较。所有数据均应用SPSS 22.0软件进行统计学处理，P<0.05表示差异具有显著性。

如图3所示，0.4μM到1.6μM的rAj-Tspin可呈剂量依赖方式抑制BEL-7402细胞的细胞整合素β1/FAK/Akt信号通路，rAj-Tspin可呈剂量依赖方式抑制BEL-7402细胞的FAK及AKT的磷酸化(图3B，图3D)抑制整合素β1的表达，说明rAj-Tspin是通过抑制整合素信号通路而行使抗肿瘤功能的。

实施例4细胞凋亡染色分析

(1)AO/EB染色:处于对数生成期的人肝癌BEL-7402细胞，离心重悬5min后计算细胞数目，保证细胞在6孔板内浓度为1x10⁵(1mL)，之后给予不同浓度的rAj-Tspin(0.4μΜ、0.8μΜ、1.6μM)，37℃，5％CO₂细胞培养箱中孵育48h后，移去培养液并用PBS漂洗3遍，最后一次PBS不倒出，将吖啶橙(AO)和溴乙啶(EB)等体积混合，每孔小心滴加10μL AO/EB混合液于PBS中。使用荧光显微镜观察细胞染色并分析凋亡结果(Ex＝488nm,Em＝515nm)。

(2)Hoechst 3328染色：将人肝癌BEL-7402细胞悬液接种于6孔板中，每孔2mL细胞悬液，37℃CO₂培养箱孵育过夜(12h)，含5％CO₂ 95％空气饱和湿度，保证细胞在6孔板内浓度为1x10⁵(1mL)，之后给予不同浓度的重组海参多肽rAj-Tspin(0.4μΜ、0.8μΜ、1.6μM)，孵育48h后，用PBS洗涤3次，4％多聚甲醛500μL固定10min，每孔加入500μL Hoechst3328 37℃孵育10min，再用PBS洗涤2次。使用倒置荧光显微镜观察细胞染色并分析凋亡结果(Ex＝358nm,Em＝461nm)。

如图2所示，为rAj-Tspin作用于人肝癌BEL-7402细胞的AO/EB及Hoechst3328染色。AO/EB染色结果表明：正常对照组细胞Merge图呈现均匀的淡黄绿色荧光，说明细胞未发生凋亡。而rAj-Tspin作用组Merge图则显示，随着受试药品剂量的增高，细胞核呈现珠串样改变，细胞核致密浓染，发出橙红色荧光，说明细胞发生凋亡且呈剂量依赖性；Hoechst3328染色结果表明，正常细胞对照组细胞核呈暗蓝色均匀荧光，而rAj-Tspin作用组细胞核呈现亮蓝色荧光且光亮度呈剂量依赖性，说明细胞核因发生凋亡而致密浓染。上述结果表明，rAj-Tspin可呈剂量依赖性诱导人肝癌BEL-7402细胞发生凋亡。

实施例5人肝癌BEL-7402细胞荷瘤裸鼠模型的建立及rAj-Tspin对人肝癌BEL-7402细胞移植瘤瘤重影响的测定

(1)BALB/C裸鼠肝癌BEL-7402细胞移植瘤模型的建立：将生长至对数期的BEL-7402人肝癌细胞数达到动物实验要求后(每只裸鼠注射1x106个细胞)，经胰酶消化、离心后，弃去上清，采用无血清的1640细胞培养液将离心后的细胞进行重悬，用血球计数板计算细胞浓度，最终制成5x10⁶个/mL的细胞悬液，将细胞悬液皮下接种于BALB/C裸鼠右侧腋下(每只裸鼠0.2mL)复制肝癌BEL-7402细胞荷瘤裸鼠模型，接种于无特殊病原菌(SPF)环境下进行饲养。

(2)分组及给药：BALB/C裸鼠15只，复制肝癌BEL-7402细胞裸鼠模型后，至肿瘤直径达到5-7mm后随机分为4组：模型组(生理盐水)、rAj-Tspin低剂量组(60μg/kg)、rAj-Tspin中剂量组(120μg/kg)、rAj-Tspin高剂量组(240μg/kg)每组3只裸鼠。裸鼠腹腔注射不同剂量受试药物，每日2次：模型组给予等容量(给药容量0.2mL/10g)生理盐水。连续给药3周之后将裸鼠脱颈处死，剥离出肿瘤组织，测量瘤重，并利用公式计算瘤重抑制率。

抑瘤率＝[(模型组平均瘤重－给药组平均瘤重)/模型组平均瘤重]x100％

如图4所示为rAj-Tspin对人BEL-7402肝癌荷瘤裸鼠瘤重的抑制作用(注：x±s,n＝3；与对照组比较:*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.)。以肝癌BEL-7402细胞荷瘤裸鼠为动物模型的体内肿瘤抑制实验结果表明，与模型组比较，低、中、高(60μg·kg^-1、120μg·kg^-1、240μg·kg^-1)剂量rAj-Tspin对瘤重抑制率分别为51.3％(P<0.001)，75.1％(P<0.001)，85.5％(P<0.001)。实验结果证明，重组海参多肽TSP1蛋白能够抑制肿瘤的增长，其抑制作用呈剂量依赖性。

序列表

<110> 辽宁省海洋水产科学研究院

<120> 基因重组海参肽rAj-Tspin及其在制备抗肿瘤药物中的应用

<130> 2019

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 168

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 1

gcgccggcgc agtgggtgaa aggatcatgg tctgagtgcg atgccgagtg cggagagggt 60

gagcaaactc gtcaagtcga gtgtcagaga ggggatgttt tggctcctgg ggaatgctct 120

ggcgaacggc cgcgacctag tcgacgatgt aacaacgggg attgtcgg 168

<210> 2

<211> 56

<212> PRT

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 2

Ala Pro Ala Gln Trp Val Lys Gly Ser Trp Ser Glu Cys Asp Ala Glu

1 5 10 15

Cys Gly Glu Gly Glu Gln Thr Arg Gln Val Glu Cys Gln Arg Gly Asp

20 25 30

Val Leu Ala Pro Gly Glu Cys Ser Gly Glu Arg Pro Arg Pro Ser Arg

35 40 45

Arg Cys Asn Asn Gly Asp Cys Arg

50 55