阅读说明：本技术 斑马鱼naalad2基因启动子及其应用 (Zebra fish naalad2 gene promoter and application thereof ) 是由 孙晨 刘可春 韩利文 张磊 何秋霞 张云 巴帅康 高燕 于 2019-08-16 设计创作，主要内容包括：本发明涉及斑马鱼naalad2基因启动子及其应用。斑马鱼naalad2基因启动子的表达基因,核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明首次发现了斑马鱼naalad2基因启动子,通过验证该启动子的功能和启动效率发现,斑马鱼naalad2基因启动子的调控方式更加清晰可控,将其用作斑马鱼相关模型的建立较其他来源的启动子具有显著的优势,较其他相关启动子更具有应用前景。(The invention relates to a zebra fish naalad2 gene promoter and application thereof. The nucleotide sequence of the expression gene of the zebra fish naalad2 gene promoter is shown in SEQ ID No. 3. The invention discovers the zebra fish naalad2 gene promoter for the first time, and verifies the function and the starting efficiency of the promoter to discover that the regulation and control mode of the zebra fish naalad2 gene promoter is clearer and more controllable, and the establishment of the zebra fish naalad2 gene promoter has obvious advantages compared with promoters from other sources and has more application prospects compared with other related promoters.)

斑马鱼naalad2基因启动子及其应用

技术领域

本发明涉及斑马鱼naalad2基因启动子及其应用，特别涉及一种来源于斑马鱼的naalad2基因的启动子及利用该启动子构建的***类疾病研究模型，属于生物技术和基因工程技术领域。

背景技术

***癌是危害男性健康最常见的肿瘤之一。近20年来，我国***癌的发病率逐年攀升，2013年我国男性***癌发病率为13.33/10万，年均增长率高达9％～10％，列男性恶性肿瘤发病率的第6位。***癌的发病年龄在55岁前处于较低水平，55岁后逐渐升高，发病率随着年龄的增长而增长，高峰年龄是70～80岁，***癌或将成为威胁老年男性健康的首要疾病。

截至目前为止，该疾病的研究已越来越受到国家和社会的高度重视。对于***癌疾病的研究，具有可操作性，敏感性，可重复性及稳定性的动物模型至关重要。小鼠或大鼠等啮齿类动物是***癌疾病研究中常用的一类动物模型，但是该类动物模型饲养成本较高，且不便于遗传操作。除此之外，利用啮齿类动物研究***癌疾病时，通常需要处死动物后对其脏器进行解剖，然后才能观察到***组织，因此其整个研究周期较长，且成本较高。构建新型的、应用于***癌疾病研究的活体动物模型，现已成为***癌疾病研究领域的迫切需求。

斑马鱼是一种小型热带淡水鱼，作为可以快速获得大数量群体的模式生物，它具有胚胎透明、体外发育、易于遗传操作和突变体筛选等众多优点。2005年，斑马鱼的全基因组测序已成功。在此基础上，英国sanger研究所完成了斑马鱼的参考基因组。比较斑马鱼与人类基因组的异同可发现，斑马鱼与人类基因组具有高达87％的相似性，约70％的人类基因至少有一个明显的斑马鱼同源基因。在信号通路传导、蛋白质功能和生理结构等方面，斑马鱼与人类相比也表现出很高的保守性。斑马鱼现已被美国国家卫生研究院列为继人类和小鼠之后的，第三大模式生物。虽然鱼类中不具备独立的***组织，但是已有研究表明，在鱼类的性腺中，存在类***样的细胞。因此结合转基因技术，构建新型的斑马鱼模型将非常适合于***癌疾病的研究。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供斑马鱼naalad2基因启动子及其应用，利用naalad2基因启动子构建的***类疾病研究模型可以解决上述技术问题。

本发明技术方案如下：

斑马鱼naalad2基因启动子的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

一种***上述斑马鱼naalad2基因启动子的表达基因构建的重组质粒。

一种***上述斑马鱼naalad2基因启动子表达基因或转化上述重组质粒的重组细胞。

上述斑马鱼naalad2基因启动子的表达基因在构建***癌症动物模型中的应用。

根据本发明优选的，所述应用，步骤如下：

(1)以斑马鱼基因组为模板，经PCR扩增，制得斑马鱼naalad2基因启动子的表达基因；

所述PCR扩增的特异引物中，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

(2)将步骤(1)制得的斑马鱼naalad2基因启动子的表达基因***Tol2转座子系统的pT2AL200R150G质粒中，制得重组质粒；

(3)利用限制性内切酶NotI酶切Tol2转座子系统中的转座子辅助质粒pCS-TP，然后以酶切后的转座子辅助质粒pCS-TP为模板，合成转座酶的mRNA；

(4)将步骤(2)制得的重组质粒和步骤(3)制得的转座酶的mRNA经显微注射共同导入AB系斑马鱼胚胎中，利用图像采集工具，对显微注射后的斑马鱼胚胎进行观察，检查绿色荧光蛋白在斑马鱼胚胎中的表达情况，并将体内有荧光信号的斑马鱼胚胎饲养至性成熟，获得F0代斑马鱼；

(5)将F0代斑马鱼与AB系斑马鱼进行杂交，利用图像采集工具对其杂交后代体内的荧光基因进行检测，筛选得到类***组织特异表达荧光的转基因斑马鱼。

根据本发明进一步优选的，所述步骤(1)中，PCR扩增体系如下：

根据本发明进一步优选的，所述步骤(1)中，PCR扩增程序如下：

94℃预变性15s；98℃变性10s，57℃退火10s，72℃延伸30s，30个循环；72℃终延伸5min，然后12℃静置12h。

根据本发明进一步优选的，所述步骤(2)中，斑马鱼naalad2基因启动子的表达基因***Tol2转座子系统的pT2AL200R150G质粒中的具体步骤如下：

将斑马鱼naalad2基因启动子的表达基因经限制性内切酶XhoI和HindIII酶切后，与同样经限制性内切酶XhoI和HindIII酶切的Tol2转座子系统的pT2AL200R150G质粒经连接酶连接。

更优选的，所述限制性内切酶XhoI和HindIII酶切的体系如下：

根据本发明进一步优选的，所述步骤(3)中，限制性内切酶NotI酶切Tol2转座子系统中的转座子辅助质粒pCS-TP的酶切体系如下：

根据本发明进一步优选的，所述步骤(4)中，图像采集工具为荧光显微镜或激光共聚焦显微镜。

根据本发明进一步优选的，所述步骤(4)中，体内荧光信号为绿色点状，且特异地在斑马鱼性腺与肠道组织中表达。

根据本发明进一步优选的，所述步骤(5)中，筛选的标准为选择体内荧光信号为绿色点状，且特异表达于性腺与肠道组织中的斑马鱼。

上述构建的***癌症动物模型在筛选治疗***癌药物中的应用。

有益效果

1、本发明首次发现了斑马鱼naalad2基因启动子，通过验证该启动子的功能和启动效率发现，斑马鱼naalad2基因启动子的调控方式更加清晰可控，将其用作斑马鱼相关模型的建立较其他来源的启动子具有显著的优势，较其他相关启动子更具有应用前景；

2、本发明首次利用斑马鱼naalad2基因启动子构建了转基因斑马鱼模型，其性腺中的类***组织可被绿色荧光特异标记，可实现活体模式生物类***组织的直观化与可视化；此外，本发明构建的转基因斑马鱼模型为***相关疾病的研究及其药物研发提供了新的实验动物，可提高相关实验的准确性和可靠性。

附图说明

图1为在蛋白水平，斑马鱼naalad2基因与人类PSMA基因五种转录本的同源性比对图片，其中星号表示该位置的氨基酸残基完全保守；

图中：A为naalad2与PSMA 201号转录本之间的同源性比对；

B为naalad2与PSMA 202号转录本之间的同源性比对；

C为naalad2与PSMA 203号转录本之间的同源性比对；

D为naalad2与PSMA 208号转录本之间的同源性比对；

E为naalad2与PSMA 212号转录本之间的同源性比对。

图2为雄性斑马鱼naalad2基因在心脏、肝脏、脑、性腺与肠道等五种组织中的表达情况检测结果：

图中：泳道1为DNA Marker；泳道2为naalad2在性腺中的表达情况；泳道3为naalad2在脑中表达情况；泳道4为naalad2在肝脏中的表达情况；泳道5为naalad2在肠道中的表达情况；泳道6为naalad2在心脏中的表达情况；

图3为***pMD-18T载体的***特异启动子体外克隆的图片：

图中：A为携带有***特异启动子体外克隆的pMD-18T载体的图片；其中：泳道1为DNA Marker；泳道2、3、4、6和7为未携带***特异启动子克隆的pMD-18T载体；泳道5为携带有***特异启动子体外克隆的pMD-18T载体；

B为使用两种不同的限制性内切酶对携带有***特异启动子体外克隆的pMD-18T载体进行验证的图片；其中：泳道1为DNA Marker；泳道2为限制性内切酶DraI的酶切验证结果；泳道3为限制性内切酶NdeI的酶切验证结果。

图4为***特异启动子活性检测结果；**表示显微注射后胚胎VS未注射胚胎，p<0.01；^##表示显微注射后48h的胚胎VS显微注射后24h胚胎，p<0.01。

图5为利用Tol2转座子系统构建的F0代基于***特异启动子的转基因斑马鱼的图片；其中白色箭头表示绿色荧光信号；

图中：A为显微注射后1天的斑马鱼图片；

B为显微注射2天的斑马鱼图片；

C为显微注射6天的斑马鱼图片；

D为受精1天的野生AB系斑马鱼图片；

E为受精2天的野生AB系斑马鱼图片；

F为受精6天的野生AB系斑马鱼图片。

图6为F1代转基因斑马鱼图片；其中白色箭头表示在生殖腺中检测到的绿色荧光信号；*表示在脑中检测到的绿色荧光信号；

图中：A为受精1天的F1代转基因斑马鱼图片；

B为受精2天的F1代转基因斑马鱼图片；

C为受精5天的F1代转基因斑马鱼图片；

D为受精1天的野生AB系斑马鱼图片；

E为受精2天的野生AB系斑马鱼图片；

F为受精5天的野生AB系斑马鱼图片。

图7为发育13天的类***特异荧光转基因斑马鱼生殖腺部位图片；

图中：A为未经N-甲基-N-亚硝基脲处理的转基因斑马鱼生殖腺部位图片；

B为N-甲基-N-亚硝基脲处理后的转基因斑马鱼生殖腺部位图片。

图8为N-甲基-N-亚硝基脲处理后，转基因斑马鱼荧光强度的统计柱状图；

图中：**表示处理组VS对照组，p<0.01。

具体实施方式

本发明公开了一种应用于***类疾病研究的新模型的构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的一种应用于***类疾病研究的新模型的构建方法，其中所用原料及试剂均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明的技术方案：

实施例1：类***特异启动子的发现

1)利用人类基因组数据库GRCh38.p12，检索得到PSMA基因的氨基酸序列，随后将其放入斑马鱼参考基因组数据库GRCz11，比对后初步判断在斑马鱼中的同源基因为N-乙酰化的α-连接的酸性二肽酶2基因(N-acetylated alpha-linked acidic dipeptidase 2，naalad2)。为了进一步明确斑马鱼naalad2基因与人类PSMA基因的同源性，利用Clustal多重序列比对软件，将斑马鱼naalad2基因的氨基酸序列与人类PSMA基因的氨基酸序列进行分别比对，结果如图1所示。在蛋白水平，naalad2基因与人类PSMA基因的5种转录本相似性分别为67.53％、67.12％、66.81％、67.19％和66.38％。

2)使用诺唯赞公司的RNA提取试剂盒，分别提取4月龄AB系雄性性成熟斑马鱼肝脏、心脏、脑、生殖腺与肠道等五种组织的RNA，并使用诺唯赞公司的反转录试剂盒首先将基因组DNA去除，反应温度42℃，反应时间2min。随后将其反转录为cDNA。以上述五种cDNA为模板，利用PCR技术，分别检测斑马鱼naalad2基因在组织中的表达情况。结果如图2所示，naalad2在斑马鱼的脑、生殖腺和肠道组织中表达量较高，但是在肝脏与心脏中表达量较低。基因组去除体系如表1所示；反转录体系如表2所示；反转录反应条件如表3所示；PCR引物序列如表4所示；PCR反应体系如表5所示；PCR反应条件如表6所示。

表1、基因组去除体系

表2、反转录体系

表3、反转录反应条件

表4、PCR引物序列

名称	编号	序列
			Naalad2(L)	SEQ ID NO.4	agagaatattaaacatcatctcagg
Naalad2(R)	SEQ ID NO.5	gattagttttatttgggtatgaaag

表5、PCR反应体系

表6、PCR反应条件(30个循环)

3)利用启动子预测软件Promoter 2.0Prediction Serve预测可知，naalad2基因的启动子起始于第一外显子5’端上游-841bp位置，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。利用EPD Eukaryotic promoter database数据库对上述启动子定位进行二次分析，最终将其定位于第一外显子5’端上游-462bp位置，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4)使用天根公司的动物基因组提取试剂盒，提取4月龄AB系雄性性成熟斑马鱼基因组。以上述基因组为模板，利用PCR技术，体外扩增内含预测启动子的核苷酸序列。随后利用T4连接酶，将体外扩增产物***pMD-18T载体中，并使用两种不同的限制性内切酶DraI与NdeI，分别对上述改造后的pMD-18T载体进行酶切验证，结果如图3所示。PCR引物序列如表7所示；PCR反应体系如表8所示；PCR反应条件如表9所示。

表7、PCR引物序列

名称	编号	序列
			Promoter(L)	SEQ ID NO.6	ACGGACGGCTAAAACAGAGT
Promoter(R)	SEQ ID NO.7	ACGAATACAGGTGCGGAGA

表8、PCR反应体系

表9、PCR反应条件(30个循环)

实施例2：类***特异启动子的活性检测

使用限制性内切酶SacI和HindIII，将启动子序列从改造后的pMD-18T载体中剪切下来，并使用T4连接酶将其***pGL3-Basic载体中。通过显微注射技术，将连接有启动子的pGL3-Basic载体通导入AB系斑马鱼胚胎中。显微注射后24与48h后，分别使用萤火虫素酶报告基因检测试剂盒，检测斑马鱼体内的萤火虫素酶含量，结果如图4所示。注射24h或48h后，与未注射组胚胎相比较，启动子注射组均检测到萤火虫素酶的阳性信号，且与未注射的对照组相比较，上述萤火虫素酶活性均具有统计学差异。除此之外，将注射后24h与48h的斑马鱼体内萤火虫素酶活性进行比较后还发现，注射48h的斑马鱼，其体内萤火虫素酶活性明显高于注射24h的斑马鱼。上述结果说明，类***特异启动子在斑马鱼体内具有启动基因表达的活性，且其启动活性随着斑马鱼发育时间的延长而增高。

上述检测证明，斑马鱼naalad2基因与人类PSMA基因表达特性具有显著差异，斑马鱼naalad2基因在斑马鱼的脑、生殖腺和肠道组织中表达量较高，但是在肝脏与心脏中表达量较低，而人类PSMA基因主要在成人的***、性腺和肝脏等脏器表达，且人类在胎儿时期，PSMA基因并不表达，这决定了naalad2基因启动子的调控方式更加清晰可控，将其用作相关模型的建立，较其他相关启动子更具有应用前景。

由于本申请的启动子是源自斑马鱼，因此该启动子可应用于斑马鱼模型的构建。与之相对应的，目前已知的其它***特异启动子均来源自人类或啮齿类动物，如小鼠和大鼠等。因此它们只能应用与细胞、小鼠或大鼠等模型的构建，而无法应用于斑马鱼当中。斑马鱼是介于细胞与啮齿类动物之间的一种新型脊椎动物模式生物，它兼具细胞和啮齿类动物的双重优势。在生物医药研究领域，斑马鱼模型既具有细胞模型的快速、简便与高通量等优势，又具有啮齿类动物的可靠、全面与高内涵等优势。因此在动物模型构建领域，与其它***特异启动子相比，本申请所述的启动子将具有更大的实用价值。除此之外，在生物医药研究领域，本申请所述的启动子也将具有更大的应用前景。

实施例3：类***特异启动子的应用

使用限制性内切酶XhoI和HindIII，将启动子序列从改造后的pMD-18T载体中剪切下来，并使用T4连接酶将其***Tol2转座子系统的pT2AL200R150G质粒中。利用Tol2转座子系统，结合显微注射技术，将转座酶mRNA与***启动子的pT2AL200R150G质粒共同导入AB系斑马鱼胚胎中。显微注射1、2和6天后，分别在荧光显微镜下，检测绿色荧光蛋白在斑马鱼胚胎中的表达情况，结果如图5所示。显微注射1、2和6天后，均可在注射斑马鱼体内检测到荧光信号。

将体内有荧光信号的斑马鱼胚胎饲养至性成熟，并将其与AB系斑马鱼进行杂交。当杂交后代发育至第1、2和5天时，分别在荧光显微镜下检测其体内的荧光表达情况，结果如图6所示。当杂交后代发育至1、2和5天时，均可在其体内检测到绿色荧光信号。

实施例4：类***特异荧光转基因斑马鱼的应用

1.转基因斑马鱼的获取

将健康性成熟的类***特异荧光转基因斑马鱼按雌雄1：2的比例，放入交配缸内，中间放置隔板，置于黑暗环境中，次日亮灯前抽去隔板，光照刺激使其***。收集受精卵，并用新的斑马鱼胚胎培养水冲洗3遍，对受精卵进行消毒和清洗；随后将受精卵移入干净的斑马鱼培养用水中，并向所述培养水中加入0.2ppm亚甲基蓝，28℃、14h光照/10h黑暗周期下控光培养，中间每24h换约1/3水，并及时吸出死亡胚胎。

2.化合物处理

选取发育至第13天的健康荧光转基因斑马鱼，放入6孔板中，每孔10尾。设置1个空白对照组，1个N-甲基-N-亚硝基脲处理组(6ml培养水中加入终浓度为10μM/mL的N-甲基-N-亚硝基脲溶液)。将上述两组斑马鱼分别放入28℃恒温培养箱中，连续培养2小时。

3.实验结果采集与数据分析

化合物处理结束后，利用质量浓度为0.02％的三卡因溶液将上述两组斑马鱼麻醉。在荧光显微镜下采集斑马鱼生殖腺部位的绿色荧光照片，结果如图7所示。根据采集图片，利用Image-Pro Plus软件，计算转基因斑马鱼的荧光强度，并使用GraphPad prism5.0软件对上述两组斑马鱼的荧光强度进行统计，结果如图8所示。

N-甲基-N-亚硝基脲为一常用的***癌化学诱变剂，可用于构建人类***癌的动物模型。当10μM/mL的N-甲基-N-亚硝基脲连续处理类***特异荧光转基因斑马鱼2h后，其荧光强度明显增强。上述结果提示了，斑马鱼naalad2基因的启动子与人类PSMA基因的启动子在功能上具有相似性，它们均在***癌组织中有较高表达，可作为***癌症的潜在诊断指标。以naalad2基因的启动子为基础，构建的荧光转基因斑马鱼，可应用于***癌症动物模型构建及***癌疾病的研究当中。

序列表

<110> 山东省科学院生物研究所

<120> 斑马鱼naalad2基因启动子及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 961

<212> DNA

<213> 斑马鱼(Barchydanio rerio var)

<400> 1

gaccagcctg gttttagagg ttttttggcc acttccaggc tggtttccag tcatttccag 60

cctggtctta gctggtttgg ctggaaagtg acctgctaaa accagcttga ccagcctggt 120

ttaagctgga catagctggt tttggctggg gtcccagcct ggctaggttg gtcaagctgg 180

ttttagctgg tcatttctca gcttgtacag ctaaaaccag gctggaaatg gctggaaacc 240

agcctggaag tggccaaaac ccctctaaaa ccagcctggt caaccagcta aaaccagcca 300

accatcctag gctggtttaa gctggatttt tcagcaggaa atcttcctgt tttaaagaga 360

tggcagggaa aaatggaatt taatgcagtg cttcttgtct gagactcact ttatattaaa 420

tatctattag gcattgaaga tcacttattt ttaaaataaa cagatcttaa acgtggcaat 480

tttggaaaga cagttcacag gaagccgttg tgctggctga aaattaaaag tctgtttgca 540

tataccccat tagtaagttc ccatcctcaa aggataggtc aggttttttt tactcattag 600

aaaaacaaat catcattatg ttcttcttct gttaatttaa aaggtcattt tcagcagcaa 660

ccaacagcca aatatttatc tcacttcata aacctgtgaa atttctgcac ggcgacatct 720

atgaacgaac ccttttacgc tcgctaaatc aagtgaattg gtgaatcatg ttcactcaaa 780

cgaaccgatt cgctgaaatg aactaaccca aaccaaaaca cgcctacatc actctccccc 840

cacagacagt attagctctc caactttcaa cgagttatga gcggcgttta gtcaaatggg 900

ttctgaggat aaaataatcc gctggatctg ccggctaaca gccattacag ctttcttctt 960

g 961

<210> 2

<211> 582

<212> DNA

<213> 斑马鱼(Barchydanio rerio var)

<400> 2

ttaatgcagt gcttcttgtc tgagactcac tttatattaa atatctatta ggcattgaag 60

atcacttatt tttaaaataa acagatctta aacgtggcaa ttttggaaag acagttcaca 120

ggaagccgtt gtgctggctg aaaattaaaa gtctgtttgc atatacccca ttagtaagtt 180

cccatcctca aaggataggt caggtttttt ttactcatta gaaaaacaaa tcatcattat 240

gttcttcttc tgttaattta aaaggtcatt ttcagcagca accaacagcc aaatatttat 300

ctcacttcat aaacctgtga aatttctgca cggcgacatc tatgaacgaa cccttttacg 360

ctcgctaaat caagtgaatt ggtgaatcat gttcactcaa acgaaccgat tcgctgaaat 420

gaactaaccc aaaccaaaac acgcctacat cactctcccc ccacagacag tattagctct 480

ccaactttca acgagttatg agcggcgttt agtcaaatgg gttctgagga taaaataatc 540

cgctggatct gccggctaac agccattaca gctttcttct tg 582

<210> 3

<211> 2471

<212> DNA

<213> 斑马鱼(Barchydanio rerio var)

<400> 3

acggacggct aaaacagagt cggtttgcac acaattacaa cattagttta atataacatt 60

attagtgatt ttatttcacc caaaatgttc atttgaatta atacttcatt aaaaatcaag 120

ccgcgtttat ccgtataaat tacgagcgtt caaacactga actattgact cctattcgcc 180

aaagactcgt tcatctgaat catttaatgt tgacgattca attgaaccaa aacacggcgt 240

ttttggacat ttaaaagaac aaccgtgttc atatggaata atatagctta attaataaag 300

cctagaacaa tgtaatctaa gaagagagag aaatattcaa aataaaactt tgttttgaga 360

taatatgtgt ttgtatttta tatatatgta tatgttatag gctatacaca tagacacaca 420

cacaaaactc cttcatttat tcattttcct tcagtttagt ccctttattc atcaggggtt 480

gccacggcag aatgaaccgc cgacttatcc aacatatgtt tcatgcagcg gatgccattc 540

cagcagcaac ccaacactgg gaaacaccca tacacactca ttcacactca taaactacgg 600

acaatttaga ttattcaatt tacctatagc gcatgtgttt ggactgtggg ggaaaccgga 660

gtcacccgga ggaaactcca gctaccttct tgcagcaacc atcttgctgt gctacccact 720

gcgccaccgt gatgccaata aatgtacaca cacacacaca cgcacacaca cacacacaca 780

cgcacacaca cacacacacg cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 840

cacatatata tataaataaa taatttttgg cagcactaaa ttaaacttca ctcaaaaata 900

attttaaaaa ggtgtcatta ttaactctcc ctttaactct gtttcaaacc tgtatgagtt 960

tcattctatt aaaaacaaaa taagctattt tgactaaatt aattgttaca agtttccaac 1020

atttttcaaa atatcttctt ttgtgttcaa cagaaaataa ggaaattgtg acttggggtg 1080

agtaaatatg aagtattgtt tttatttatt atttattgtt tgttttattt ggggtgaact 1140

atccctttta gagttaacat atctactaaa aatacctgct gtgtttctca gtaaatggta 1200

aacttactgt gaaagatttc tgtgactatt taaagtttta taaatttaat tttacagcat 1260

cgacatcata atgtaattaa aatacaacca gttaaataaa cttaagcatt catttagttg 1320

ttcaagcgta aaacgacatg atagactgtg taaccgctag cgccattcgg tagcaaggta 1380

gcccagaaac tccaatactg aggtaaaata accctgctga aaaatccagc ttaaaccagc 1440

cttagatggt tggctggttt tagctggtcg accagcctgg ttttagaggt tttttggcca 1500

cttccaggct ggtttccagt catttccagc ctggtcttag ctggtttggc tggaaagtga 1560

cctgctaaaa ccagcttgac cagcctggtt taagctggac atagctggtt ttggctgggg 1620

tcccagcctg gctaggttgg tcaagctggt tttagctggt catttctcag cttgtacagc 1680

taaaaccagg ctggaaatgg ctggaaacca gcctggaagt ggccaaaacc cctctaaaac 1740

cagcctggtc aaccagctaa aaccagccaa ccatcctagg ctggtttaag ctggattttt 1800

cagcaggaaa tcttcctgtt ttaaagagat ggcagggaaa aatggaattt aatgcagtgc 1860

ttcttgtctg agactcactt tatattaaat atctattagg cattgaagat cacttatttt 1920

taaaataaac agatcttaaa cgtggcaatt ttggaaagac agttcacagg aagccgttgt 1980

gctggctgaa aattaaaagt ctgtttgcat ataccccatt agtaagttcc catcctcaaa 2040

ggataggtca ggtttttttt actcattaga aaaacaaatc atcattatgt tcttcttctg 2100

ttaatttaaa aggtcatttt cagcagcaac caacagccaa atatttatct cacttcataa 2160

acctgtgaaa tttctgcacg gcgacatcta tgaacgaacc cttttacgct cgctaaatca 2220

agtgaattgg tgaatcatgt tcactcaaac gaaccgattc gctgaaatga actaacccaa 2280

accaaaacac gcctacatca ctctcccccc acagacagta ttaagctctc caactttcaa 2340

cgagttatga gcggcgttta gtcaaatggg ttctgaggat aaaataatcc gctggatctg 2400

ccggctaaca gccattacag ctttcttctt gatcggcttt attattggtg agtctccgca 2460

cctgtattcg t 2471

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 4

agagaatatt aaacatcatc tcagg 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 5

gattagtttt atttgggtat gaaag 25

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 6

acggacggct aaaacagagt 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 7

acgaatacag gtgcggaga 19