阅读说明：本技术 草莓液泡加工酶编码基因FaVPE3及其应用 (Strawberry vacuolar processing enzyme encoding gene FaVPE3 and its application ) 是由 段可 吕文远 刘海婷 杨静 高清华 邹小花 田书华 于 2019-09-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种草莓液泡加工酶编码基因FaVPE3及其应用；提供了该基因的核酸序列及蛋白序列；还构建了FaVPE3基因的RNA干扰表达载体；通过将干扰表达载体转入农杆菌,并用微注射方法感染草莓大绿果,建立了FaVPE3基因表达下调的转基因草莓株系。该基因对草莓果实蔗糖、果糖、葡萄糖和柠檬酸以及苹果酸等代谢产物的积累起着关键的调控作用。本发明为草莓果实糖酸品质调控机制奠定基础,为通过基因工程手段调控草莓果实糖酸积累提供基因资源,对于功能性SNP分子标记的开发和优质草莓的培育提供重要技术手段。(The invention discloses a kind of strawberry vacuolar processing enzyme encoding gene FaVPE3 and its applications；Provide the nucleic acid sequence and protein sequence of the gene；Also construct the rnai expression carrier of FaVPE3 gene；By the way that interference expression vector is transferred to Agrobacterium, and strawberry fruit green greatly is infected with microinjection method, establishes the Transgenic Strawberry strain of FaVPE3 down regulation of gene expression.The accumulation of the gene pairs strawberry fruit sucrose, fructose, glucose and the metabolites such as citric acid and malic acid plays crucial regulating and controlling effect.The present invention is that strawberry fruit saccharic acid quality regulatory mechanism lays the foundation, and provides genetic resources to regulate and control the accumulation of strawberry fruit saccharic acid by genetic engineering means, the cultivation of exploitation and high-quality strawberry for functional SNP marker provides important technical.)

草莓液泡加工酶编码基因FaVPE3及其应用

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体地涉及到一种草莓果实糖酸调控基因FaVPE3及其在果实糖酸品质调控中的应用。

背景技术

草莓(Fragaria×ananassa Duchase)属蔷薇科草莓属植物，其果实发育中糖酸的积累和调控对于果实发育和品质形成至关重要。果实的风味很大程度上取决于糖酸的含量和比值，一般地，高糖高酸的果实口感最丰富、风味美好，高糖低酸的果实口感纯甜、风味感觉过于温和单薄，低糖高酸的果实口感很酸少有人能接受，至于低糖低酸的果实则淡而无味。草莓果实糖分组成主要以蔗糖、葡萄糖和果糖为主，但因品种而异，多数品种以积累蔗糖为主,也有果实以积累果糖或葡萄糖为主的品种。另外，草莓果实中的有机酸含量对品质的影响也十分重要，栽培草莓果实有机酸主要为柠檬酸和苹果酸。多数草莓资源果实中柠檬酸含量占总酸90％以上。

RNA干扰(RNAi,RNA interference)是一种重要的基因功能研究方法，原理是生物细胞内核酸酶可以将外源或内源的双链RNA(dsRNA)特异降解为21-25bp的小干扰RNA(small interference RNA),siRNA与细胞内同源的靶RNA互补结合，特异降解内源靶RNA,引起基因转录产物积累水平下降。在大绿果期，将带有目的基因片段的载体通过农杆菌介导法注入到草莓果实一侧，在另一侧注入空载体(农杆菌)，通过降低基因在草莓果实一侧的表达，可以对比验证基因的功能。

新型分子标记中的功能性分子标记是以功能性单核苷酸多态性位点(SNP)为基础开发而成，其优势在于可以在多种不同遗传背景下直接应用，能更有效准确地筛选和追踪已知基因，发掘鉴定农艺性状相关基因的功能。

草莓果实风味(主要由糖酸水平决定)调控分子机制的研究相对较少，糖酸积累过程中涉及到诸多基因的表达、调控，各种基因的遗传调控特异性有待于验证。目前还没有关于草莓液泡加工酶编码基因参与果实品质调节的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种草莓液泡加工酶编码基因FaVPE3及其应用；具体提供了该基因的核酸序列以及蛋白序列，同时，还涉及到该基因在草莓果实糖酸品质调控中的用途。

为实现本发明的目的，本发明采取的技术方案如下：

第一方面，本发明涉及一种草莓液泡加工酶编码基因FaVPE3，其核苷酸序列包括如SEQ ID No.1所示的序列。

第二方面，本发明涉及一种前述的草莓液泡加工酶编码基因FaVPE3编码的蛋白，其氨基酸序列包括如SEQ ID No.2所示的序列。

第三方面，本发明涉及一种前述的草莓液泡加工酶编码基因FaVPE3在基因工程调控果实糖酸品质中的用途。

作为本发明的一个实施方案，所述调控果实糖酸品质包括提高果实中蔗糖、果糖、葡萄糖、柠檬酸和苹果酸含量。

作为本发明的一个实施方案，所述用途具体是：构建所述草莓液泡加工酶编码基因FaVPE3的RNA干扰表达载体，将所述RNA干扰表达载体转入农杆菌，用微注射法感染草莓大绿果，建立基因FaVPE3表达下调的转基因草莓株系。该基因表达下降不但可以导致草莓果实中蔗糖、果糖和葡萄糖含量上升，同时，还提高草莓果实中的柠檬酸和苹果酸含量。

作为本发明的一个实施方案，构建所述草莓液泡加工酶编码基因FaVPE3的RNA干扰表达载体包括如下步骤：

S1、以八倍体“红颜”草莓果实cDNAs为模版，利用序列如SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4所示的引物对，通过PCR扩增获得FaVPE3基因全序列；

S2、以所述FaVPE3基因全序列为模板，利用序列如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示的引物对，PCR扩增获得FaVPE3基因特异片段；

S3、纯化回收所述FaVPE3基因特异片段后经BP重组反应克隆pDONR221载体上，转化大肠杆菌感受态，获得含FaVPE3基因特异片段的pDONR221载体质粒；

S4、将所述含FaVPE3基因特异片段的pDONR221载体质粒通过LR重组反应***干扰表达载体pK7GWIWG2D(II)中，转化大肠杆菌感受态，获得所述草莓液泡加工酶编码基因FaVPE3的RNA干扰表达载体。

步骤S1中，所述FaVPE3基因全序列的序列如SEQ ID No.1所示。

步骤S1中，还包括将获得的FaVPE3基因全序列经BP反应重组到pDONR221载体上，转化到大肠杆菌感受态；经菌落PCR、质粒PCR及质粒酶切鉴定后均得到符合预期大小的目标条带后，送测序的步骤。

步骤S2中，所述FaVPE3基因特异片段为265bp。

步骤S2中，所述FaVPE3基因特异片段的序列如SEQ ID No.11所示。

步骤S4中，转化大肠杆菌感受态后还包括如下步骤：挑取单克隆经菌液PCR、质粒PCR与质粒酶切鉴定后，挑选阳性克隆测序；将测序鉴定FaVPE3干扰表达载体构建成功的质粒采用冻融法转入根癌农杆菌感受态细胞，挑取单克隆进行菌液PCR鉴定，保存阳性克隆，即所述草莓液泡加工酶编码基因FaVPE3的RNA干扰表达载体。

第四方面，本发明还涉及一种FaVPE3基因表达下调的转基因草莓株系，通过构建前述的草莓液泡加工酶编码基因FaVPE3的RNA干扰表达载体；将所述RNA干扰表达载体转入农杆菌，用微注射法感染草莓大绿果而得。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)本发明利用RT-PCR(反转录PCR)和RNA干扰技术敲低基因表达，从八倍体‘红颜’草莓果实中克隆并鉴定了一种新的果实糖酸调控基因FaVPE3，该基因编码高等植物中天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶——液泡加工酶(VPE)；该基因表达下降不但可以导致草莓果实中蔗糖、果糖和葡萄糖含量上升，同时，还提高草莓果实中的柠檬酸和苹果酸含量；

2)本发明为草莓果实糖酸品质调控机制奠定基础，为通过基因工程手段调控草莓果实糖酸代谢和积累提供基因资源，对于功能性SNP分子标记的开发和优质草莓的培育提供重要途径。

附图说明

图1为本发明实施例1中pK7GWIWG2D(II)-FaVPE3-RNAi载体图谱；该载体中，在EGFP表达盒下游是RNA干扰表达盒，首先是35S启动子，其下游是Gateway重组区域，包括FaVPE3基因5‘端特异区域265bp片段分别以正向和反向方式***在内含氯霉素抗性基因的intron两端，该表达盒末端是T35S终止子；

图2为本发明实施例3中农杆菌注射实验前果实照片(a)和农杆菌注射果实成熟照片(b)；b图左侧是对照，为不含目标基因***的空载体转化(CK)后果实表型，右侧是FaVPE3干扰表达转化成熟后的果实形态；

图3为本发明实施例3中FaVPE3基因干扰表达下调的qRT-PCR鉴定结果；RNAi为草莓蔗液泡加工酶蛋白基因FaVPE3在红颜草莓中RNA干扰一侧果实中的结果，CK为对照注入空载体的一侧草莓果实中的结果；纵坐标为real-time PCR检测该基因在实验组干扰表达果实侧相对对照组空载体一侧果实中的表达量；qPCR内参基因是GAPDH1(gene18492)，line5/6/10为三个不同的实验果实(独立株系)；

图4为本发明实施例4中FaVPE3干扰表达下调后果实中与对照果实中可溶性糖含量；纵坐标显示通过高效液相色谱技术所测定的草莓果实中三种糖及总糖的含量；

图5为本发明实施例4中FaVPE3干扰表达下调后果实中与对照果实中主要有机酸柠檬酸和苹果酸及总酸的含量；纵坐标显示通过高效液相色谱技术所测定的草莓果实中有机酸的含量；

图6为pDONR221-VPE3-RNAi测序验证图谱；采用M13反向通用引物测序，VPE3-RNAi目标片段265bp,在测序文件的109-373bp区间；

图7为pK7GWIWG2D(II)-FaVPE3-RNAi载体鉴定PCR和酶切的电泳图：lane1-10为PCR鉴定，其中1-5泳道是平行构建另一个质粒的鉴定，6-10为pK7GWIWG2D(II)-RNAi-VPE3的鉴定:L6引物组为SEQ ID No.5-6；L7-8引物组为SEQ ID No.6+35S-end-F(载体通用：attacaatttactattctagtcg)；L9-10引物组为SEQ ID No.6+35S-Terminator(载体通用：ttttgcggactctagcatggccg)；L7、9以水为模板,L6、8、10以所构质粒为模板；泳道L11-15为酶切鉴定:L11是KpnI+SacI双切原始质粒pK7GWIWG2D(II)(切下条带为4783bp)，L12(KpnI)和L13(SacI)分别是原始质粒单切，L14是平行构建另一个质粒的KpnI+SacI双切；L15是pK7GWIWG2D(II)-FaVPE3-RNAi的KpnI+SacI双切(切下条带为3805bp).Marker是DL2000。

具体实施方式

本发明提供了一种调节草莓果实糖酸品质相关的FaVPE3基因及其应用。

本发明的基因FaVPE3来源于草莓(Fragaria×ananassa Duchase)，该基因的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.1

ATGACTCGCTTGGCCGCCGTCGTCGCCGTCGTCCTTTTCTTCCTTGTCTCCCTCTCTTCTTCATCCACCAGCGCCCGCGACCTCCCCGGAGACGTCTTACGCTTGCCGTCGGAGACTTCGAGGTTCTTCCGCGCCGGCGATGATCAGCAAGAGGACGGCACCGTCGGCACGCGGTGGGCCGTTTTGATCGCCGGCTCCAATGGATACTGGAATTACCGGCATCAGGCGGATATATGCCATGCGTATCAGTTATTGAAGAAAGGAGGACTGAAAGATGAGAATATTGTTGTGTTCATGTATGATGATATTGCTTACAACGAAGAGAACCCTAGGCAAGGAGTCATCATCAACAGTCCTCATGGTGATGATGTTTATAAGGGAGTCCCCAAGGATTACACTGGGGAAGATGTTACTGTTGGTAACTTCTTTGCCGCTATCCTTGGAAACAAAACTGCTATCTCCGGGGGTAGCGGGAAAGTTGTGGACAGCGGTCCGAATGATCATATCTTCATATACTATTCCGATCATGGCGGTCCTGGAGTACTCGGGATGCCTACCAGTCCTTATATTTATGCCGACCGCCTCATAGAAGTCTTAAAGAAGAAGCATGCAGCAGGGACATATAAAAGCTTGGTATTTTATCTTGAAGCTTGTGAATCCGGAAGTATCTTTGAGGGTCTTCTTCCTGAAGGTTTGAATATCTTTGCAACTACAGCGTCAAATGCTGAAGAGAGCAGTTGGGGGACTTACTGCCCGGGAGAGTATCCTAGTCCTCCCCCAGAATATGAAACCTGTTTGGGTGACTTGTATAGTGTTGCTTGGATGGAAGATAGTGACATTCACAACTTGAGGTCAGAAACTTTGCACCAGCAGTATGAACTGGTCAAATCAAGGACTGCAAGTGATAATTCTCCTTATGGTTCTCATGTCATGCAATATGGTGATATACCTCTTAGCAAGAACAACCTATTTGTGTATATGGGCACAAACCCTGCAAATGATAACTACACCTTCATCCCTCAGAACTTCTTGAGGCCATCTTCTTCAAAAGCTGTCAACCAGAGGGATGCTGATCTTGTACATTTTTGGCATAAGTACCGCAAGGCCCCTGAAGGCTCAGCAAGAAAAGCTCAAGCTCAAAAAGAATTTCTTGAAGCAATGTCTCACAGAATGCATATAGATGAAAGCGTGAAACTTATCGGTAAACTCTTGTTTGGAATCAAAAAAGGTCCAGAAGTCCTCAGCGCTGTACGACCTGCTGGGCAGCCACTTGTTGATGACTGGGACCGCCTTAAGACAATGGCGAGGAGTTTTGAGACATATTGCGGATCACTTTCTCAGTATGGGATGAAACACATGCGGTCCCTGGCAAACATCTGCAATGCTGGAATGACAAAGGAGCAGATGGCTGAGGCTTCAGCACAAGCCTGTGTCAATGTTCCTTCTGGCCAATGGAGCTCTCTGCACAGGGGATTCAGTGCTTAG

该基因所编码蛋白的氨基酸序列如下：SEQ ID No.2

MTRLAAVVAVVLFFLVSLSSSSTSARDLPGDVLRLPSETSRFFRAGDDQQEDGTVGTRWAVLIAGSNGYWNYRHQADICHAYQLLKKGGLKDENIVVFMYDDIAYNEENPRQGVIINSPHGDDVYKGVPKDYTGEDVTVGNFFAAILGNKTAISGGSGKVVDSGPNDHIFIYYSDHGGPGVLGMPTSPYIYADRLIEVLKKKHAAGTYKSLVFYLEACESGSIFEGLLPEGLNIFATTASNAEESSWGTYCPGEYPSPPPEYETCLGDLYSVAWMEDSDIHNLRSETLHQQYELVKSRTASDNSPYGSHVMQYGDIPLSKNNLFVYMGTNPANDNYTFIPQNFLRPSSSKAVNQRDADLVHFWHKYRKAPEGSARKAQAQKEFLEAMSHRMHIDESVKLIGKLLFGIKKGPEVLSAVRPAGQPLVDDWDRLKTMARSFETYCGSLSQYGMKHMRSLANICNAGMTKEQMAEASAQACVNVPSGQWSSLHRGFSA

根据前述的应用，其是将克隆所得草莓液泡加工酶基因FaVPE3基因片段通过重组酶连接到pK7GWIWG2D(II)载体上，通过微注射法转化草莓，鉴定转基因草莓。

具体的，前述的应用包括以下步骤：

以八倍体“红颜”草莓果实cDNAs为模版，利用引物(GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGACTCGCTTGGCCGCCGTCGTSEQ ID No.3和GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCAGCA CTGAATCCCCTGTGCAGAGSEQ ID No.4，不含终止密码，且下划线是基因特异序列，其前面无下划线是接头序列)，通过高保真酶PCR扩增获得FaVPE3基因全序列及经BP反应重组到pDONR221载体上，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中过夜培养。经菌落PCR、质粒PCR及质粒酶切鉴定后均得到符合预期大小的目标条带后，送测序。

FaVPE3 RNA干扰表达载体构建：从测序的全长克隆上扩增265bp片段，FaVPE3基因特异区域265bp(GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGGAGACGTCTTACGCTTGC SEQ ID No.5和GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTGTTGATGATGACTCCTTG SEQ ID No.6)(单下划线为基因特异引物区，双下划线及前无下划线为克隆到入门载体pDONR221需要的接头序列)纯化回收FaVPE3片段后,通过LR重组反应***RNA干扰表达载体pK7GWIWG2D(II)，转化大肠杆菌感受态。挑取单克隆经菌液PCR、质粒PCR与质粒酶切鉴定后，挑选阳性克隆测序。将测序鉴定FaVPE3干扰表达载体构建成功的质粒采用冻融法转入根癌农杆菌GV3101感受态细胞，2d后挑取单克隆进行菌液PCR鉴定，保存阳性克隆用于草莓果实侵染。

上述265bp片段FaVPE3基因特异片段的序列如下：

GGAGACGTCTTACGCTTGCCGTCGGAGACTTCGAGGTTCTTCCGCGCCGGCGATGATCAGCAAGAGGACGGCACCGTCGGCACGCGGTGGGCCGTTTTGATCGCCGGCTCCAATGGATACTGGAATTACCGGCATCAGGCGGATATATGCCATGCGTATCAGTTATTGAAGAAAGGAGGACTGAAAGATGAGAATATTGTTGTGTTCATGTATGATGATATTGCTTACAACGAAGAGAACCCTAGGCAAGGAGTCATCATCAACA SEQ ID No.11。

采用农杆菌微注射法处理草莓大绿果，通过高效液相色谱技术(Highperformance liquid chromatography，HPLC)对成熟草莓果实中的蔗糖、果糖、葡萄糖以及柠檬酸和苹果酸含量进行测定。转录水平鉴定RNA干扰效果，使用引物GCTCAAGCTCAAAAAGAASEQ ID No.7&CATCCCATACTGAGAAAGTG SEQ ID No.8＝222bp。

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1、FaVPE3基因干扰RNAi载体的构建

本发明的基因FaVPE3来源于草莓(Fragaria×ananassa Duchase)，利用Gateway同源重组克隆技术克隆FaVPE3全长基因和FaVPE3特异序列5’265bp片段。

根据GDR数据库中森林草莓中液泡加工酶类基因全长基因信息(www.rosaceae.org)，设计全长引物并添加BP重组反应需要的接头序列在5‘端，如SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4所示。以八倍体‘红颜’草莓cDNAs为模板采用高保真酶(PrimeSTAR MaxDNA Polymerase)进行PCR扩增，将得到符合预期目标大小的FaVPE3全长片段纯化后经BP重组酶([email protected] Clonase^TM II Enzyme Mix)克隆到pDONR221载体上，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中过夜培养。经菌落PCR、质粒PCR及质粒酶切鉴定后均得到符合预期大小的目标条带后，送阳性克隆至上海生工生物技术有限公司(上海)测序。

从红颜草莓中得到的FaVPE3的全长序列经分析，一共获得有不同SNP的5个版本，我们将不同克隆测序后出现频率最高的可完整翻译的版本作为后续试验模板，也是本发明提供FaVPE3基因全长序列版本，见前(即，SEQ ID No.1)。以此为模板，用引物(GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGGAGACGTCTTACGCTTGC SEQ ID No.5和GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTGTTGATGATGACTCCTTG SEQ ID No.6)(下划线为基因特异引物区，无下划线为克隆到入门载体pDONR221需要的接头序列)扩增得到265bp基因特异片段(如SEQ ID No.11所示)，经BP重组反应克隆pDONR221载体上，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中过夜培养。经菌落PCR、质粒PCR及质粒酶切鉴定后均得到符合预期大小的目标条带后，送阳性克隆至上海生工生物技术有限公司(上海)测序，采用M13-20通用引物(原始文件-ZB18121102607(WY3-2)M13-20_J_D05)。

对测序验证的含265bp基因片段的pDONR221载体质粒(图6)经[email protected]^TM II Enzyme Mix做LR重组反应，双向***到干扰表达载体pK7GWIWG2D(II)(M.Guidarelli,L.Zoli,A.Orlandini,P.Bertolini,E.Baraldi,The mannose-bindinglectin gene FaMBL1 is involved in the resistance of unripe strawberry fruitsto Colletotrichum acutatum,Mol.Plant Pathol.15(8)(2014)832–840.)中，转化大肠杆菌感受态。挑取单克隆经菌液PCR、质粒PCR与质粒酶切鉴定(见下图7)，挑选阳性克隆抽提质粒，获得FaVPE3的RNA干扰表达载体pK7GWIWG2D(II)-FaVPE3-RNAi构建成功的质粒采用冻融法转入根癌农杆菌GV3101感受态细胞，2d后挑取单克隆进行菌液PCR鉴定，保存阳性克隆用于草莓果实侵染。

图7中，lane1-10为PCR鉴定，其中1-5泳道是平行构建另一个质粒的鉴定，6-10为pK7GWIWG2D(II)-RNAi-VPE3的鉴定:L6引物组为SEQ ID No.5-6；L7-8引物组为SEQ IDNo.6+35S-end-F(载体通用：attacaatttactattctagtcg SEQ ID No.12)；L9-10引物组为SEQ ID No.6+35S-Terminator(载体通用：ttttgcggactctagcatggccg SEQ ID No.13)；L7、9以水为模板,L6、8、10以所构质粒为模板。泳道L11-15为酶切鉴定:L11是KpnI+SacI双切原始质粒pK7GWIWG2D(II)(切下条带为4783bp)，L12(KpnI)和L13(SacI)分别是原始质粒单切，L14是平行构建另一个质粒的KpnI+SacI双切；L15是pK7GWIWG2D(II)-FaVPE3-RNAi的KpnI+SacI双切(切下条带为3805bp).Marker是DL2000.

实施例2、FaVPE3基因干扰表达草莓的获得

以智能人工温室中的“红颜”草莓大绿果为材料，用记号笔从中部纵向划线分为两部分。将含有目标基因干扰表达载体pK7GWIWG2D(II)-FaVPE3-RNAi和空载体pK7GWIWG2D(II)的农杆菌菌株，分别接种于5mL YEP培养基(含有50μg/mL Kan、50μg/mL Rif和50μg/mLGen)中，28℃下250rpm培养过夜，次日从中吸取500μl菌液再转接于50mL YEP培养基(含有10mM MES、20μM AS、50μg/mL Kan、50μg/mL Rif和50μg/mL Gen)中，28℃过夜培养，摇菌至对数期(OD值0.6-0.8)，4000rpm离心10min收集菌体。用侵染缓冲液(含有10mM MES、200μMAS、10mM MgCl₂)重悬菌体，调节菌液浓度至OD值为1.2-1.5，28℃静置3h后使用微注射方法将菌液从果实中部一侧注入果实皮层中。菌液用量100ul每侧注射，每个果实左侧注射对照空载体农杆菌，右侧注射干扰表达载体农杆菌。控制环境温度在25-28℃。

实施例3、RNA干扰FaVPE3基因表达下降草莓的分子鉴定

农杆菌微注射一周到10天左右，果实成熟。将实验组FaVPE3基因RNA干扰草莓果实一侧与注射空载体的对照组草莓果实一侧相比较，发现二者在外观上基本一致，无可见差异(图2)。

在基因的3‘端设计FaVPE3新的特异引物对，正向引物

5‘-GCTCAAGCTCAAAAAGAA-3’SEQ ID No.7和反向引物

‘-CATCCCATACTGAGAAAGTG-3’SEQ ID No.8，扩增产物222bp。

通过RT-PCR在转录水平鉴定FaVPE3基因干扰表达的效果。内参基因GAPDH特异引物组为5‘-TCCATCACTGCCACCCAGAAGACTG-3’SEQ ID No.9和5‘-AGCAGGCAGAACCTTTCCGACAG-3’SEQ ID No.10(扩增产物长132bp)。结果表明，相比于注射空载体的对照组果实，注射含FaVPE3基因干扰载体的实验组果实中发生了FaVPE3的不同程度转录产物积累水平的下降(图3)。

实施例4、FaVPE3基因干扰表达草莓的表型鉴定

通过高效液相色谱技术(High performance liquid chromatography，HPLC)对成熟草莓果实中的蔗糖、果糖、葡萄糖以及柠檬酸和苹果酸含量进行测定。

参照陈俊伟等(植物生理学报，2001，27(2):186-192)方法，略做改动。样品罐中加入适量样品，放入液氮速冻1min，置于样品研磨仪60Hz震荡30s，称取0.3g粉末加入预装有4mL 80％乙醇的10mL离心管中，37℃水浴60min，期间混匀几次，配平后4℃，10000rpm离心10min，转移上清液至15mL刻度离心管中；80％酒精重复提取1次，定容至10mL。然后吸取2mL提取样品置于2mL离心管中放入真空离心浓缩仪(ZLS-1)60℃旋转蒸干，用1.0mL超纯水充分溶解样品，10000rpm离心10min，上清液经0.45μm水相滤膜过滤后存于1.5mL进样瓶中，用于高效液相色谱(HPLC，Waters公司2695，USA)分析。测定果实可溶性糖的色谱条件：流动相，超纯水；流速，0.5mL·min-1；柱温，30℃；柱温箱温度，80℃；进样量，10μL；液相色谱柱为SP0810(8×300mm)糖柱，日本shodex公司；示差检测器2414，美国Waters公司。蔗糖、果糖和葡萄糖标准品浓度梯度分别为1mg·mL-1，0.8mg·mL-1，0.4mg·mL-1，0.2mg·mL-1及0.1mg·mL-1。

测定果实可滴定酸的色谱条件：流动相，10mM(NH4)2HPO4缓冲液，pH 2.55；流速，1.0mL·min-1；波长，210nm；液相色谱，WAT054275(4.6×250mm)C18柱，美国Waters公司；2998光电二极管阵列检测器，美国Waters公司。柠檬酸标准品浓度梯度分别为3mg·mL-1，2.4mg·mL-1，1.2mg·mL-1，0.6mg·mL-1及0.3mg·mL-1；苹果酸标准品浓度梯度分别为1mg·mL-1，0.8mg·mL-1，0.4mg·mL-1，0.2mg·mL-1及0.1mg·mL-1。

处理和对照样品中各种糖、酸含量见图4和图5；不同单果处理一侧相对于对照一侧糖酸含量均上升。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所作的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 上海市农业科学院

<120> 草莓液泡加工酶编码基因 FaVPE3 及其应用

<141> 2019-09-11

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1485

<212> DNA

<213> 草莓基因 FaVPE3(Fragaria x ananassa Duchase)

<400> 1

atgactcgct tggccgccgt cgtcgccgtc gtccttttct tccttgtctc cctctcttct 60

tcatccacca gcgcccgcga cctccccgga gacgtcttac gcttgccgtc ggagacttcg 120

aggttcttcc gcgccggcga tgatcagcaa gaggacggca ccgtcggcac gcggtgggcc 180

gttttgatcg ccggctccaa tggatactgg aattaccggc atcaggcgga tatatgccat 240

gcgtatcagt tattgaagaa aggaggactg aaagatgaga atattgttgt gttcatgtat 300

gatgatattg cttacaacga agagaaccct aggcaaggag tcatcatcaa cagtcctcat 360

ggtgatgatg tttataaggg agtccccaag gattacactg gggaagatgt tactgttggt 420

aacttctttg ccgctatcct tggaaacaaa actgctatct ccgggggtag cgggaaagtt 480

gtggacagcg gtccgaatga tcatatcttc atatactatt ccgatcatgg cggtcctgga 540

gtactcggga tgcctaccag tccttatatt tatgccgacc gcctcataga agtcttaaag 600

aagaagcatg cagcagggac atataaaagc ttggtatttt atcttgaagc ttgtgaatcc 660

ggaagtatct ttgagggtct tcttcctgaa ggtttgaata tctttgcaac tacagcgtca 720

aatgctgaag agagcagttg ggggacttac tgcccgggag agtatcctag tcctccccca 780

gaatatgaaa cctgtttggg tgacttgtat agtgttgctt ggatggaaga tagtgacatt 840

cacaacttga ggtcagaaac tttgcaccag cagtatgaac tggtcaaatc aaggactgca 900

agtgataatt ctccttatgg ttctcatgtc atgcaatatg gtgatatacc tcttagcaag 960

aacaacctat ttgtgtatat gggcacaaac cctgcaaatg ataactacac cttcatccct 1020

cagaacttct tgaggccatc ttcttcaaaa gctgtcaacc agagggatgc tgatcttgta 1080

catttttggc ataagtaccg caaggcccct gaaggctcag caagaaaagc tcaagctcaa 1140

aaagaatttc ttgaagcaat gtctcacaga atgcatatag atgaaagcgt gaaacttatc 1200

ggtaaactct tgtttggaat caaaaaaggt ccagaagtcc tcagcgctgt acgacctgct 1260

gggcagccac ttgttgatga ctgggaccgc cttaagacaa tggcgaggag ttttgagaca 1320

tattgcggat cactttctca gtatgggatg aaacacatgc ggtccctggc aaacatctgc 1380

aatgctggaa tgacaaagga gcagatggct gaggcttcag cacaagcctg tgtcaatgtt 1440

ccttctggcc aatggagctc tctgcacagg ggattcagtg cttag 1510

<210> 2

<211> 494

<212> PRT

<213> 草莓基因 FaVPE3(Fragaria x ananassa Duchase)

<400> 2

Met Thr Arg Leu Ala Ala Val Val Ala Val Val Leu Phe Phe Leu Val

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ser Ser Ser Thr Ser Ala Arg Asp Leu Pro Gly Asp Val

20 25 30

Leu Arg Leu Pro Ser Glu Thr Ser Arg Phe Phe Arg Ala Gly Asp Asp

35 40 45

Gln Gln Glu Asp Gly Thr Val Gly Thr Arg Trp Ala Val Leu Ile Ala

50 55 60

Gly Ser Asn Gly Tyr Trp Asn Tyr Arg His Gln Ala Asp Ile Cys His

65 70 75 80

Ala Tyr Gln Leu Leu Lys Lys Gly Gly Leu Lys Asp Glu Asn Ile Val

85 90 95

Val Phe Met Tyr Asp Asp Ile Ala Tyr Asn Glu Glu Asn Pro Arg Gln

100 105 110

Gly Val Ile Ile Asn Ser Pro His Gly Asp Asp Val Tyr Lys Gly Val

115 120 125

Pro Lys Asp Tyr Thr Gly Glu Asp Val Thr Val Gly Asn Phe Phe Ala

130 135 140

Ala Ile Leu Gly Asn Lys Thr Ala Ile Ser Gly Gly Ser Gly Lys Val

145 150 155 160

Val Asp Ser Gly Pro Asn Asp His Ile Phe Ile Tyr Tyr Ser Asp His

165 170 175

Gly Gly Pro Gly Val Leu Gly Met Pro Thr Ser Pro Tyr Ile Tyr Ala

180 185 190

Asp Arg Leu Ile Glu Val Leu Lys Lys Lys His Ala Ala Gly Thr Tyr

195 200 205

Lys Ser Leu Val Phe Tyr Leu Glu Ala Cys Glu Ser Gly Ser Ile Phe

210 215 220

Glu Gly Leu Leu Pro Glu Gly Leu Asn Ile Phe Ala Thr Thr Ala Ser

225 230 235 240

Asn Ala Glu Glu Ser Ser Trp Gly Thr Tyr Cys Pro Gly Glu Tyr Pro

245 250 255

Ser Pro Pro Pro Glu Tyr Glu Thr Cys Leu Gly Asp Leu Tyr Ser Val

260 265 270

Ala Trp Met Glu Asp Ser Asp Ile His Asn Leu Arg Ser Glu Thr Leu

275 280 285

His Gln Gln Tyr Glu Leu Val Lys Ser Arg Thr Ala Ser Asp Asn Ser

290 295 300

Pro Tyr Gly Ser His Val Met Gln Tyr Gly Asp Ile Pro Leu Ser Lys

305 310 315 320

Asn Asn Leu Phe Val Tyr Met Gly Thr Asn Pro Ala Asn Asp Asn Tyr

325 330 335

Thr Phe Ile Pro Gln Asn Phe Leu Arg Pro Ser Ser Ser Lys Ala Val

340 345 350

Asn Gln Arg Asp Ala Asp Leu Val His Phe Trp His Lys Tyr Arg Lys

355 360 365

Ala Pro Glu Gly Ser Ala Arg Lys Ala Gln Ala Gln Lys Glu Phe Leu

370 375 380

Glu Ala Met Ser His Arg Met His Ile Asp Glu Ser Val Lys Leu Ile

385 390 395 400

Gly Lys Leu Leu Phe Gly Ile Lys Lys Gly Pro Glu Val Leu Ser Ala

405 410 415

Val Arg Pro Ala Gly Gln Pro Leu Val Asp Asp Trp Asp Arg Leu Lys

420 425 430

Thr Met Ala Arg Ser Phe Glu Thr Tyr Cys Gly Ser Leu Ser Gln Tyr

435 440 445

Gly Met Lys His Met Arg Ser Leu Ala Asn Ile Cys Asn Ala Gly Met

450 455 460

Thr Lys Glu Gln Met Ala Glu Ala Ser Ala Gln Ala Cys Val Asn Val

465 470 475 480

Pro Ser Gly Gln Trp Ser Ser Leu His Arg Gly Phe Ser Ala

485 490

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt catgactcgc ttggccgccg tcgt 55

<210> 4

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt catgactcgc ttggccgccg tcgt 55

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cggagacgtc ttacgcttgc 51

<210> 6

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tgttgatgat gactccttg 50

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gctcaagctc aaaaagaa 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

catcccatac tgagaaagtg 21

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tccatcactg ccacccagaa gactg 26

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agcaggcaga acctttccga cag 24

<210> 11

<211> 265

<212> DNA

<213> 草莓 FaVPE3 基因特异片段(Fragaria ×ananassa Duchase)

<400> 11

ggagacgtct tacgcttgcc gtcggagact tcgaggttct tccgcgccgg cgatgatcag 60

caagaggacg gcaccgtcgg cacgcggtgg gccgttttga tcgccggctc caatggatac 120

tggaattacc ggcatcaggc ggatatatgc catgcgtatc agttattgaa gaaaggagga 180

ctgaaagatg agaatattgt tgtgttcatg tatgatgata ttgcttacaa cgaagagaac 240

cctaggcaag gagtcatcat caaca 275

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

attacaattt actattctag tcg 24

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ttttgcggac tctagcatgg ccg 24