阅读说明：本技术 一种核桃楸青果皮饮片及其制备方法 (Walnut Chinese walnut and Chinese olive peel decoction pieces and preparation method thereof ) 是由 郭姗姗 吴秀坤 刘今方 刘君 于 2020-05-25 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种核桃楸青果皮饮片及其制备方法,该饮片中胡桃醌重量百分含量为0.004％-0.30％,胡桃酮重量百分含量为0.50％-2.00％。研究表明,研究表明,本发明经炮制后饮片,更优效以及更高的安全性。(The invention belongs to the technical field of biological medicines, and particularly relates to a juglone and Chinese walnut peel decoction piece and a preparation method thereof, wherein the juglone is 0.004-0.30 wt% and the juglone is 0.50-2.00 wt% in the decoction piece. Researches show that the processed decoction pieces have better effect and higher safety.)

一种核桃楸青果皮饮片及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种新型的核桃楸青果皮饮片及其制备方法。

技术背景

核桃楸青果皮，中药材名。本品为胡桃科植物核桃楸Juglans MandshuricaMaxim.，以种仁、青果和树皮入药。夏秋采青果趁鲜捣碎泡酒备用；秋季采成熟果实，除去外果皮，洗净晒干或去内果皮(壳)取仁用。树皮多于春夏之交采集，晒干即得。功能主治为：种仁：敛肺定喘，温肾润肠。用于体质虚弱，肺虚咳嗽，肾虚腰痛，便秘，遗精，阳痿，尿路结石，乳汁缺少。青果：止痛。用于胃、十二指肠溃疡，胃痛；外用治神经性皮炎。树皮：清热解毒。用于细菌性痢疾，骨结核，麦粒肿。

核桃楸又称核桃青皮，为胡桃科植物核桃揪的未成熟外果皮。主要分布在我国黑龙江省东部，小兴安岭、完达山、老爷岭及张广才岭等山区。作为一种民间药在我国的应用由来己久，最初记载于《开宝本草》，称之为胡桃青龙，《救急方》中称之为青胡桃皮，自《山东中草药手册》称之为“青龙衣”后，现多延用此名。其药性苦、涩，古代医家多以其清热解毒、祛风疗癣、止痛止痢功效入药，近年来因其抗肿瘤效果突出而备受国内外学者的广泛关注。近年来，应用于治疗消化系统肿瘤，尤其对食管癌、胃癌均有显著疗效。胡桃楸的青果皮在中药中被称为青龙衣，青龙衣含有较高的活性物质胡桃醌(5-羟基-1，4-萘醌)。研究发现，胡桃醌有特异的抑制作用，有望用于体外转录研究；其水溶液培养液毒性测试，证明了胡桃醌对人有潜在的毒理作用；它在培养液中表现出毒性，但还具有抗病毒、抗细菌、抗真菌、抗癌等活性功效。因此，在制备核桃楸青果皮饮片时，采用一定的炮制方法(制备方法)，从而控制胡桃醌的含量，具有重要意义。

发明内容

申请人经过多次创造性试验，意外发现一种核桃楸青果皮饮片，该饮片具有抗肿瘤、定痛的作用，但是有一定的毒性，这种毒性的主要成分是胡桃醌。研究表明，本发明炮制后的饮片，具有更优效以及更高的安全性。。

本发明通过下述方案实现的。

一种核桃楸青果皮饮片，该饮片中胡桃醌重量百分含量为0.004％-0.30％，胡桃酮重量百分含量为0.50％-2.00％。

所述的一种核桃楸青果皮饮片，其中该饮片中胡桃醌重量百分含量为0.004％-0.20％，胡桃酮重量百分含量为1.00％-2.00％。

所述的一种核桃楸青果皮饮片，其中该饮片中胡桃醌重量百分含量为0.004％-0.20％，胡桃酮重量百分含量为1.00％-1.50％。

所述的一种核桃楸青果皮饮片，其中该饮片中胡桃醌重量百分含量为0.004％-0.10％，胡桃酮重量百分含量为1.00％-1.50％。

该核桃楸青果皮饮片的制备方法包括但不限于下述：

(1)入伏后的第15-20天间对未成熟的青胡桃皮进行采收；

(2)先将青胡桃皮放入30℃-40℃环境条件下，干燥3-5小时后，放入0℃-10℃通风保持2-4小时；取出后，放入60℃-65℃环境条件下，干燥4-6小时后，得到核桃楸青果皮饮片。

本发明所述的入伏为：进入三伏天；“从夏至日”开始往后数，数到第三个“庚日”便开始入伏了。这里的“庚日”是指古代的“干支纪日法”中带有“庚”字头的那一天。

所述的一种核桃楸青果皮饮片，其中所述的青胡桃皮来源自：东北区域。

含有所述的核桃楸青果皮饮片的中药组合物。

其中所述的中药组合物中含有牛黄、黄芪、白附子、白鲜皮中一种或多种。

其中核桃楸青果皮饮片通过水煎煮和/或乙醇提取和/或乙醇沉淀的方法获得核桃楸提取物。

该饮片在抗肿瘤或抗癌药物中应用。其中所述的癌包括但不限于胃癌、肝癌、淋巴癌、乳腺癌、白血病。

本发明所述饮片还具有调节免疫、止痛、避免肿瘤细胞转移的作用，本发明饮片与化疗药、靶向药等还具有协同增效的作用。

本发明通过量子科学方法，通过振动，使得饮片中各成分信息重新排列，使功效进一步提升。

本发明将量子科学用于中药炮制中，成分的反应产物得到有序排列，为中药炮制减毒增效的机理提供依据。核桃楸中药炮制机理研究应先进行胡桃醌以及胡桃酮的模拟炮制，分析不同温度、时间等条件下，单体成分的水解变化规律，结合药理毒理实验，明确成分及其水解产物的相互作用，为饮片的炮制机理研究打下良好的基础。再者应对药效部位进行模拟炮制研究，探讨胡桃醌、胡桃酮在共同炮制条件下的相互作用，以及黄酮、多糖等其他成分的影响，结合药理毒理实验，更加明确炮制机理。中药最终是以饮片入药，还应结合饮片的具体临床应用，研究以饮片整体炮制的成分变化规律，并结合整体动物的药理毒理研究，综合分析才能最终阐明减毒增效的炮制机理。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。

制备实施例

实施例1

(1)入伏后的第15天对未成熟的青胡桃皮进行采收；

(2)先将青胡桃皮放入30℃环境条件下，干燥5小时后，放入0℃通风保持4小时；取出后，放入60℃环境条件下，干燥6小时后，得到青龙衣饮片。

该饮片中胡桃醌重量百分含量为0.004％，胡桃酮重量百分含量为1.97％。

实施例2

(1)入伏后的第20天对未成熟的青胡桃皮进行采收；

(2)先将青胡桃皮放入40℃环境条件下，干燥3小时后，放入10℃通风保持2小时；取出后，放入65℃环境条件下，干燥4小时后，得到青龙衣饮片。

该饮片中胡桃醌重量百分含量为0.32％，胡桃酮重量百分含量为0.74％。

实施例3

(1)入伏后的第16天对未成熟的青胡桃皮进行采收；

(2)先将青胡桃皮放入35℃环境条件下，干燥4小时后，放入5℃通风保持3小时；取出后，放入62℃环境条件下，干燥5小时后，得到青龙衣饮片。

该饮片中胡桃醌重量百分含量为0.09％，胡桃酮重量百分含量为1.37％。

实施例4

(1)入伏后的第18天对未成熟的青胡桃皮进行采收；

(2)先将青胡桃皮放入38℃环境条件下，干燥3.5小时后，放入8℃通风保持2.5小时；取出后，放入65℃环境条件下，干燥5.5小时后，得到青龙衣饮片。

饮片中胡桃醌重量百分含量为0.11％，胡桃酮重量百分含量为1.46％。

实施例5

(1)入伏后的第19天对未成熟的青胡桃皮进行采收；

(2)先将青胡桃皮放入32℃环境条件下，干燥4.8小时后，放入2℃通风保持3.8小时；取出后，放入65℃环境条件下，干燥4.4小时后，得到青龙衣饮片。

饮片中胡桃醌重量百分含量为0.095％，胡桃酮重量百分含量为1.04％。

实施例3

(1)取入伏18天对未成熟的青胡桃皮进行采收，洗净，备用；

(2)取黑土，加入碳酸氢钠、氯化镁、氯化钠搅拌均匀，干燥，得到混合物；

(3)取备用核桃楸青果皮，加入到混合物中，真空干燥。

其中步骤(2)中黑土(黑龙江省三江地区黑土)、碳酸氢钠、氯化镁、氯化钠的重量比为1:0.34:0.15:0.15。

其中步骤(3)中混合物掩盖核桃楸青果皮。

其中真空干燥为：真空度为0.05MPa，温度45℃，干燥时间为36h。

该饮片中胡桃醌重量百分含量为0.084％，胡桃酮重量百分含量为1.34％。

对比例

取同一批核桃楸青果皮，洗净，烘箱100℃干燥72h，得到饮片。

该饮片中胡桃醌重量百分含量为0.74％，胡桃酮重量百分含量为0.15％。

胡桃醌含量测定

胡桃醌对照品(隆誉翼尧(北京)科技有限公司制备，纯度：＞99％)；胡桃酮对照品(隆誉翼尧(北京)科技有限公司制备，经氢谱、碳谱检测结构，HPLC面积归一化法测定纯度：＞98％)；

色谱条件：色谱柱为C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为甲醇∶水(55：45)；流速：1.0mL/min；检测波长：265nm；柱温：30℃；进样量：10μl。在上述色谱条件下，理论板数以胡桃酮、胡桃醌峰计均＞3 000；各成分基线分离良好，分离度＞1.5。

对照品溶液制备：取待测成分对照品适量，称定，置于10ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成胡桃醌、胡桃酮质量浓度分别为0.076、0.082mg/mL的混合对照品溶液。

供试品溶液的制备：分别取不同饮片5g，粉碎用100ml甲醇回流提取4h，提取3次，合并提取液，浓缩干燥，得到浸膏粉，取10mg浸膏粉用甲醇溶解完全转移至10mL容量瓶中以甲醇定容，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

精密量取对照品溶液和供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，按照外标法计算饮片中胡桃醌含量。

试验结果见表1。

表1不同实施例胡桃醌含量

试验结论：上述对比试验表明，采用常规干燥工艺得到胡桃楸青果皮饮片中胡桃醌的含量为0.74％，胡桃酮含量0.15％；而经过本发明工艺方法制备得到的核桃楸青果皮饮片中胡桃醌含量最高为0.30％，最低为0.004％，胡桃酮最高含量1.97％，最低含量0.74％；即可以按照工艺参数设定得到不同的质量的核桃楸青果皮饮片，其中胡桃醌0.004％，胡桃酮最高含量1.97％为最佳。可以用于不同产品中，比如抗肿瘤产品中使用胡桃醌含量较高的饮片，而其他慢病产品中，可以使用胡桃醌含量较低的饮片。

试验1

小鼠急性毒性试验

试验方法：体重18-22g的清洁级C57BL/6J小鼠，随机分组，实施例3组分为三个剂量给药，分别为5g/kg，10g/kg，20g/kg，另设空白对照组。按200μL/10g小鼠体重在24h内灌胃给药两次，对照组灌服蒸馏水。给药前小鼠禁食8h，不禁水，给药后3h复食。连续观察7d，每天观察小鼠精神状态、采食、饮水、活动，并记录小鼠的中毒情况，如有死亡，记录死亡时间和死亡数目。

试验结果：小鼠灌胃本发明核桃楸青果皮饮片提取物之后，饮食正常，灌胃3d体重略有下降，活动减少，随后逐渐恢复正常活动，皮毛光滑，大小便正常，无异常分泌物，无其他任何异常不良反应。观察7d后，所有试验组小鼠均无死亡，体重逐渐增加，解剖后未见小鼠心、肝、胃等主要脏器出现中毒现象。按《动物毒理学》外源性化学物毒性判定标准，当剂量大于15g/kg时，为无毒物质。试验最大剂量为20g/kg，表明本发明经炮制后核桃楸青果皮饮片无毒性作用。

试验2

对H22肝癌小鼠抗肿瘤作用

试验动物：昆明种小鼠，20-25g。

试验药物：

试验1组：对比例的饮片。

取饮片5g，粉碎用100ml甲醇回流提取4h，提取3次，合并提取液，浓缩干燥，得到浸膏粉，备用。

试验2组：实施例3的饮片。

取饮片5g，粉碎用100ml甲醇回流提取4h，提取3次，合并提取液，浓缩干燥，得到浸膏粉，备用。

试验3组：实施例6饮片。

取饮片5g，粉碎用100ml甲醇回流提取4h，提取3次，合并提取液，浓缩干燥，得到浸膏粉，备用。

试验方法：取对数生长期的H22细胞，用生理盐水调整细胞密度，腹腔注射到雄性昆明种小鼠体内，作为瘤源小鼠，待小鼠腹部隆起后，无菌条件下抽取乳白色腹水，1000r/min离心10min，弃上清，利用生理盐水调整细胞密度(2×107/mL)制成细胞悬液。选取健康昆明种小鼠(雌雄各半)，以1ml/g剂量肌肉注射100g/L氨基甲酸乙酯麻醉小鼠，将小鼠仰卧固定，腹部先用80mg/g的硫化钠进行脱毛处理，再进行常规消毒，于上腹正中剑突下约l cm左右切口，逐层切开皮肤、腹膜，用生理盐水浸湿的纱布置于切口下方，轻轻挤压肋弓两侧，使小鼠肝左叶暴露于湿纱布上，用微量注射器沿肝叶长轴方向与肝面平行20度角进针，进针后平行推移0.5cm左右，将浓度为2×10⁷/mL的细胞缓慢注入10～20μl。退出针头用无菌棉签轻压针眼，针眼周围用酒精棉球轻轻擦拭，以除去少量漏出的肿瘤细胞，防止肿瘤细胞逃逸，将肝轻轻回纳腹腔，查无活动性出血后，逐层缝合腹壁，再次用750ml/L酒精消毒皮肤，于伤口处撒消炎粉，盖上纱布，术毕。术后禁食禁水12h后正常活动的小鼠即为肝癌细胞原位移植模型。另选一批(雌雄各半)小鼠进行假移植，即肝部不接种H22肿瘤细胞，其余步骤与肝癌模型相同。将肝癌原位移植成功的小鼠随机分为5组(每组10只，雌雄各半)：模型组、环磷酰胺组、试验药物组。手术24h后开始给药，试验组分别125mg浸膏/kg灌胃给药，模型组灌胃生理盐水，连续灌胃14d，环磷酰胺组腹腔注射环磷酰胺20mg/kg，试验第15天，摘除眼球采血，断颈处死小鼠，摘除肝组织。剥离肝组织上的瘤块，用生理盐水洗净后称重，计算抑瘤率。

抑瘤率＝(模型组平均瘤质量－给药组平均瘤质量)÷模型组平均瘤质量×100％。

试验结果见表2。

表2不同给药组抑瘤率结果比较

注：与模型组比较**P<0.01，*P<0.05。

试验结论：上述试验表明，对比例组的抑瘤效果与模型组比较没有统计学差异，说明对比例组抑制肝癌细胞的作用不明显；而本发明的实施例组与模型组比较具有显著性差异(P<0.05)，充分说明本发明核桃楸青果皮饮片具有很好的抗肿瘤的作用。

上述所述实施例或试验例包括但不限于上述。