一种发光细菌冻干保护剂、冻干粉及其在水质综合毒性在线监测中的应用
阅读说明：本技术 一种发光细菌冻干保护剂、冻干粉及其在水质综合毒性在线监测中的应用 (Luminescent bacterium freeze-drying protective agent, freeze-dried powder and application of luminescent bacterium freeze-drying protective agent and freeze-dried powder in water quality comprehensive) 是由 方俊 张琳琳 刘刚 蒋红梅 刘芬 胡超 于 2019-08-27 设计创作，主要内容包括：一种发光细菌冻干保护剂、冻干粉及其在水质综合毒性在线监测中的应用。每L发光细菌冻干保护剂由如下组分组成：脱脂乳100—200g,蔗糖20—120g,氯化钠10—60g,其余为水。发光细菌冻干粉由发光细菌冻干保护剂加入发光细菌的菌液中制备而成。该发光细菌冻干保护剂或发光细菌冻干粉可作为检测制剂用于在线水质毒性监测中。该发光细菌冻干粉复苏后置于4℃菌种储存杯冷藏,可供在线毒性监测仪器使用15d,能够替代进口冻干保护剂,降低在线毒性监测仪器的试剂耗材运行成本,提高在线毒性监测仪器的持续稳定运行,为水质安全起到生物毒性预警作用。(A luminescent bacteria freeze-drying protective agent, freeze-dried powder and application thereof in water quality comprehensive toxicity on-line monitoring. Each L of the luminous bacteria freeze-drying protective agent consists of the following components: 100-200 g of skim milk, 20-120 g of cane sugar, 10-60 g of sodium chloride and the balance of water. The luminous bacteria freeze-dried powder is prepared by adding a luminous bacteria freeze-drying protective agent into a luminous bacteria liquid. The luminescent bacterium freeze-drying protective agent or luminescent bacterium freeze-drying powder can be used as a detection preparation for online water quality toxicity monitoring. The luminous bacteria freeze-dried powder is placed in a strain storage cup at 4 ℃ for refrigeration after recovery, can be used for an online toxicity monitoring instrument for 15d, can replace an imported freeze-drying protective agent, reduces the operation cost of reagent consumables of the online toxicity monitoring instrument, improves the continuous stable operation of the online toxicity monitoring instrument, and plays a role in biological toxicity early warning for water quality safety.)
技术领域
本发明涉及环境生物监测技术领域，具体涉及一种发光细菌冻干保护剂、冻干粉及其在水质综合毒性在线监测中的应用。
背景技术
发光细菌是体内自身含荧光酶的细菌，在正常的生理条件下，可发出波长在450—490nm范围内蓝绿色可见的“冷光”细菌，是兼性好氧化能自养型细菌。
发光细菌有传统、系统、数值分类等几种不同的分类方法。迄今为止，全世界范围内发现的发光细菌种类，大致分为以下种类：杆菌属、弧菌属和希瓦氏菌属。目前国内外常用的几种发光细菌为：鳆鱼发光杆菌、明亮发光杆菌、费氏弧菌，青海弧菌。费氏弧菌是ISO采用的标准菌株，青海弧菌是我国特有的淡水菌。
污染物主要通过以下两个途径来抑制细菌发光：直接抑制参与发光反应的荧光酶的活性；抑制细胞内与发光反应有关的代谢过程，凡是能破坏发光细菌呼吸，生长，新陈代谢的任何时有毒物质，都可以根据发光强度的变化来测定有毒物质毒性的大小。其主要的敏感毒物为有机污染物和重金属两类。发光强度的变化通过生物测光仪测定出来，这就是为什么可以利用发光细菌来检测环境中有毒、有害物质的基本依据。
由于研究水生生态系统复合污染的潜在影响越来越依赖毒性实验，需要发展一种短期、经济、快速的测试体系来代替传统的长期毒性实验。发光细菌在上个世纪70年代己经兴起了，美国Beckman公司研制了生物发光光度计，即Microtox系统，该系统使用天然发光菌的冻干粉，复苏后即可测试，所得结果与鱼类的96小时急性毒性试验结果相近。从此发光细菌毒性检测技术在全球范围内流行起来，各国的环境监测和研究机构采用该法快速测试环境样品的生物毒性。
水源水质在线监测监测预警系统包括水源水质变化规律、预警参数的选择、在线仪器的选择和系统集成。在线水质毒性监测技术是水质预警的基础。在线水质毒性监测技术是将实验室水质毒性分析过程，即采样、试剂配制、预处理、反应和计算等过程完全自动化和连续化。这样对受式对象的活性要求更严格，需要自动连续的提供高活性的指示生物。否则，就可能出现监测信号不稳定，监测结果不可靠，直接影响在线监测仪器的性能、准确度及精密度。所以，发光细菌生物活性的稳定性保持是水质毒性在线监测仪的核心技术之一。
费氏弧菌常以菌液，固定化菌膜或冻干粉的形成应用在水质毒性在线监测仪器中，因冻干粉保质期长，便于运输、使用方便，是最常用的保存方法。目前，关于国内在发光细菌冻干粉保护剂的研究中常用的保护剂工艺、配方保护效率低，由冻干粉保护剂制备而成的冻干粉复苏后置于4℃菌种储存杯冷藏，供在线毒性监测仪器使用的过程中细菌的发光强度迅速下降，导致干粉中活菌数量较小，活性不稳定、使用周期短。这就造成了在线毒性仪器使用过程中检测结果不可靠，维护周期过短(3—5天)。大部分研究仍停留在实验室阶段，尚未实现国内外在线水质毒性仪器的通用。
发明内容
本发明只在针对现有技术的不足，提供一种发光细菌冻干保护剂、冻干粉及其在水质毒性检测中的应用。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：
每L所述发光细菌冻干保护剂由如下组分组成：脱脂乳100—200g，蔗糖20—120g，氯化钠10—60g，其余为水。
优选地，每L所述发光细菌冻干保护剂由如下组分组成：脱脂乳100—150，蔗糖20—60，氯化钠10—30，其余为水。
更优选地，每L所述发光细菌冻干保护剂由如下组分组成：脱脂乳140g，蔗糖60g，氯化钠30g，其余为水。
优选地，所述发光细菌为费氏弧菌。
上述发光细菌冻干保护剂的制备方法是先将脱脂加水溶解，然后加入氯化钠和蔗糖，搅拌10—20min，优选为15min，直到各组分全部溶解后，即得发光细菌冻干保护剂。
所述发光细菌冻干粉由上述发光细菌冻干保护剂加入发光细菌的菌液中制备而成。具体而言，是将发光细菌冻干保护剂与发光细菌的菌液按照体积比1:3至1:6混悬配制而成。优选地，所述发光细菌冻干保护剂与发光细菌的菌液的体积比为1:5。
上述发光细菌冻干保护剂或发光细菌冻干粉可作为检测制剂用于水质综合毒性在线监测中。所述在线水质毒性监测是利用水质在线毒性仪器对水质进行毒性监测。
下面对本发明作进一步说明：
本发明提供的发光细菌冻干保护剂原料为脱脂乳、蔗糖和氯化钠。脱脂乳为一种基础保护剂，它可以促进冻干样品的升华形成耐热骨架阻断热传导和热辐射，并易取得均质产品，扩大细胞间的相互距离，通过包裹形式保护菌体。单纯的以脱脂乳为保护剂时，细菌的发光率总体仍然较低，因此还需增加糖醇类物质来提高费氏弧菌的存活率。蔗糖分子中含有羟基，在冷冻和干燥过程中，可与菌体细胞膜磷脂中的磷酸基团或菌体蛋白质极性基团形成氢键，使细胞表面形成一层“水合层”，保持细胞膜和蛋白质结构与功能的完整性，也有利于细胞较快复水或修复受损细胞。另外，费氏弧菌是海洋菌，其对氯化钠浓度有一定的要求，3％的氯化钠有利于费氏弧菌发光。
本发明的另一个目的是上述冻干保护剂在制备费氏弧菌冻干粉中的应用，通过该冻干保护剂制得的费氏弧菌冻干粉用到水质综合毒性在线分析仪器，提高仪器的运维效率，降低成本，产生经济效益。
具体应用的方式如下：
将发光细菌干粉用3％的氯化钠溶解混匀，接入到液体培养基中，25℃200rmp培养20h,4℃，10000rmp离心15min,弃去上清液，收集菌体。
制备本发明所述的发光细菌冻干保护剂；制备时先将脱脂乳加水溶解，后加入氯化钠和蔗糖，搅拌10—20min，优选为15min，直到全部溶解为止。
将菌体复苏后得到菌液，按发光细菌冻干保护剂与发光细菌的菌液按体积比(V/V)1:2至1:7混悬均匀后，分装到小玻璃瓶中；将分装好的混合物于-80℃预冻4h，放入冻干机中，真空冷冻干燥24h，即得发光细菌冻干粉。
本发明所述的发光细菌冻干保护剂有效提高了发光细菌冻干粉的活菌量，使其可以达到1.5*109CFU/g,冻干粉可以在5min钟内复苏，光子量达到相对稳定，可供水质综合毒性在线分析仪器连续使用15天左右。有利于发光细菌冻干粉的生产研究以及在环境监测中的应用，有效提高了其经济效益。
总之，本发明提供了一种能有效提高发费氏弧菌冻干粉存活率和生物活性稳定性、灵敏度的冻干保护剂，由该冻干保护剂制备的冻干粉复苏后置于4℃菌种储存杯冷藏，可供在线毒性监测仪器使用15d，能够替代国外进口冻干保护剂，降低国内外在线毒性监测仪器的试剂耗材运行成本，提高国家地水站在线毒性监测仪器的持续稳定运行，为国家的水质安全起到真正意义上的生物毒性预警作用。
附图说明
图1是发光细菌的冻干粉复苏时间与发光强度结果图；
图2是标准毒物线性拟合图；
图3是应用到在线毒性性监测仪器上连续使用15d菌干粉灵敏度变化图；
图4是制作的多批次冻干粉测试参比水的毒性稳定性变化图。
具体实施方式
实施例1不同配比的保护剂制备的发光菌的含菌量
按本发明中“具体应用方式”中的步骤对费氏弧菌(发光细菌的标准菌)进行培养制作，最后加入表1中所列数值的保护剂，冷冻干燥，低温储存-80℃冰箱中，取出时用3％的氯化钠复苏，进行10倍梯度稀释，平板培养计数，得出每个不同保护剂配比所含费氏弧菌的数量，空白对照采用14g的脱脂乳溶于100mL无菌水中，制成保护剂为对照组。
表1
组别
脱脂乳(g)
蔗糖(g)
氯化钠(g)
含菌量(CFU/g)
组1
8
1
0.5
3.1*10<sup>8</sup>CFU/g
组2
10
2
1
3.4*10<sup>8</sup>CFU/g
组3
12
4
2
6.7*10<sup>8</sup>CFU/g
组4
14
6
3
1.5*10<sup>9</sup>CFU/g
组5
16
8
4
4.3*10<sup>8</sup>CFU/g
组6
18
10
5
6.1*10<sup>7</sup>CFU/g
组7
20
12
6
3.8*10<sup>7</sup>CFU/g
组8
22
14
8
3.0*10<sup>7</sup>CFU/g
对照组
14
2.9*10<sup>7</sup>CFU/g
从结果可以看出，使用本发明的冻干保护剂制备的费氏弧菌冻干粉的含菌量均大于对照组的含菌量，组4为保护剂最佳配比。
实施例2保护剂最佳添加量的确定
将实施例1中组3的保护剂配方用于费氏弧菌冻干粉的制作，分别按冻干保护剂体积比为1:1，1:2，1:3，1:4，1：5，1:6，1:7(表2)添加到费氏弧菌菌液中，测添加不同量的保护剂后冻干粉的含菌量，详细操作步骤同实施例1。同时用生物发光测试仪测定不同体积比的含菌量、初始发光量。
表2
从结果可以看出，采用冻干保护剂的体积比为1:5时，制得的冻干粉复苏后的活菌量较多，且初始发光值最高，有利于对水体中有毒物的灵敏度响应，延长其在仪器上的使用周期。
实施例3保护剂最佳复苏时间的确定(表3)
表3
冻干粉复苏时间
最佳护剂干粉光亮度
进口在线培养干粉光亮度
1min
6270042
0
2min
8001385
0
3min
9268910
0
4min
11009371
1
5min
12105973
3
10min
12369710
20
20min
12200934
236
30min
11983175
1142
60min
11826740
4967
120min
11760143
15672
1d
11056213
4468207
通过表3和图1可以看出，复苏5min后相对发光强主要达到1200多万，发光强度在5—30min内达到稳定状态，进口在线培养的菌干粉需在线仪器培养1天后才达到400多万。通过复苏时间和复苏后的光子亮度较，可得出，采用本发明最佳保护剂制行出的费氏弧菌冻干粉复苏时间大大缩短，且光亮度高于进口干粉。这有利于干粉在现场在线监测仪器上的便捷使用，降低仪器的运行维护量和运行成本。
实施例4冻干粉的灵敏度测试
测量不同浓度的阳性质控液(七水合硫酸锌)，得到对应的费氏弧菌的发光抑制率，阳性质控浓度对数为横坐标，以其对应的相对抑制率为纵坐标作图，采用最小二乘法将抑制率处于20—80％范围内的数据进行线性拟合，得到拟合方程y＝alogx+b及R2值，其中x为七水合硫酸锌浓度，y为相对抑制率；将y＝50％代入拟合方程中，计算出对应的x值。
通过图2曲线计算所得所制冻干粉的阳性质控EC50值为5.05mg/L,优于国外进干粉阳性质控的EC50值(20mg/L)表明该干粉复苏后用于现场国内外的在线毒性分析仪上，当水体中发生有毒物质污染时，仪器要先发出报警指示，迅速启动应急预案。
实施例5应用到在线毒性监测仪器上连续使用15天菌干粉灵敏度变化
将最佳冻干保护剂配方制备的费氏弧菌冻干粉冷藏运输到现场安有毒性在线分析仪器的水站，水合复苏后放入仪器菌种储存杯中，搅拌培养10min，配制20mg/L的七水合硫酸锌阳性质控标准溶液，进行测试，每天测试2次，取两次均值，连续测试15d，测试结果见图3。
通过应用到现场水站生物毒性在线分析仪器上的阳性质控数据来看，连续测试15天20mg/L的七水合硫酸锌阳性质控，毒性值均≧60％，满足了发光细菌法的在线生物毒性分析仪的使用要求，采用本发明最佳保护剂制备的费氏弧菌冻干粉灵敏度较高，且稳定性较好。
实施例6多批次冻干粉测试参比水的毒性稳定性变化
用最佳冻干保护剂配方制备6批次费氏弧菌冻干粉，采用3％的氯化钠溶解复苏10min,取2mL3％的氯化钠加入到检测池中，每批次3个平行样品，加入50uL复苏后的不同批次样品，摇匀，放入毒性检测仪中，读值，人工计算毒性结果，各批次毒性值结果见图4。
通过图4可得出，采用最佳保护剂制备的6批次冻干粉，测试一级水的毒性值均在±5％内波动，满足毒性仪器的使用要求。