阅读说明：本技术 一种共组装人工骨膜及其制备方法 (Co-assembled artificial periosteum and preparation method thereof ) 是由 毛杰 周雄 杜莹莹 王一帆 王江林 于 2020-06-05 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种共组装人工骨膜及其制备方法,所述共组装人工骨膜包括：由胶原蛋白介导的掺硅羟基磷灰石溶胶和丝素蛋白共组装制备得到的丝素蛋白/掺硅羟基磷灰石/胶原蛋白共组装人工骨膜；和/或：由丝素蛋白介导的掺硅羟基磷灰石溶胶和胶原蛋白共组装制备得到的胶原蛋白/掺硅羟基磷灰石/丝素蛋白共组装人工骨膜。本发明通过胶原蛋白和丝素蛋白的共组装改变丝素蛋白二级结构,使得该共组装人工骨膜具备良好的力学性能,生物相容性以及有序可控的降解性能,且含硅羟基磷灰石具备较低的结晶度,可提高成骨细胞活性,刺激干细胞的成骨分化,且解决了含硅羟基磷灰石,丝素蛋白,胶原蛋白三者共混后不易成型难以共组装缺点。(The invention provides a co-assembled artificial periosteum and a preparation method thereof, wherein the co-assembled artificial periosteum comprises the following components in parts by weight: the silk fibroin/silicon-doped hydroxyapatite/collagen co-assembled artificial periosteum is prepared by co-assembling collagen-mediated silicon-doped hydroxyapatite sol and silk fibroin; and/or: the collagen/silicon-doped hydroxyapatite/silk fibroin co-assembled artificial periosteum is prepared by co-assembling silk fibroin mediated silicon-doped hydroxyapatite sol and collagen. The invention changes the secondary structure of silk fibroin by the co-assembly of collagen and silk fibroin, so that the co-assembled artificial periosteum has good mechanical property, biocompatibility and orderly controllable degradation property, and the silicon-containing hydroxyapatite has lower crystallinity, can improve the activity of osteoblasts and stimulate the osteogenic differentiation of stem cells, and solves the defect that the co-assembly of the silicon-containing hydroxyapatite, the silk fibroin and the collagen is difficult to form after being blended.)

一种共组装人工骨膜及其制备方法

技术领域

本发明涉及人工骨膜技术领域，尤其涉及一种共组装人工骨膜及其制备方法。

背景技术

骨膜在保持骨完整性结构发挥了重要作用，骨膜包含外纤维层和内形成层，外纤维层包含胶原蛋白、成纤细胞、弹性蛋白、血管和神经网络，内形成层包含促进骨愈合的成人间充质祖细胞、骨祖细胞、成骨细胞及毛细血管等。骨修复过程中愈合区形成骨膜在骨修复、重建中发挥十分重要的作用，骨膜形成层中的间充质干细胞分化促进骨发生和皮质骨形成，骨髓干细胞则主要分化为骨髓骨组织。目前，临床上采取诱导骨膜的方式进行骨修复，效果较好，但临床可使用的人工骨膜较少，主要为矿化胶原蛋白膜，矿化胶原蛋白膜存在机械性能差，湿润后力学性质会显著改变的问题，从而导致手术期溃散的风险及降解速率过快等不利影响。且现有的人工骨膜的结晶度较高，而结晶度低的人工骨膜有利于HA在体内的降解，可提高成骨细胞活性，刺激干细胞的成骨分化。

因此，如何制备一种降解速率适中、具备良好的生物相容性、以及结晶度低的共组装人工骨膜，成为亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种共组装人工骨膜及其制备方法，所述共组装人工骨膜具备良好的生物相容性，优异的力学性能及有序可控的降解性能，且含硅羟基磷灰石具备较低的结晶度，可提高成骨细胞活性，刺激干细胞的成骨分化。

为了实现上述目的，本发明的目的之一在于提供一种共组装人工骨膜，所述共组装人工骨膜包括：

由胶原蛋白介导的掺硅羟基磷灰石溶胶和丝素蛋白共组装制备得到的胶原蛋白/掺硅羟基磷灰石/丝素蛋白共组装人工骨膜；

和/或：

由丝素蛋白介导的掺硅羟基磷灰石溶胶和胶原蛋白共组装制备得到的丝素蛋白/掺硅羟基磷灰石/胶原蛋白共组装人工骨膜。

进一步地，所述共组装人工骨膜的组成成分包括：丝素蛋白、掺硅羟基磷灰石、胶原蛋白，所述丝素蛋白、掺硅羟基磷灰石、胶原蛋白的质量比为1～4：2～4：1～4。

进一步地，所述掺硅羟基磷灰石中硅质量占所述掺硅羟基磷灰石质量的0.4％～1.6％。

进一步地，所述共组装人工骨膜的厚度为200um～1000um，孔隙率为50％～80％。

本发明的目的之二在于提供一种共组装人工骨膜的制备方法，所述制备方法包括：

获得胶原蛋白介导的掺硅羟基磷灰石溶胶、丝素蛋白介导的掺硅羟基磷灰石溶胶；

获得丝素蛋白，并将所述丝素蛋白配制成丝素蛋白溶液；获得胶原蛋白并将所述胶原蛋白配制成胶原蛋白溶液；

获得共组装溶液，所述共组装溶液包括：将所述胶原蛋白介导的掺硅羟基磷灰石溶胶与所述丝素蛋白溶液混匀，获得的第一共组装溶液；和将所述丝素蛋白介导的掺硅羟基磷灰石溶胶与胶原蛋白溶液混匀，获得的第二共组装溶液；

将所述共组装溶液经冷冻、冷冻干燥，获得共组装膜；

将所述共组装膜进行交联，获得交联物；

将所述交联物经真空干燥、压缩，获得所述共组装人工骨膜。

进一步地，所述胶原蛋白溶液中胶原蛋白的质量浓度为0.5％～10％，所述丝素蛋白溶液中丝素蛋白的质量浓度为10％～20％。

进一步地，所述共组装溶液包括：

将所述丝素蛋白介导的掺硅羟基磷灰石溶胶与所述胶原蛋白溶液混合，调节pH至6.5～7.5，搅拌混匀，获得的第一共组装溶液；

或者将所述胶原蛋白介导的掺硅羟基磷灰石溶胶与所述丝素蛋白溶液混合，调节pH至6.5～7.5，搅拌混匀，获得的第二共组装溶液。

进一步地，所述获得丝素蛋白介导的掺硅羟基磷灰石溶胶，包括：

获得丝素蛋白溶液、磷源溶液，钙源溶液、硅源；

将所述丝素蛋白溶液与磷源溶液的混合，获得丝素蛋白-含磷溶液；

将所述钙源溶液与所述硅源混合，获得钙硅溶液；

将所述丝素蛋白-含磷溶液滴加到所述钙硅溶液中，调节pH值至7.4，持续反应一段时间，停止搅拌，静置，收集沉淀，再经洗涤、离心后，获得丝素蛋白介导的掺硅羟基磷灰石溶胶。

进一步地，所述获得胶原蛋白介导的掺硅羟基磷灰石溶胶，包括：

获得胶原蛋白溶液、钙源溶液、硅源、磷源溶液；

将所述胶原蛋白溶液与所述钙源溶液的混合，获得胶原蛋白-含钙溶液；

将所述含胶原蛋白-含钙溶液与硅源混合，获得胶原蛋白-钙硅溶液；

将所述磷源溶液滴加到所述胶原蛋白-钙硅溶液，调节pH值至7.4，持续反应一段时间，停止搅拌，静置，收集沉淀，再经洗涤、离心后，获得胶原蛋白介导的掺硅羟基磷灰石溶胶。

进一步地，所述将所述共组装溶液经冷冻、冷冻干燥，获得共组装膜，包括：

将所述共组装溶液在-20℃～-60℃下冷冻2h～4h；后在真空度为1Pa～50Pa、温度为-40℃～-60℃的条件下冷冻干燥24h～48h。

进一步地，所述将所述共组装膜进行交联，获得交联物，包括：

将所述共组装膜采用气态交联，以戊二醛作为交联剂，在温度为30℃～37℃，戊二醛蒸汽浓度为2％～10％的条件下气态交联2h～8h，获得交联物。

进一步地，所述搅拌混匀的条件为：搅拌速度为50rpm～200rpm、温度为20℃～40℃、搅拌时间为6h～12h；所述真空干燥的条件为：真空度为10Pa～100Pa，温度为20℃～40℃，时间为12h～24h；所述的压缩条件为：压力为10Mpa～40Mpa，时间为10s～30s。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

1、本发明提供的一种共组装人工骨膜，包括：

在胶原蛋白介导的掺硅羟基磷灰石溶胶Col-SiHAp的基础上加入丝素蛋白SF共组装制备得到的胶原蛋白/掺硅羟基磷灰石/丝素蛋白Col-SiHAp-SF，比胶原蛋白介导的掺硅羟基磷灰石Col-SiHAp的结晶度更低；

在丝素蛋白介导的掺硅羟基磷灰石溶胶SF-SiHAp的基础上加入胶原蛋白Col共组装制备得到的丝素蛋白/掺硅羟基磷灰石/胶原蛋白共组装人工骨膜SF-SiHAp-Col，比丝素蛋白介导的掺硅羟基磷灰石溶胶SF-SiHAp的结晶度更低；

而结晶度低有利于HA在体内的降解，可提高成骨细胞活性，刺激干细胞的成骨分化。

2、本发明提供的一种共组装人工骨膜，所述共组装人工骨膜为丝素蛋白/掺硅羟基磷灰石/胶原蛋白共组装人工骨膜，通过向胶原蛋白介导的掺硅羟基磷灰石加入丝素蛋白共组装改变其二级结构，改善胶原-掺硅羟基磷灰石力学性能，降解时间等，具有有序多孔空间结构，是一种优选的骨组织缺损修复材料；或者通过向丝素介导的掺硅羟基磷灰石加入胶原蛋白共组装改变其二级结构，改善丝素-掺硅羟基磷灰石力学性能，降解时间等，具有有序多孔空间结构。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图得到其它的附图。

图1为本发明的共组装人工骨膜骨膜实物图；

图2为本发明的共组装人工骨膜(SF-SiHAp-Col或Col-SiHAp-SF)SEM图；

图3为对比例2制备得到的SF-SiHAp骨粉；

图4为对比例1制备得到的Col-SiHAp骨粉；

图5为实施例2制备得到的SF-SiHAp-Col骨膜；

图6为实施例1制备得到的Col-SiHAp-SF骨膜；

图7为实施例1、实施例2、对比例1、对比例2的骨膜、以及掺硅羟基磷灰石的XRD图谱。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：

为实现上述目的，本实施例提供一种共组装人工骨膜，所述共组装人工骨膜包括：

由胶原蛋白介导的掺硅羟基磷灰石溶胶和丝素蛋白共组装制备得到的丝素蛋白/掺硅羟基磷灰石/胶原蛋白共组装人工骨膜；

和/或：

由丝素蛋白介导的掺硅羟基磷灰石溶胶和胶原蛋白共组装制备得到的胶原蛋白/掺硅羟基磷灰石/丝素蛋白共组装人工骨膜。

即所述共组装人工骨膜依次连接包括丝素蛋白/掺硅羟基磷灰石/胶原蛋白共组装人工骨膜(SF-SiHAp-Col)与胶原蛋白/掺硅羟基磷灰石/丝素蛋白共组装人工骨膜(Col-SiHAp-SF)两种。所述的Col-SiHAp-SF(Col-SiHAp-SF)共组装人工骨膜中Col-SF具有稳定的蛋白质二级结构。图5为实施例2制备得到的SF-SiHAp-Col骨膜；图6为实施例1制备得到的Col-SiHAp-SF骨膜；从基础表征上证明，Col-SiHAp-SF的成膜效果好于SF-SiHAp-Col的成膜效果。

本申请人发现SF-SiHAp-Col共组装人工骨膜、或Col-SiHAp-SF共组装人工骨膜，相比于丝素蛋白介导的掺硅羟基磷灰石SF-SiHAp、或胶原蛋白介导的掺硅羟基磷灰石Col-SiHAp的结晶度大大降低，羟基磷灰石结晶度降低，有利于植入后在体内降解，可促进成骨细胞活性，刺激干细胞成骨分化。

所述共组装人工骨膜为丝素蛋白/掺硅羟基磷灰石/胶原蛋白共组装人工骨膜，通过向胶原蛋白介导的掺硅羟基磷灰石加入丝素蛋白共组装改变其二级结构，改善胶原-掺硅羟基磷灰石力学性能，降解时间等，具有有序多孔空间结构，是一种优选的骨组织缺损修复材料；或者通过向丝素介导的掺硅羟基磷灰石加入胶原蛋白共组装改变其二级结构，改善丝素-掺硅羟基磷灰石力学性能，降解时间等，具有有序多孔空间结构。

(1)该人工骨膜具有与天然骨膜相似的结构，具备良好的力学性能和生物相容性，Col-SF共组装形成稳定的蛋白二级结构以及交联固定，可有效改善力学性能和防止人工骨膜过快降解，且该人工骨膜可实现有序可控的降解调控；人体骨膜仿生的组成和结构、活性硅元素添加，覆盖缺损区使完整性改善，可提高骨缺损区的骨生物活性和促进骨缺损区骨膜的修复；交联工艺改善降解速率和力学性能，还可以有效降低动物源性性原料的免疫原性和脱病毒率，可提高动物源植入产品的使用安全性；(2)且含硅羟基磷灰石具备较低的结晶度，有利于含硅羟基磷灰石HA在体内的降解，可提高成骨细胞活性，刺激干细胞的成骨分化；(3)采用制备胶原-掺硅羟基磷灰石溶胶或丝素蛋白-掺硅羟基磷灰石溶胶的方式解决了含硅羟基磷灰石，丝素蛋白，胶原蛋白三者共混后不易成型，难以共组装等缺点。

本发明经过烧结后发现SF-SiHAp-Col(Col-SiHAp-SF)骨膜Si-HAp占49％，48％，符合预期加入值。硅能促进I型胶原的合成和成骨细胞的分化，还能促进骨损伤部位的骨修复；生物体内的骨矿化需要少量的可溶性硅；Si缺乏可能会导致异常骨的形成；在骨骼和软骨中，Si在结缔组织的代谢中可能起着重要作用；纯羟基磷灰石与自然骨组织和骨成形细胞反应性低，导致骨整合速度较慢，在加入硅后可赋予足够活性。

优选地，所述掺硅羟基磷灰石中硅含量为0.4％～1.6％；所述掺硅羟基磷灰石中硅质量占所述掺硅羟基磷灰石质量的0.4％～1.6％，是基于晶胞参数与生物学活性的考量，Si以SiO₄ ^4-形式取代羟基磷灰石中PO₄ ^3-，SiO₄ ^4-四面体结构大于PO₄ ³，在空间结构上对羟基磷灰石产生了一定影响。

优选地，所述丝素蛋白、掺硅羟基磷灰石、胶原蛋白的质量比为1～4：2～4：1～4；将所得的人工骨膜经过热重烧结，胶原或者丝素蛋白会在800℃分解，剩下的就是羟基磷灰石，所述将丝素蛋白、掺硅羟基磷灰石、胶原蛋白的质量比控制在1～4：2～4：1～4的范围内是为了保证膜的成型，同时可使羟基磷灰石含量可达最大化，减少丝素蛋白与胶原蛋白使用，降低成本。丝素比例增多，骨膜降解慢。

优选的比例范围为：丝素蛋白、掺硅羟基磷灰石、胶原蛋白的质量比为1～2：3～4：2～4；降解速率更适中，一周后降解55％～72％。

优选地，所述共组装人工骨膜的厚度为200um～1000um，孔隙率为50％～80％。

所述共组装人工骨膜的厚度为200um～1000um，该厚度有利于植入，匹配人体骨膜厚度；孔隙率为50％～80％则有利于血管中营养物质输入。

本发明实施例中胶原选用为去端肽I型胶原，丝素蛋白选用桑蚕丝素(SF)。

本发明实施例还提供了所述共组装人工骨膜的制备方法，包括：

步骤1、获得共组装溶液，具体可包括两种方案：

方案一：

获得丝素蛋白溶液、磷源溶液，钙源溶液、硅源；

将所述丝素蛋白溶液与磷源溶液的混合，获得丝素蛋白-含磷溶液；

将所述钙源溶液与所述硅源混合，获得钙硅溶液；

将所述丝素蛋白-含磷溶液滴加到所述钙硅溶液中，调节pH值至7.4，持续反应一段时间，停止搅拌，静置，收集沉淀，再经洗涤、离心后，获得丝素蛋白介导的掺硅羟基磷灰石溶胶(简称SF-SiHAp溶胶)；

将所述丝素蛋白介导的掺硅羟基磷灰石溶胶与所述胶原蛋白溶液搅拌混合，调节pH至6.5～7.5，获得共组装溶液(简称SF-SiHAp-Col共组装溶液)。

方案二：获得胶原蛋白溶液、钙源溶液、硅源、磷源溶液；

将所述胶原蛋白溶液与所述钙源溶液的混合，获得胶原蛋白-含钙溶液；

将所述含胶原蛋白-含钙溶液与硅源混合，获得胶原蛋白-钙硅溶液；

将所述磷源溶液滴加到所述胶原蛋白-钙硅溶液，调节pH值至7.4，持续反应一段时间，停止搅拌，静置，收集沉淀，再经洗涤、离心后，获得胶原蛋白介导的掺硅羟基磷灰石溶胶(简称Col-SiHAp溶胶)；

将所述胶原蛋白介导的掺硅羟基磷灰石溶胶与所述丝素蛋白溶液搅拌混合，调节pH至6.5～7.5，获得共组装溶液(简称Col-SiHAp-SF共组装溶液)。

如何将胶原蛋白介导的掺硅羟基磷灰石溶胶和丝素蛋白共组装、将丝素蛋白介导的掺硅羟基磷灰石溶胶和胶原蛋白进行共组装，也成为本发明的一大难点。

如果仅仅将含硅羟基磷灰石，丝素蛋白，胶原蛋白三者简单共混，会使得不易成型，难以共组装。目前的丝素蛋白研究均采用大量有机溶剂促进其成型，且难以共组装成有序的空间结构。

本发明人发现先制得胶原蛋白介导的掺硅羟基磷灰石溶胶或、丝素蛋白介导的掺硅羟基磷灰石溶胶；再将所述胶原蛋白介导的掺硅羟基磷灰石溶胶与所述丝素蛋白溶液搅拌混合，或者将所述丝素蛋白介导的掺硅羟基磷灰石溶胶与所述胶原蛋白溶液搅拌混合，调节pH至6.5～7.5，获得共组装溶液，经后续步骤2-4组装后，能够得到成功组装的人工骨膜；

所述步骤中之所以将pH控制在6.5～7.5是为了胶原蛋白介导的掺硅羟基磷灰石溶胶与胶原蛋白共组装，若pH小于6.5会导致胶原蛋白介导的掺硅羟基磷灰石溶胶分解，若pH大于7.5则会导致胶原变性。

步骤2、将所述共组装溶液在-20℃～-60℃下冷冻2h～4h；后在温度为-40℃～-60℃、真空度为1Pa～50Pa的条件下冷冻干燥24h～48h；

该条件下有利于骨膜最终成型，温度大于-20℃时冻干样品会导致骨膜最终形成后存在裂痕，低于-60℃条件难以满足。

冷冻干燥选用-40℃～-60℃、真空度为1Pa～50Pa的条件下冷冻干燥24h～48h为通用冻干除水条件。

步骤3、将所述共组装膜采用气态交联，以戊二醛作为交联剂，在温度为30℃～39℃，戊二醛蒸汽浓度为2％～10％的条件下交联2h～8h，获得交联物；

选用气态交联，以戊二醛作为交联剂的优点，选用温度为37℃～52℃的原因：其中气态交联可以(1)减少戊二醛对操作人员可能带来的伤害；(2)减少交联后戊二醛在骨膜内残留；(3)选用戊二醛是由于戊二醛是目前最安全的交联剂之一；而温度选用30℃～39℃，这个温度区间既有利于戊二醛形成气态，亦能保证胶原不变性(胶原变性温度为40℃)。

步骤4、将所述交联物经真空干燥、压缩，获得所述共组装人工骨膜，所述真空干燥的条件为：温度为20℃～40℃，真空度为10Pa～100Pa，时间为12h～24h；压缩条件为：压力10～40Mpa，时间为10～30s。

所述真空干燥条件选择是由于该条件既能除去残留戊二醛，也能保证胶原不变性，压缩条件选择是通过实验发现该条件下可以使膜厚度满足要求。

下面将结合实施例及实验数据对本申请的一种共组装人工骨膜及其制备方法进行详细说明。

实施例1Col-SiHAp-SF共组装人工骨膜

步骤1、称取1g去端肽I型胶原，于0.2L0.5mol/L的乙酸溶液中完全溶解，37℃水浴；加入0.11g正乙酸硅固体，搅拌水解4h；称取3.52g四水硝酸钙溶解于Col-硅水解溶液中，搅拌速度100rpm下混合3h，调节溶液pH为7.4左右，制备成胶原-钙-硅溶液(Col-Ca-Si)；称取1.12g磷酸氢二氨溶解于0.2L纯化水中，向Col-Ca-Si溶液中缓慢滴加磷酸氢二铵溶液，保持体系pH＝7.4左右，反应体系温度通过水浴控制在37℃，磷酸二氢铵胶原溶液滴加速度为2～3ml/min，搅拌速度为100rpm；磷盐滴加完毕后继续搅拌3h，保持体系pH＝7.4左右，37℃静置陈化4h；陈化后倒掉上清液，将沉淀洗涤至中性，4000rpm下离心得到Col-SiHAp溶胶。

步骤2、取1g丝素蛋白制备质量浓度10％的丝素溶液(SF)；

步骤3、取Col-SiHAp溶胶和10ml10％(wt)的SF溶液进行混合，调节pH＝7，50rpm进行混合3h，静置12h；

步骤4、共混、静置的Col-SiHAp-SF溶液倒入到方形平皿中，液体厚度约0.8cm，-40℃超低温冰箱中预冻2h；

步骤5、预冻好的Col-SiHAp-SF进行冷冻干燥，冷阱温度-40～-60℃，真空度<50Pa，冻干时间36h；

步骤6、冻干的Col-SiHAp-SF进行气态交联，交联剂为浓度为4％戊二醛溶液，交联条件：37℃，交联2h；

步骤7、交联的Col-SiHAp-SF共组装人工骨膜进行真空干燥，除去残留的戊二醛，真空干燥条件为：37℃，30～50Pa，干燥时间48h。在20MPa下压缩20s得到Col-SiHAp-SF共组装人工骨膜厚度约200um。

实施例2SF-SiHAp-Col共组装人工骨膜

步骤1、称取1g丝素，于18mL9.3mol/L的溴化锂溶液中完全溶解，透析，离心；取少量上清液烘干后计算浓度为8％；取12.5g上述SF溶液，加入0.1L水稀释；称取1.12g磷酸氢二氨溶解于SF溶液中，制备成磷-丝素(P-SF)溶液；称量0.11g正乙酸硅固体于0.2L纯化水搅拌水解3～5h后加入3.52g四水硝酸钙，继续搅拌3h，调节溶液pH为7.4左右，制备成钙-硅溶液(Ca-Si)；P-SF溶液温度通过水浴控制在37℃，100rpm搅拌，将Ca-Si溶液滴加到P-SF溶液中，滴加速度为2～3ml/min，保持体系pH＝7.4左右；滴加完毕后继续搅拌3h，保持体系pH＝7.4左右，37℃静置陈化4h；陈化完成后倒掉上清液，将沉淀洗涤至中性，4000rpm下离心得到SF-SiHAp溶胶；

步骤2、取1g胶原制备质量浓度1％的胶原溶液(Col)，调节pH＝7；

步骤3、取上述SF-SiHAp溶胶和100ml1％(wt)的Col溶液进行混合，调节pH＝7，50rpm进行混合3h，静置12h；

步骤4、共混、静置的SF-SiHAp-Col溶液倒入到方形平皿中，液体厚度约0.8cm，-40℃超低温冰箱中预冻2h；

步骤5、预冻好的SF-SiHAp-Col进行冷冻干燥，冷阱温度-40～-60℃，真空度<50Pa，冻干时间36h；

步骤6、冻干的SF-SiHAp-Col进行气态交联，交联剂为浓度为10％戊二醛溶液，交联条件：37℃，交联4h；

步骤7、交联的SF-SiHAp-Col共组装人工骨膜进行真空干燥，除去残留的戊二醛，真空干燥条件为：37℃，30～50Pa，干燥时间48h。在20MPa下压缩20s得到Col-SiHAp-SF共组装人工骨膜厚度约200um。

实施例3-实施例4

该实施例中除丝素蛋白、掺硅羟基磷灰石、胶原蛋白的质量比不同外，其余步骤均同实施例1，具体如表1所示。

对比例1Col-SiHAp骨粉

称取1g去端肽I型胶原，于0.2L0.5mol/L的乙酸溶液中完全溶解，37℃水浴；加入0.11g正乙酸硅固体，搅拌水解4h；称取3.52g四水硝酸钙溶解于Col-硅水解溶液中，搅拌速度100rpm下混合3h，调节溶液pH为7.4左右，制备成胶原-钙-硅溶液(Col-Ca-Si)；称取1.12g磷酸氢二氨溶解于0.2L纯化水中，向Col-Ca-Si溶液中缓慢滴加磷酸氢二铵溶液，保持体系pH＝7.4左右，反应体系温度通过水浴控制在37℃，磷酸二氢铵胶原溶液滴加速度为2～3ml/min，搅拌速度为100rpm；磷盐滴加完毕后继续搅拌3h，保持体系pH＝7.4左右，37℃静置陈化4h；陈化后倒掉上清液，将沉淀洗涤至中性，4000rpm下离心得到Col-SiHAp溶胶。随后冷冻干燥所得粉末即为Col-SiHAp粉末。

对比例2SF-SiHAp骨粉

称取2g丝素，于18mL9.3mol/L的溴化锂溶液中完全溶解，透析，离心；取少量上清液烘干后计算浓度为8％；取12.5g上述SF溶液，加入0.1L水稀释；称取1.12g磷酸氢二氨溶解于SF溶液中，制备成磷-丝素(P-SF)溶液；称量0.11g正乙酸硅固体于0.2L纯化水搅拌水解3～5h后加入3.52g四水硝酸钙，继续搅拌3h，调节溶液pH为7.4左右，制备成钙-硅溶液(Ca-Si)；P-SF溶液温度通过水浴控制在37℃，100rpm搅拌，将Ca-Si溶液滴加到P-SF溶液中，滴加速度为2～3ml/min，保持体系pH＝7.4左右；滴加完毕后继续搅拌3h，保持体系pH＝7.4左右，37℃静置陈化4h；陈化完成后倒掉上清液，将沉淀洗涤至中性，4000rpm下离心得到SF-SiHAp溶胶；后冷冻干燥所得粉末即为SF-SiHAp粉末。

对比例3-4

该对比例3-4中除丝素蛋白、掺硅羟基磷灰石、胶原蛋白的质量比不同外，其余步骤均同实施例1，具体如表1所示。

对比例5

该对比例为市面上胶原矿化骨膜。

对比例6

该对比例将含硅羟基磷灰石，丝素蛋白，胶原蛋白三者直接共混，结果不能共组装，难以成型。

试验例1

经SEM，FT-IR，XRD检测，可证明实施案例1，2中SF-SiHAp-Col(Col-SiHAp-SF)骨膜具有微孔结构，均存在蛋白质稳定结构--β-sheet，红外图谱中1641cm^-1，1531cm^-1两峰(α-螺旋，无规卷曲红外特征峰)转变为1621cm^-1，1517cm-1(β-折叠红外特征峰)，且均具有硅酸根特征吸收峰(875cm^-1)，说明SiO₄ ^-进入羟基磷灰石晶格中；通过XRD表征发现，羟基磷灰石结晶度较低，这是由于胶原与丝素蛋白影响；经过烧结后发现SF-SiHAp-Col(Col-SiHAp-SF)骨膜Si-HAp占49％，48％，符合预期加入值。具体地：

图1为本发明实施例1/实施例2的共组装人工骨膜骨膜实物图，由图1可知，本发明成功制备得到该共组装人工骨膜。

图2为本发明的实施例1/实施例2骨膜SEM谱图，由图2可知骨膜表面光滑且存在多孔结构，孔隙率为70％。

图3为对比例2制备得到的SF-SiHAp骨膜；图4为对比例1制备得到的Col-SiHAp骨膜；图5为实施例2制备得到的SF-SiHAp-Col骨膜；图6为实施例1制备得到的Col-SiHAp-SF骨膜；可知实施例1的Col-SiHAp-SF骨膜和实施例2的SF-SiHAp-Col骨膜具有微孔结构，均存在蛋白质稳定结构--β-sheet，红外图谱中1641cm^-1，1531cm^-1两峰(α-螺旋，无规卷曲红外特征峰)转变为1621cm^-1，1517cm^-1(β-折叠红外特征峰)，且均具有硅酸根特征吸收峰(875cm^-1)，说明SiO₄ ^-进入羟基磷灰石晶格中，表明本发明的实施例1-2成功制备得到共组装人工骨膜。

图7为实施例1、实施例2、对比例1、对比例2的骨膜、以及掺硅羟基磷灰石的XRD图谱，通过XRD表征发现，相比于对比例1-2的骨膜，本发明实施例1-2的骨膜的图谱的结晶度较低(一般来说XRD图中背底越小，衍射峰的强度越高，衍射峰越尖锐即半高宽越小，结晶越好)；而结晶度低有利于HA在体内的降解，可提高成骨细胞活性，刺激干细胞的成骨分化。

经过烧结后发现实施例1的Col-SiHAp-SF骨膜和实施例2的SF-SiHAp-Col骨膜中Si-HAp占49％，48％，符合预期加入值。

试验例2原料质量比对共组装人工骨膜的影响

将丝素蛋白、掺硅羟基磷灰石、胶原蛋白的质量比设置在不同的范围，其余步骤均同实施例1，探索丝素蛋白、掺硅羟基磷灰石、胶原蛋白的质量比共组装人工骨膜的降解性能，同目前市面上胶原矿化骨膜产品对比。

表1

组别	丝素蛋白、掺硅羟基磷灰石、胶原蛋白的质量比	骨膜降解速度
			实施例1	2：3：2	一周后降解55％
实施例2	2：3：2	一周后降解57％
			实施例3	1：4：4	一周后降解72％
实施例4	4：2：1	一周后降解35％
			对比例3	5：2：1	一周后降解26％
对比例4	4：2：5	一周后降解34％
			对比例5	市面上胶原矿化骨膜	2天后完全降解

由表2的数据可知：

对比例3中，与实施例4相比，丝素蛋白比例增多，导致骨膜降解减慢，降解速度过慢。

对比例4中，与实施例4相比，胶原蛋白比例增多，骨膜降解速度虽变化不大，但强度会降低。

对比例5中未加入丝素蛋白的市面上胶原矿化骨膜，2天后完全降解，降解速度过快。

本发明实施例1-4中将丝素蛋白、掺硅羟基磷灰石、胶原蛋白的质量比控制在1～4：2～4：1～4，人工骨膜降解性能适中，降解性能得到大大改善，可实现有序，可控的降解。

综上可知，本发明提供的一种共组装人工骨膜及其制备方法，所述共组装人工骨膜具备良好的生物相容性，能够实现有序可控的降解且含硅羟基磷灰石具备较低的结晶度，可提高成骨细胞活性，刺激干细胞的成骨分化，此外，本发明制备方法解决了含硅羟基磷灰石，丝素蛋白，胶原蛋白三者共混后不易成型，难以共组装等缺点。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。