替罗非班降解杂质及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 替罗非班降解杂质及其制备方法和应用 (Tirofiban degradation impurity and preparation method and application thereof ) 是由 王芝 蔡一聪 秦巨波 刘孟 于艳春 于 2021-06-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及制药技术领域,具体而言,本发明涉及一种替罗非班降解杂质Ⅰ及其制备方法和应用。本发明发现一种新的替罗非班降解杂质,通过测定该替罗非班降解杂质在替罗非班注射液中的含量,以确定所述替罗非班注射液的质量是否达标,从而实现对替罗非班注射液的质量控制。(The invention relates to the technical field of pharmacy, in particular to a tirofiban degradation impurity I and a preparation method and application thereof. The invention finds a new tirofiban degradation impurity, and determines whether the quality of the tirofiban injection reaches the standard or not by measuring the content of the tirofiban degradation impurity in the tirofiban injection, thereby realizing the quality control of the tirofiban injection.)
技术领域
本发明涉及制药技术领域，具体而言，本发明涉及一种替罗非班降解杂质及其制备方法和应用。
背景技术
替罗非班(Tirofiban)，别名替洛非巴，化学名称N-(丁基磺酰基)-O-[4-(4-哌啶基)丁基]-L-酪氨酸，分子式为C22H36N2O5S，由美国默克公司研发，1998年在美国上市，2004年8月在中国获批上市。替罗非班为抗血小板药，临床上主要用于冠脉缺血综合征患者行冠脉血管成形术或冠脉内斑块切除术，以防治相关的心脏缺血并发症；也用于不稳定性心绞痛或非Q波型心肌梗死患者(与肝素或阿司匹林联用)，预防心脏缺血事件的发生。目前临床上使用的药品主要是盐酸替罗非班注射液，是一种可逆性非肽类血小板表面糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅱa受体拮抗剂，可竞争性抑制纤维蛋白原和血小板(GP)Ⅱb/Ⅱa受体的结合。静脉注射，可剂量依赖性地抑制ADP、胶原、花生四烯酸、血栓烷类似物U46619和凝血酶引起的人体外血小板聚集、延长出血时间、抑制血栓形成。
注射液在制备、存放过程中可能会产生降解杂质，不仅影响主药的含量，还会降低药物疗效并有可能造成毒副作用。因此，对可能产生的降解杂质进行研究具有重要意义。目前，盐酸替罗非班注射液相关的标准为盐酸替罗非班注射液进口注册标准(JX20080265)，但其中关于由于存放或环境条件变化而产生的降解杂质类型报道较少，同时国内外药典尚未收载替罗非班及其杂质。国际通行的人用药品注册技术要求国际协调会议(ICH)要求严格限定药物杂质含量。ICH要求研究人员对药物在制备、存放过程中客观存在的和潜在降解杂质进行充分评估，这样更应该充分研究药物中杂质，严格控制含量。目前替罗非班降解杂质研究尚不充分，尤其是毒性较高，危害较大的降解杂质研究不充分，例如基因毒性杂质，其在很低的含量即可对身体造成伤害，因此可能引起毒副作用。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于在替罗非班的制备过程中，发现一种新的替罗非班降解杂质，并提供该替罗非班降解杂质的制备方法。利用制备的式Ⅰ所示化合物作为替罗非班产品检测的杂质标准品，有利于该替罗非班降解杂质的定量和定性，提高对替罗非班产品原料药的质量控制。
为此本发明第一方面提供一种化合物。根据本发明的实施例，所述化合物结构式为式Ⅰ所示化合物：
替罗非班注射液在制备、存放过程中可能会产生降解杂质，不仅影响主药的含量，还会降低药物疗效并有可能造成毒副作用。因此，对可能产生的降解杂质进行研究具有重要意义。但目前关于由于存放或环境条件变化而产生的降解杂质类型报道较少，由于注射液在使用前需要进行高温灭菌处理，发明人发现在高温处理之后，替罗非班注射液会发生降解并形成一种新的杂质，即式Ⅰ所示化合物。
本发明第二方面提供一种替罗非班注射液的质量控制方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：
测定替罗非班注射液中第一方面所述化合物的含量；
基于所述化合物的含量，确定所述替罗非班注射液的质量是否达标。
通过测定式Ⅰ所示化合物的含量，能够确定替罗非班注射液在存放过程中或者在高温处理之后，降解产生的式Ⅰ所示杂质的含量，将该含量与预定的杂质含量阈值进行比较，从而确定该替罗非班注射液的质量是否达标。
根据本发明的实施例，所述测定是采用高效液相色谱法进行的。由此，以便提高检测准确性和检测效率。
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱法采用的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为NH4HCO3溶液，所述流动相B为乙腈。
由此，以便将化合物(简称杂质A)与替罗非班及其他杂质(如3-氯-替罗非班)分离，提高检测准确性。
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱法采用梯度洗脱方式，条件如下：
时间(min)
流动相A(％)
流动相B(％)
0.01
85
15
11.0
55
45
11.2
0
100
13.2
0
100
13.4
85
15
14.4
85
15
。
由此，以便将化合物(简称杂质A)与替罗非班及其他杂质(如3-氯-替罗非班)分离，提高检测准确性。
根据本发明的实施例，所述NH4HCO3溶液的浓度为5-15mM。
根据本发明的实施例，进行高效液相色谱检测时，采用的色谱柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶。
根据本发明的实施例，所述色谱柱的柱温为25-35℃。
根据本发明的实施例，所述流动相的流速为20-30ml/min。
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱法中检测波长为200-280nm。
本发明第三方面提供一种制备第一方面所述的化合物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：
(1)将盐酸替罗非班与盐酸混合，得到降解溶液；
(2)将所述降解溶液进行加热处理，得到含有第一方面所述化合物的溶液；
(3)将所述含有第一方面所述化合物的溶液利用高效液相色谱法进行分离，收集含有第一方面所述化合物的流分。
替罗非班注射液在制备、存放过程中可能会产生降解杂质，不仅影响主药的含量，还会降低药物疗效并有可能造成毒副作用。因此，通过将盐酸替罗非班与盐酸混合后，以便于盐酸替罗非班强制降解，从而便于研究降解杂质对药物体系的影响。进一步地，由于注射液在使用前需要进行高温灭菌处理，所以，将上述第一降解溶液进行相应的加热处理，可以得到式I所示化合物。
根据本发明的实施例，所述加热处理的温度为80-100℃，时间为180-360min。
由此，以便于充分杀死有害菌，提高药物的使用安全性，延长保质期。
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱采用的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为NH4HCO3溶液，所述流动相B为乙腈。
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱法采用梯度洗脱方式，条件如下：
时间(min)
流动相A(％)
流动相B(％)
0.01
85
15
11.0
55
45
11.2
0
100
13.2
0
100
13.4
85
15
14.4
85
15
。
根据本发明的实施例，所述NH4HCO3溶液的浓度为5-15mM；
根据本发明的实施例，进行高效液相色谱检测时，采用的色谱柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶。
根据本发明的实施例，所述色谱柱的柱温为25-35℃。
根据本发明的实施例，所述流动相的流速为20-30ml/min。
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱法中检测波长为200-280nm。
根据本发明的实施例，进行所述加热处理之前，将所述降解溶液进行浓缩处理。由此，以便提高杂质含量。
根据本发明的实施例，利用所述高效液相色谱法进行分离之前，将所述含有第一方面所述化合物的溶液进行如下处理：
调节所述含有第一方面所述化合物的溶液的pH值至6-8，并采用乙酸乙酯进行萃取处理，获得乙酸乙酯层和水层；
将所述乙酸乙酯层进行浓缩，得到浓缩物，用乙腈水溶液溶解所述浓缩物，得到上样液；
分别将所述上样液和水层进行高效液相色谱分离，收集含有所述化合物的流分。
根据本发明的实施例，所述盐酸替罗非班与盐酸的体积比为1：0.5-1：2。
根据本发明的实施例，所述盐酸的浓度为1-3M。
根据本发明的实施例，所述盐酸替罗非班的浓度为0.05-0.3mg/ml。
本发明第四方面提供第一方面所述的化合物和/或第三方面所述的方法制备的化合物对盐酸替罗非班原料药或注射液进行质量控制中的用途。根据本发明的实施例，利用所述化合物作为标准品对替罗非班原料药或注射液中所述式Ⅰ所示化合物进行分析，以便对所述替罗非班原料药及注射液进行质量控制。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了实施例1中杂质的HPLC结果，其中MS262制备样品通过实施例1中方法(1)和方法(2)都可以得到；
图2显示了实施例1中杂质的HRMS结果。
具体实施方式
根据本发明的一个具体的实施方案，本发明提供制备式Ⅰ所示化合物的方法，包括：
(1)将盐酸替罗非班与盐酸混合，得到降解溶液；
(2)将所述降解溶液进行加热处理，得到含式Ⅰ所示化合物的溶液；
(3)将所述含式Ⅰ所示化合物的溶液利用高效液相色谱法进行分离，收集含有权利要求1所述化合物的流分。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述加热处理的温度为80-100℃，时间为180-360min。
根据本发明的一个具体的实施方案，高效液相色谱检测条件如下：
式Ⅰ所示化合物结构如下：
根据本发明的一个具体的实施方案，利用所述高效液相色谱法进行分离之前，将所述含有式Ⅰ所示化合物的溶液进行如下处理：
调节所述含有式Ⅰ所示化合物的溶液的pH值至6-8，并采用乙酸乙酯进行萃取处理，获得乙酸乙酯层和水层；
将所述乙酸乙酯层进行浓缩，得到浓缩物，用乙腈水溶液溶解所述浓缩物，得到上样液；
分别将所述上样液和水层进行高效液相色谱分离，收集含有所述化合物的流分。
根据本发明的一个具体的实施方案，所述盐酸替罗非班与盐酸的体积比为1：0.5-1：2；
所述盐酸的浓度为1-3M；
所述盐酸替罗非班的浓度为0.05-0.3mg/ml。
在本发明中，MS262、杂质A以及替罗非班降解杂质均指结构式为式Ⅰ的化合物。
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1杂质的获取
制备降解溶液：称取盐酸替罗非班样品(原料药，生产单位武汉武药)约250mg，置1升容量瓶中，加水使其完全溶解并稀释至刻度，摇匀。取该溶液5ml置20ml顶空瓶中，加入5ml 2M HCl溶液，摇匀，压盖密封。按照该方式将配制的1L溶液分装至200个20ml顶空瓶中。将顶空瓶在90℃烘箱中放置4h，取出，放冷至室温。然后将所有溶液转移至2L容器中，作为制备用降解溶液。将降解溶液分为两部分，分别采用如下方式(1)和(2)进行处理：
(1)将部分以上降解溶液减压旋蒸，以去除溶液中的部分水分和盐酸。取部分浓缩液，按照下表1中制备分离条件，收集部分目标流分。然后将制备分离所得流分冻干，获得少量杂质样品。
表1 HPLC检测条件
(2)将剩余浓缩液，先采用NaOH调节pH至中性后，再用乙酸乙酯进行萃取。分别收取水层及乙酸乙酯层。对乙酸乙酯层进行减压旋蒸，蒸干后，用适量水和乙腈溶解残渣，用于杂质制备。分别将水层及乙酸乙酯层浓缩处理后的溶液，按照下表2进行分离纯化，收集目标流分。将流分冻干，获得少量杂质样品。
表2 HPLC检测条件
将上述制备所得降解杂质与降解样品HPLC谱图进行对比研究，以确认降解杂质是否制备成功。
实施例2杂质结构鉴定
结合HPLC、HRMS、NMR对实施例1获得的杂质进行结构鉴定。
HPLC检测条件如下表3：
表3
附图1展示了HPLC检测结果，结果表明在实施例1的降解条件下，产生两个降解杂质MS475(3-氯-替罗非班)和MS262，保留时间分别为27.1min及26.6min。可以看出，采用该方法可以有效地分离替罗非班和3-氯-替罗非班。
采用HRMS、NMR对该杂质进行结构鉴定。
HRMS测试条件如下表4：
表4
图2展示了HRMS检测结果，结果表明杂质在高分辨质谱下的分子量为261.1738，分子式C16H23NO2。
NMR测试条件如下表5-7所示，表8为检测结果：
表5
仪器设备
型号
生产厂家
核磁共振仪
Bruker AVANCE NEO 400MHz
Bruker
探头
5mm BBO Probe
Bruker
表6
试剂名称
生产厂家
批号
有效期
DMSO-d<sub>6</sub>
Sigma
STBJ7890
21-Feb-2022
表7
表8
通过核磁共振1D/2D NMR解析，杂质与如下结构相符：
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
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