一种线粒体靶向的神经保护药物tpp-qt及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种线粒体靶向的神经保护药物tpp-qt及其制备方法和应用 (Mitochondria-targeted neuroprotective drug TPP-QT and preparation method and application thereof ) 是由 岑娟 段少峰 崔杰 刘蒙丽 石中奇 于 2021-07-19 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物制药领域,涉及一种神经保护药物,特别是指一种线粒体靶向的神经保护药物TPP-QT及其制备方法和应用。其结构式为：。本申请将QT与TPP拼合成一种新型线粒体靶向药物TPP-QT,通过细胞和动物实验,证明该化合物具有良好的神经保护效果。通过MTT法、流式细胞仪法、倒置荧光显微镜观察、在体实验评价发现,TPP-QT可通过抑制细胞凋亡、促进细胞增殖、对缺血性神经损伤有较好的保护作用。(The invention belongs to the field of biological pharmacy, relates to a neuroprotective drug, and particularly relates to a mitochondrion-targeted neuroprotective drug TPP-QT and a preparation method and application thereof. The structural formula is as follows: . QT and TPP are spliced into a novel mitochondrial targeting drug TPP-QT, and cell and animal experiments prove that the compound has a good neuroprotective effect. Through MTT method, flow cytometry, inverted fluorescence microscope observation and in vivo experimental evaluation, TPP-QT can inhibit apoptosis, promote cell proliferation and regulate cell proliferationThe ischemic nerve injury has better protective effect.)
技术领域
本发明属于生物制药领域，涉及一种神经保护药物，特别是指一种线粒体靶向的神经保护药物TPP-QT及其制备方法和应用。
背景技术
神经细胞是组成神经系统的基本功能单位,是中枢神经系统的主要功能载体，属于高度分化细胞，本身无再生能力。许多疾病都会导致神经细胞的损伤，例如中毒，缺氧、脑中风、退化性疾病等，一般可以归为三类，即氧化应激损伤、兴奋性氨基酸损伤和神经退化性损伤，而且神经细胞严重损伤后往往是不可逆的。脑卒中（cerebralstroke）是一种常见的脑血管疾病，具有高致残率和高致死率的特点，且该病的发病率逐年升高。据调查显示，中国目前罹患中风人数约有1300万，其中缺血性中风患者占80%，中风导致的死亡人数占总死亡人口的20%，且存活患者中有50%～70%的患者留下严重残疾，给家庭及社会带来沉重的负担。目前脑缺血的首选治疗方案是恢复缺血区供血，然而恢复灌注后，过量活性氧的产生、炎症因子的大量募集及细胞异常死亡会进一步加剧神经损伤。神经细胞损伤会伴随严重后果，比如脑梗塞、脑出血、帕金森氏病、脑萎缩等等，严重危害人类健康和生命安全，给个人和社会造成沉重负担。因此，如何最大程度地保护受损神经成为治疗的关键。
目前，临床实践中缺血卒中的治疗方法包括：(1)溶栓治疗；作为唯一被FDA批准的临床溶栓药物，重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)可以降解血栓疏通栓塞血管，从而恢复血流；然而，其短暂的治疗时间窗(中风症状发生后4.5小时内)和潜在引发颅内出血等缺点，即使在发达国家，只有5％缺血性卒中患者受益于溶栓治疗；(2)神经保护治疗；脑缺血引发级联事件，又称"缺血瀑布(ischemiccascade)"，包括缺血发生后能量代谢障碍，细胞去极化和钙离子内流，神经细胞过度兴奋，线粒体受损及诱导凋亡，持续性炎性反应，过量自由基产生，神经细胞水肿及死亡等所造成的破坏性事件；上述事件按时间轴依次发生，彼此重叠且相互递呈，如不及时干预，将导致不可逆神经组织损伤。
业内知悉，神经保护治疗目的是阻止缺血级联事件发展并促进神经组织自我修复，与溶栓治疗相比，神经保护治疗适用于卒中发生前，急性发作期以及后续康复阶段，且无明显治疗时间窗口的限制；因此，神经保护治疗已成为缺血性脑卒中研究最活跃领域之一。
由于线粒体是细胞供能的核心场所更是氧化应激产生的源头位置，因此线粒体靶向给药能较大程度地提高药物的治疗效果，该方向的研究在提高药物精准性方面具有很广泛的前景。如何制备一类可有效保护缺血性损伤神经细胞的药物，一直是本课题组的研究课题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种线粒体靶向的神经保护药物TPP-QT及其制备方法和应用。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种线粒体靶向的神经保护药物TPP-QT，其结构式为：
。
上述的神经保护药物TPP-QT的制备方法，步骤如下：
（1）分别称取4–溴丁酸和三苯基膦置于干燥圆底烧瓶中，加入乙腈经磁力搅拌溶解后继续常温搅拌反应至完全，然后将反应物抽滤，所得固体经干燥后即为（3-羧丙基）三苯基溴化膦；其技术路线为：
；
（2）称取槲皮素与步骤（1）得到的（3-羧丙基）三苯基溴化膦置于干燥圆底烧瓶中，加入无水二甲基亚砜经磁力搅拌溶解后，再加入二氯亚砜，于氮气保护下搅拌反应至完全，反应液经透析、冷冻干燥得三苯基膦-槲皮素，即TPP-QT；其技术路线为：
。
所述步骤（1）中4–溴丁酸和三苯基膦的物质的量比为1:1，干燥的温度为35℃、时间为24h。
所述步骤（2）中槲皮素与（3-羧丙基）三苯基溴化膦的物质的量比为1：1，搅拌反应的温度为60℃、时间为24h。
所述步骤（2）中透析采用的透析袋型号为500Da、透析液为去离子水、透析时间为48h。
上述的神经保护药物TPP-QT在制备透过血脑屏障的保护神经的药物中的应用。
上述的神经保护药物TPP-QT在制备促进神经细胞新生，抑制神经细胞凋亡的药物中的应用。
上述的神经保护药物TPP-QT在制备人SH-SY5Y细胞增殖、生长的药物中的应用，其作用浓度为100µmol/L。
上述的神经保护药物TPP-QT在制备保护大鼠中动脉阻塞模型下的组织损伤、并有效恢复行为学能力的药物中的应用，其作用浓度为3-5mg/kg。
本发明具有以下有益效果：
1、槲皮素(Quercetin,QT)属天然黄酮类物质,与雌激素有着相似的化学结构,具有雌激素样作用，三丙羧基(TPP)三苯基溴化膦 ［ (3-carboxy propyl)triphenylphosph-onium bromide］ 阳离子呈正电荷性质，本申请将QT与TPP拼合成一种新型线粒体靶向药物TPP-QT，通过细胞和动物实验，证明该化合物具有良好的神经保护效果。
2、本申请通过MTT法、流式细胞仪法、倒置荧光显微镜观察、在体实验评价发现，TPP-QT可通过抑制细胞凋亡、促进细胞增殖、对缺血性神经损伤有较好的保护作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为TPP-QT的合成路线图。
图2为QT的1 H-NMR图谱。
图3为TPP的1 H-NMR图谱。
图4为目标产物TPP-QT的1 H-NMR图谱。
图5为TPP-QT对SH-SY5Y细胞的毒性作用及对H2O2诱导的拟缺血损伤的保护作用，其中图A为用MTT法吸光度值分析TPP-QT对SH-SY5Y的毒性作用；图B为用MTT法吸光度值分析TPP-QT对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤保护作用的影响，A：**p≤0.01 vs 对照组；B：##p≤0.01 vs对照组，**p≤0.01 vs模型组。Control为空白对照组，Model为模型组。
图6为倒置荧光显微镜法观察TPP-QT对H2O2诱导的拟缺血损伤对SH-SY5Y细胞的形态学影响。
图7为DAPI染色、倒置荧光显微镜观察TPP-QT对正常SH-SY5Y细胞（A）及拟缺血损伤后(B)细胞的增殖作用。C、D分别为其统计数据，C: **p≤0.01 vs 对照组；D：##p≤0.01vs对照组，**p≤0.01 vs模型组。C为空白对照组，M为模型组。
图8为TPP-QT对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞ROS含量变化的影响，##p≤0.01 vs对照组，**p≤0.01 vs模型组。C为空白对照组，M为模型组。
图9为TPP-QT对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞线粒体膜电位变化的影响，##p≤0.01 vs对照组，**p≤0.01 vs模型组。C为空白对照组，M为模型组。
图10为TPP-QT对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的影响，##p≤0.01 vs对照组，**p≤0.01 vs模型组。C为空白对照组，M为模型组。
图11为大脑中动脉阻塞再灌注法制作急性脑缺血大鼠模型实验时，TPP-QT对大鼠脑梗的改善作用。图A为大鼠TTC染色即脑梗死体积变化图像；图B为大鼠TTC染色后脑梗死体积变化统计图；图C为大鼠行为学评分变化结果统计图，##p≤0.01 vs空白组，**p≤0.01vs模型组。
具体实施方式
本发明所用到的主要实验试剂及仪器设备简要介绍如下：所有试剂购自 SigmaChemical Co .（St .Louis，MO）或Aladin Chemical Reagent Inc . of Shanghai。
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
本实施例的神经保护药物TPP-QT的制备方法，其合成路线如图1所示，具体步骤如下：
（1）（3-羧丙基）三苯基溴化膦的制备：分别称取4–溴丁酸（1.670g，0.01mol）和三苯基膦（TPP）（2.622g，0.01mol）置于放有磁性搅拌子的干燥圆底烧瓶中，加入20ml乙腈搅拌溶解后于常温下继续搅拌48h。反应完全后，将反应物进行抽滤，抽滤所得固体放入35℃烘箱中干燥24h，即得到（3-羧丙基）三苯基溴化膦(CTPP)。
（2）TPP-QT的制备：将称取的槲皮素(QT)（0.1511g，0.5mmol)和（3-羧丙基）三苯基溴化膦 (0.2147 g，0.5 mmol)置于配有磁性搅拌棒的干燥圆底烧瓶中，加入30 mL无水二甲基亚砜(DMSO)。搅拌溶解后，引入二氯亚砜(SOCl2) (0.4 mL，0.0075 mol)，反应混合物在60℃、氮气保护下搅拌24 h。反应结束后，将反应液转移至截留分子量为500Da透析袋中，以去离子水为透析液进行透析48h。最后对透析所获沉淀产物进行冷冻干燥，得到三苯基膦-槲皮素（TPP-QT）。
将原料及制备的产物取适量样品（5-10mg）溶于氘代二甲基亚砜（DMSO-d6）中，装入核磁管中，通过核磁共振仪检测出的氢谱鉴定所得化合物。结果如图2-4所示。
应用例1
TPP-QT对人SH-SY5Y细胞毒性作用及对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞毒性的保护作用
1. TPP-QT对神经细胞的毒性作用评价
取对数生长期的SH-SY5Y细胞以每孔100μl、700000个细胞接种于96孔板上，各组细胞数基本相同，共分13组，于37℃，5%CO2培养箱中培养，过夜。待细胞铺满单层后，弃去上清液，正常对照组:加入100μl的完全培养液(含10%胎牛血清的培养液)，药物对照组：加入100μl不 完全培养基(不含胎牛血清的培养液)后加 入0.5μl终浓度为6.25、12.5、25、50、100 μM/l的TPP-QT；阳性对照组：加入100μl不 完全培养基后分别加入0.5μl终浓度为100μM/l的QT、TPP，于37℃，5%CO2培养箱中培养4h后，加入终浓度为5 mg/ml的MTT10 μl,培养4小时后，800 转离心，弃去上清液，每孔加入100 μl的DMSO ( 分析纯) 溶波，反复震荡20min,直至MTT反应的蓝紫色结晶产物完全溶解。用全波长酶标仪于570nm波长处检测各孔的吸光度(OD值)。
2.TPP-QT对拟缺血神经元的保护作用
取对数生长期的SH-SY5Y细胞以每孔100μl、700000个细胞接种于96孔板上，各组细胞数基本相同，共分13组，于37℃,5%CO2培养箱中培养，过夜。待细胞铺满单层后，弃去上清液，正常对照组:加入100μl的完全培养液(含10%胎牛血清的培养液)，H2O2损伤组:加入90μl不完全培养液(不含胎牛血清的培养液)后再加入10 μl终浓度为150μM/l的H2O2溶液；TPP-QT药物各浓度保护组:加入90μl不完全培养基后加入10μl终浓度为150μM/l的H2O2的溶液2h,最后加 入0.5μl终浓度为6.25、12.5、25、50、100 μM/l的TPP-QT;TPP阳性对照组: 加入90μl不完全培养基后加入10μl终浓度为150μM/l的H2O2的溶液2h,最后加入0.5μl终浓度为6.25、12.5、25、50、100 μM/l的TPP；QT阳性对照组: 加入90μl不 完全培养基后加入10μl终浓度为150μM/l的H2O2的溶液2h,最后加入0.5μl终浓度为100 μM/l的QT,于37℃,5%CO2培养箱中培养4h后，加入终浓度为5 mg/ml的MTT10 μl,培养4小时后，800 转离心，弃去上清液，每孔加入100 μl的DMSO ( 分析纯) 溶波，反复震荡20 min,直至MTT反应的蓝紫色结晶产物完全溶解。用全波长酶标仪于570nm波长处检测各孔的吸光度(OD值)。
结果如图5所示，各组细胞MTT吸光度值如下,与正常组相比，QT与TPP-QT组均能促进细胞增殖。各组细胞MTT吸光度值如下,与正常组相比，150μM/l的H2O2能显著降低OD 值，即细胞存活率降低;与损伤组相比，TPP-QT在25-100μM/l浓度范围内呈浓度依赖性提高细胞损伤的抑制率，说明TPP-QT可明显改善H2O2诱导的细胞的氧化损伤，对SH-SY5Y细胞有一定的保护作用。
应用例2
TPP-QT对H2O2诱导的人SH-SY5Y细胞细胞学形态的影响
取对数生长期的SH-SY5Y细胞以每孔100μl、700000个细胞接种于96孔板上，各组细胞数基本相同，共分13组，于37℃，5%CO2培养箱中培养，过夜。待细胞铺满单层后，弃去上清液，正常对照组:加入100μl的完全培养液(含10%胎牛血清的培养液)，H2O2损伤组:加入90μl不完全培养液(不含胎牛血清的培养液)培养2h后再加入10μl终浓度为150μM/l的H2O2溶液:TPP-QT药物各浓度保护组:加入90μl不 完全培养基后加入10μl终浓度为150μM/l的H2O2的溶液2h,最后加入0.5μl终浓度为25、50、100 μM/l的TPP-QT，于37℃，5%CO2培养箱中培养4h后，800转离心，弃去上清液，加入100μlPBS，于倒置荧光显微镜下观察形态学变化并照相。
结果如图6所示，各组细胞形态如下，倒置显微镜下可见正常组细胞呈树枝状或多角形，胞体大神经突起多且长，可形成网状结构; H2O2损伤组与正常组相比:树枝状或多角形细胞减少，胞体变小，部分损伤细胞突起少且缩小或变圆，网状结构几乎消失;TPP-QT保护组和损伤组相比:树枝状或多角形细胞较多，胞体略大且神经突起长且多，可形成部分网状结构。
应用例3
TPP-QT对人SH-SY5Y细胞毒性作用及对H2O2诱导的人SH-SY5Y细胞毒性的保护作用DAPI染色拍照结果
1. TPP-QT对神经细胞形态学的影响
取对数生长期的SH-SY5Y细胞以每孔100μl、700000个细胞接种于96孔板上，各组细胞数基本相同，共分10组，于37℃,5%CO2培养箱中培养，过夜。待细胞铺满单层后，弃去上清液，正常对照组:加入100μl的完全培养液(含10%胎牛血清的培养液)；药物对照组：加入100μl的完全培养液(含10%胎牛血清的培养液)后，加入0.5μl终浓度为25、50、100 μM/l的TPP-QT；阳性对照组：加入100μl不 完全培养基后，分别加入0.5μl终浓度为50 μM/l的QT、TPP及终浓度为5mM/l的NAC，于37℃,5%CO2培养箱中培养4h后，800 转离心，弃去上清液，加入100μl终浓度为1μg/ml的DAPI溶液，置37℃，5%CO2培养箱中培养20分钟后弃去上清，用PBS清洗3遍，用倒置荧光显微镜观察拍照。
2. TPP-QT对拟缺血损伤神经细胞形态学的改善作用
取对数生长期的SH-SY5Y细胞以每孔100μl、700000个细胞接种于96孔板上，各组细胞数基本相同，共分10组，于37℃,5%CO2培养箱中培养，过夜。待细胞铺满单层后，弃去上清液，正常对照组:加入100μl的完全培养液(含10%胎牛血清的培养液)，H2O2损伤组:加入90μl不完全培养液(不含胎牛血清的培养液),再加入10 μl终浓度为150μM/l的H2O2溶液;TPP-QT药物各浓度保护组:加入90μl不完全培养基后加入10μl终浓度为150μM/l的H2O2的溶液2h,最后加 入0.5μl终浓度为25、50、100μM/l的TPP-QT;TPP阳性对照组: 加入90μl不 完全培养基后加入10L终浓度为150μM/l的H2O2的溶液2h,最后加入0.5μl终浓度为50 μM/l的TPP；QT阳性对照组: 加入90μl不 完全培养基后加入10μl终浓度为150μM/l的H2O2的溶液2h,最后加入0.5μl终浓度为50 μM/l的QT;NAC阳性对照组: 加入90μl不 完全培养基后加入10μl终浓度为150μM/l的H2O2的溶液2h,最后加入0.5μl终浓度为5mM/l的NAC,于37℃，5%CO2培养箱中培养4h后，800 转离心，弃去上清液，加入100μl终浓度为1μg/ml的DAPI溶液，置37℃，5%CO2培养箱中培养20分钟后弃去上清，用PBS清洗3遍，用倒置荧光显微镜观察拍照。
结果如图7所示，各组细胞核数目照片如下,与正常组相比，QT与TPP-QT组均能促进细胞增殖。各组细胞核数目照片如下,与正常组相比，150μM/l的H2O2能显著降低细胞存活率; 与损伤组相比，TPP-QT 在25-100μM/l浓度范围内呈浓度依赖性提高细胞损伤的抑制率 ，说明TPP-QT可明显改善H2O2诱导的细胞的氧化损伤，对SH-SY5Y细胞有一定的保护作用。
应用例4
TPP-QT对H2O2诱导的人SH-SY5Y细胞ROS含量的变化
培养SH-SY5Y细胞至对数生长期，常规消化离心之后收集细胞;用培养基重悬细胞后进行细胞计数，然后加入到6孔培养板中，每孔1.8ml细胞悬液，30×104个/孔，“十字法”晃动6孔板，使细胞分布均匀，培养24h。实验中设置对照组和过氧化氢处理组，对照组加入0.2ml PBS，处理组分别加入0.2ml终浓度为150μmol/l的过氧化氢，放入培养箱培养2h后加入10μl终浓度分别为25、50、100μM/l的TPP-QT、50μM/l的TPP、QT及5mM/l的NAC, 再放入培养箱培养4h，显微镜下观察每组细胞状态，收集上清中和贴壁的细胞，加入DHE染料重悬细胞使其与染料充分接触，放入37℃细胞培养箱中孵育20min，20min后，除去上清，用PBS清洗并重悬细胞，滤网过滤后，用流式机器检测。
结果如图8所示,与正常组相比，SH-SY5Y细胞经H2O2损伤后，细胞内DHE荧光强度值显著升高，表明损伤组细胞ROS含量显著增加，经不同浓度的TPP-QT处理后，细胞内DHE荧光强度成浓度依赖性地显著性降低，说明TPP-QT可对抗H2O2所诱导的氧化损伤。
应用例5
TPP-QT对H2O2诱导的人SH-SY5Y细胞线粒体膜电位变化
培养SH-SY5Y细胞至对数生长期，常规消化离心之后收集细胞;用培养基重悬细胞后进行细胞计数，然后加入到6孔培养板中，每孔1.8ml细胞悬液，30×104个/孔，“十字法”晃动6孔板，使细胞分布均匀，培养24h。实验中设置对照组和过氧化氢处理组，对照组加入0.2ml PBS，处理组分别加入0.2ml终浓度为150μmol/l的过氧化氢，放入培养箱培养2h后，加入10μl终浓度分别为25、50、100μM/l的TPP-QT、50μM/l的TPP、QT及5mM/l的NAC, 再放入培养箱培养4h，显微镜下观察每组细胞状态，收集上清中和贴壁的细胞，加入Rh123染料重悬细胞使其与染料充分接触，放入37℃细胞培养箱中孵育20min，20min后，除去上清，用PBS清洗并重悬细胞，滤网过滤后，用流式机器检测。
结果如图9所示,与正常组相比，SH-SY5Y细胞经H2O2损伤后，细胞内Rh123荧光强度值显著降低，表明损伤组细胞线粒体膜电位显著下降，经不同浓度的TPP-QT处理后，细胞内Rh123荧光强度值成浓度依赖性地显著性升高，说明TPP-QT可改善线粒体膜电位的降低。
应用例6
TPP-QT对H2O2诱导的人SH-SY5Y细胞凋亡的影响
培养SH-SY5Y细胞至对数生长期，常规消化离心之后收集细胞;用培养基重悬细胞后进行细胞计数，然后加入到6孔培养板中，每孔1.8ml细胞悬液，30×104个/孔，“十字法”晃动6孔板，使细胞分布均匀，培养24h。实验中设置对照组和过氧化氢处理组，对照组加入0.2ml PBS，处理组分别加入0.2ml终浓度为150μmol/l的过氧化氢，放入培养箱培养2h后，加入10μl终浓度分别为25、50、100μM/l的TPP-QT、50μM/l的TPP、QT、50μM/l的TPP与50μM/l的QT、5mM/l的NAC及TPP-QT 100μM/l与5mM/l的3MA联合使用, 再放入培养箱培养4h。显微镜下观察每组细胞状态，收集上清中和贴壁的细胞，加入含有Annexin V和碘化丙啶（PI）的1×Annexin V Binding Buffer，重悬细胞使其与染料充分接触，放入避光盒中室温孵育20min, 20min后，除去上清，用PBS清洗并重悬细胞，滤网过滤后，用流式机器检测。
结果如图10所示，与正常组相比，SH-SY5Y细胞经H2O2损伤后，细胞凋亡率显著降低，经不同浓度的TPP-QT处理后，细胞凋亡率成浓度依赖性地显著性升高，说明TPP-QT可改善H2O2损伤引起的细胞凋亡。
应用例7
TPP-QT对在体中动脉阻塞（MCAO）大鼠模型的治疗作用
1. 制作MCAO模型，TTC染色法确定TPP-QT对大鼠MCAO后脑梗死的影响
通过Longa改良线栓法对大鼠行右侧脑基底动脉环分支中动脉阻塞再灌注手术。动物手术前控制饮食(禁食12小时)，但不限制饮水。按大鼠体重3 mg:kg-1腹腔注射10 %水合氯醛溶液至麻醉状态，麻醉状态不宜过深。大鼠麻醉后呈仰卧姿势固定，大致去毛备皮(也可以用脱毛膏去毛)。颈部皮肤用碘伏润湿消毒。沿颈部下颌骨下方中部偏右侧开口，钝性分离的各层组织，用眼科剪剪开包裹在迷走神经及颈总动脉的膜，用玻璃分针钝性分离紧贴着颈总动脉的迷走神经，暴露右侧颈总动脉(CCA)。在颈总动脉的远心端分离出颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)。在颈总动脉(CCA)的近心端和颈内动脉(ICA)的下方穿根4-0 线牵制插栓时动脉的血流 (也可用动脉夹夹住止血)，在颈外动脉(ECA)下方穿入两根5-0线，远心端处结扎两次，结扎后从中间剪断血管。稍拉紧颈内动脉(ICA)和颈总动脉(CCA)的棉线以防插线栓时出血。调整ECA残端方向与ICA呈条直线，在ECA靠近CCA的分又处切口向颅内方向插入线栓，线栓材质是4-0尼龙线，直径28 um,有一定硬度，且插入血管的前段制作成稍微膨大的圆球状，插入深度约18.5士0.5mm处时感到有阻力时停止插栓，在线栓切口下方结扎以防血管切口处渗血，取下止血钳，把分离的组织恢复原状，缝合后放置加热垫保暖。手术后的大鼠经暖灯照射或者加热垫保暖，保持其肛温在37C左右。插栓2小时后，在大鼠再次麻醉状态下拔出线栓并将颈外动脉下方的细线系紧，在皮肤切口处撒上适量抗生素并标准缝合。将大鼠放回鼠笼，做好保暖措施，并给予5%葡萄糖水溶液。假手术组进行术前麻醉，分离CCA、ECA、ICA,只在ECA上系一根细线结扎，不插入线栓，作为无手术对照。分别设置假手术组（Sham）；模型组（MCAO/R）；TPP-QT低剂量组（1mg/kg，i.v.）；TPP-QT中剂量组（3mg/kg，i.v.）;TPP-QT高剂量组（5mg/kg，i.v.）。模型建立成功，1h时给药，2h时复灌，复灌24h后取脑，TTC染色。
实验结果如图11A、B所示，从图AB可以看出，尾静脉给药TPP-QT脑梗死体积和模型组相比具有极其显著的差异，对MCAO大鼠的脑梗死体积具有显著降低作用。
2. 采用mNSS评分法确定SS31-HA-RT对大鼠MCAO后行为学的影响
神经功能评价采用改良的神经功能缺损评分（modified neurological severityscores，mNSS）。它由提尾试验，运动试验和平衡木试验组成，把每个测试的分数相加得到最后的分数。三项总分相加，8-12分为严重损伤，4-7分为中度损伤，1-3分为轻度损伤。
各分组实验动物取脑前按mNSS评分表格细则进行行为学评分。
实验结果如图11 C所示，从图C可以看出，模型组评分结果为严重损伤，尾静脉给药后评分结果为轻度损伤，与模型组相比具有极其显著的差异，对MCAO大鼠的行为学具有显著改善作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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