具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

除非另有定义，与本发明结合使用的科学和技术术语及其缩略语应具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义，以下列举了本发明中使用的部分术语和缩略语。

抗体：antibody，Ab。

免疫球蛋白：immunoglobulin，Ig。

重链：heavy chain，HC。

轻链：light chain，LC。

重链可变区：heavy chain variable domain，VH。

重链恒定区：heavy chain constant domain，CH。

轻链可变区：light chain variable domain，VL。

轻链恒定区：light chain constant domain，CL。

抗原结合区：antigen binding fragment，Fab。

铰链区：hinge region。

Fc片段：fragment crystallizable region，Fc region。

单克隆抗体：monoclonal antibodies，mAbs。

抗体依赖性细胞毒作用：antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC。

补体依赖性细胞毒性作用：complement dependent cytotoxicity，CDC。

自然杀伤细胞：natural killing cell，NK细胞。

双特异性抗体：bispecific antibody，BsAb。

T细胞受体：T cell receptor，TCR。

主要组织相容性复合体：major histocompatibility complex，MHC。

互补决定区：complementarity determining region，CDR，是指抗体的抗原互补结合区。

免疫受体酪氨酸活化基序：immunoreceptor tyrosine-based activationmotif，ITAM。

单链可变区抗体片段(又称单链抗体)：single-chain variable fragment，scFv；

过继免疫治疗：adoptive cellular immunotherapy，ACI。

淋巴因子激活的杀伤细胞：lymphokine-activatedkiller cell，LAK细胞。

肿瘤浸润淋巴细胞：Tumor Infiltrating Lymphocyte，TIL细胞。

细胞因子诱导的杀伤细胞：cytokine-induced killer cell，CIK细胞。

本发明所述分子克隆、细胞培养、蛋白纯化、免疫学实验、微生物学、动物模型等试验的操作步骤为该领域内被广泛应用的常规步骤。除非上下文另有说明，否则本发明单数术语包含复数且复数含义包括单数含义。除非另外指明，否则本发明所述核苷酸序列按照5’端至3’端的方向从左至右排列并书写。除非另外指明，否则本发明所述氨基酸序列按照从氨基端(N末端)到羧基端(C末端)的方向从左至右排列并书写。本发明所提及的氨基酸三字母缩写及核苷酸单字母缩写为该技术领域普遍接受的形式，氨基酸单字母缩写为IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的形式。

术语“氨基酸”是指20种天然存在的氨基酸之一或可能存在于特定的限定位置的任何非天然类似物。本发明所述“氨基酸突变”是指多肽序列中的氨基酸取代、插入、缺失和修饰，以及氨基酸取代、插入、缺失和修饰的任意组合。本文中优选的氨基酸修饰是取代。本发明中“氨基酸取代”或“取代”是指将亲本多肽序列中特定位置的氨基酸替代为另一种氨基酸。例如，取代C220S是指变体多肽，其中多肽的位置220处的氨基半胱氨酸已被氨基酸丝氨酸替代。氨基酸突变可以通过分子克隆或化学的方法实现，分子克隆的方法包括PCR、定点突变、全基因合成等。

术语“蛋白”、“肽链”、“多肽链”是指两个以上的氨基酸通过肽键连接的分子，包含天然蛋白、人工蛋白、蛋白片段、突变蛋白和融合蛋白等。

术语“结构域”是指生物大分子中具有独立功能的特异结构区域，结构域具有独立的三级结构，其功能不依赖于生物大分子中的其余部分，本发明中的结构域特指蛋白中这样的区域，如重链可变区VH结构域、轻链可变区VL结构域，结构域之间相互结合可以构成一个大的结构域。

术语“抗体”指包含至少一个抗原识别位点并能特异性结合抗原的免疫球蛋白分子。在此，术语“抗原”是在机体内能诱发免疫应答且与抗体特异性结合的物质，如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多聚核苷酸、脂质、半抗原或上述物质的组合。抗体与抗原的结合依靠二者间形成的相互作用来介导，包括氢键、范德华力、离子键以及疏水键。抗原表面与抗体结合的区域为“抗原决定簇”或“表位”，一般来说，每个抗原有多个决定簇。本发明所提及的术语“抗体”包含单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、抗体片段、包含至少两个不同表位结合结构域的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、翻译后修饰抗体、骆驼抗体、嵌合抗体、包含抗体抗原决定簇的融合蛋白、以及包含抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体展现出所期望的生物活性。具体来说，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即至少含有一个抗原结合位点的分子。

术语“双特异性抗体”指含有两个不同抗原结合位点的抗体，可同时与两种不同的抗原结合位点结合。

术语“Fab”、“Fab区域”、“Fab片段”或“Fab分子”是抗原结合片段，包含免疫球蛋白重链的VH结构域、CH1结构域以及轻链的VL结构域、CL结构域，重链第一个恒定区结构域CH1与轻链的恒定区结构域CL结合，重链的可变区结构域VH和轻链的可变区结构域VL结合。

术语“Fc”、“Fc区域”、“Fc片段”或“Fc分子”是抗体的效应区，能够引起如CDC、ADCC、ADCP、细胞因子释放等。天然的抗体Fc通常是由两个相同的蛋白片段结合构成，该蛋白片段包含两个或三个免疫球蛋白恒定区结构域。本发明中所述Fc包含天然Fc以及突变的Fc。虽然Fc区的边界可以变化，但人IgG重链Fc区通常定义为包含从C226或P230开始到其羧基末端的残基。在实验条件下，免疫球蛋白单体经木瓜蛋白酶酶切生成的片段分别为Fab和Fc。抗体的“铰链”或“铰链区”是指包含抗体的第一和第二恒定结构域(CH1和CH2)之间的氨基酸的柔性多肽。

除非另有说明，否则本发明所述抗体可变区氨基酸编号使用Kabat等人在1991年所阐述的编码方案，即“Kabat索引”或“Kabat编号”(Kabat,E.A.et al.SequencesofProteins ofImmunological Interest,5th ed.,NIH Publication No.91–3242,Bethesda,MD.:1991)。除非另有说明，否则本发明所述抗体恒定区氨基酸编号使用EU索引(Edelman GM,et.al.Proc NatlAcad Sci U SA 1969,63:78-85.)。

术语“抗原结合位点”指抗原结合分子与抗原产生直接相互作用的一个或多个氨基酸残基，抗体的抗原结合位点由抗原互补决定区(CDR)构成，天然免疫球蛋白分子通常包含两个抗原结合位点，Fab分子通常包含一个抗原结合位点。

术语“T细胞激活”指T淋巴细胞尤其是杀伤性T淋巴细胞的一种或多种免疫反应，包括：增值、分化、细胞因子的释放、杀伤性效应分子的分泌、细胞杀伤等。

术语“EC₅₀”即半最大效应浓度(concentration for 50％ofmaximal effect)，是指引起50％最大效应所对应的抗体浓度。

本发明所用“特异性结合”是指，两种分子间的非随机的结合反应，如抗体及其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方案中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10^-5M，例如小于大约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、或10^-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。在本发明的一些实施方案中，术语“靶向”指特异性结合。

本发明所用“KD”是指，特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，用于描述抗体与抗原间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体以小于大约10^-5M，例如小于大约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、或10^-10M或更小的平衡解离常(KD)结合抗原。

术语“单链可变区抗体片段”或“scFv”指免疫球蛋白重链可变区VH和轻链可变区VL的融合蛋白，包括N端为VH以及N端为VL的不同组合形式，利用构建重组蛋白的常规分子克隆方法即可制备(Sambrook JF,E.F.et al.Molecular cloning:a laboratorymanual.4th ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NewYork:2012)。

术语“人源化抗体”是指人源免疫球蛋白(受体抗体)的部分或者全部CDR区被一非人源抗体(供体抗体)的CDR区替换后得到的抗体或者抗体片段，其中的供体抗体可以是具有预期特异性、亲和性或者反应性的非人源(如小鼠、大鼠或兔)抗体。此外，受体抗体的架构区(FR)的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替换，或者被其他抗体的氨基酸残基替换，以进一步改善或者优化抗体的一种或多种特性。

本发明涉及药物组合物，其包含本发明的抗体或抗体片段、双特异性抗体或抗体偶联物，和任选地药学上可接受的载体，表面活性剂和/或稀释剂。在一些实施方案中，除本发明的抗体、双特异性抗体或抗体偶联物外，所述药物组合物还包含一种或多种另外的治疗剂。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂包括但不限于化疗剂、生长抑制剂、细胞毒性剂、用于放射疗法的试剂、抗血管生成剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂和其它治疗癌症的试剂。

术语“宿主细胞”指导入外源核酸的细胞及其后代，可通过编码多肽的核苷酸转化或转染，从而表达外源多肽。本发明所述的宿主细胞包括但不限于CHO细胞(Chinesehamster ovary cells，中国仓鼠卵巢细胞)、HEK293细胞(Human embryonic kidney cells293，人胚肾细胞293)、BHK细胞(Baby Hamster Kidney，幼仓鼠肾细胞)、骨髓瘤细胞、酵母、昆虫细胞或原核细胞如大肠杆菌(Escherichia coli)等。应当指出，本发明所述“宿主细胞”不仅指导入了外源核酸的细胞，同时还包括了该细胞的后代，由于在细胞分裂过程中后代细胞会发生突变，但仍属于本发明所述的术语范围。

本发明还进一步包含编码这些多肽链的核酸序列。在表达抗体的过程中，将核酸序列插入合适的载体中，载体包括但不限于：质粒、噬菌表达载体、柯斯质粒、人工染色体、噬菌体以及动物病毒。表达载体中包含用于调控表达的元件，包括但不限于启动子、转录起始序列、增强子、信号肽序等。启动子包括但不限于T7启动子、T3启动子、SP6启动子、β-actin启动子、EF-1α启动子、CMV启动子以及SV40启动子。将表达载体转入宿主细胞中可使用本领域内已知的合适方法，包括但不限于：磷酸钙沉淀法、聚乙烯亚胺转染法、脂质体转染法、电穿孔法、PEI(聚乙烯亚胺)转染法。

实施例1

本实施例提供一种B7-H3抗体，所述B7-H3抗体的制备方法包括以下步骤：

(1)制备B7-H3胞外区(29-461)抗原，序列来源于UniProtKB:Q5ZPR3(CD276_HUMAN)设计引物并克隆至真核表达载体pcDNA3.1-TEV-cFc-His，建立hB7-H3-TEV-cFc-His重组真核表达质粒，以PEI转染法转染至293F宿主细胞，经5天培养后收集细胞上清液，上清经protein A亲和纯化得到B7-H3-TEV-cFc-His融合蛋白，再利用TEV蛋白酶酶切，镍柱纯化后得到人B7-H3抗原；

(2)取人外周血，分离外周单核细胞，提取总RNA，用逆转录试剂盒提取得到cDNA，以该cDNA为模板，参考Lim,T.S.,et al.(Lim T S,Mollova S,Rubelt F,et al.Anoptimisedprocedure for amplification of rearranged human antibody genesofdifferent isotypes[J].New Biotechnology,2010,27(2):108-117.)设计特异引物进行PCR，PCR扩增其VH片段，获得人源VH基因；

(3)取本发明人已公布的专利(CN110551221A)中结合CD3的轻链序列(SEQ ID No：9)，设计特异引物进行PCR并扩增，获得CD3 VL基因；

(4)将所述人源VH基因及CD3 VL基因以G4S-linker经过重叠延伸PCR技术组装成scFv文库，构建人-VH:CD3-VL抗体文库，将文库克隆至噬菌体载体后，经电击转化宿主细胞(TG1 Electrocompetent Cells：Lucigen.)获得人-VH:CD3-VL抗体文库噬菌体文库，噬菌体文库经辅助噬菌体包装、PEG沉淀后备用，取96孔板，加入适量重组人B7-H3抗原孵育过夜，PBST洗涤数次，加入噬菌体文库进行筛淘，经多轮筛淘后对富集的阳性克隆测序，最终获得B7-H3抗体，命名为5D9，抗体5D9序列如表1所示。

表1

实施例2

本实施例对实施例1所述的抗体5D9进行表达、纯化及验证。

本发明中的所有抗体均采用293F细胞瞬转表达，分别合成编码5D9抗体重链和轻链DNA，且将其克隆至表达载体pcDNA3.1中，用PEI转染法，将抗体5D9的重链和轻链表达质粒转染至293F细胞中，培养6天后，离心收集细胞培养上清，随后用ProteinA亲和层析柱(GEhealthcare)纯化上清液中的抗体。

本发明中的阳性对照抗体Enoblituzumab模拟物，序列来源于专利：WO2011US26689，采用上述方法表达、纯化；本发明中的阳性对照抗体8H9单抗模拟物，序列来源于专利WO2003US07004，亦采用上述方法表达、纯化。

采用ELISA法检测5D9与B7-H3抗原的结合，将人B7-H3抗原包被于96孔板上，置于4℃过夜，将抗体5D9以及对照样品稀释至10μg/mL，再进行4倍梯度稀释，共8个浓度，并加入到抗原包被孔进行孵育，洗涤后加入HRP标记的山羊抗人IgG(H+L)二抗，TMB显色，酶标仪检测波长为450nm，读取吸光度OD值，以样品浓度的对数值为X轴，吸光度OD₄₅₀值为Y轴，绘制剂量反应曲线，计算EC₅₀，以EC₅₀代表抗体与B7-H3抗原结合的能力，实验同时设置阴性对照IgG组、阳性抗体Enoblituzumab模拟物对照组，结果见图1。

如图1所示，5D9与B7-H3抗原结合较好，稍弱于Enoblituzumab模拟物与B7-H3抗原的结合。

实施例3

本实施例提供一种亲和力成熟B7-H3抗体。

由前述可知，本发明获得的B7-H3抗体5D9，与B7-H3抗原的结合活性稍弱于Enoblituzumab模拟物，为进一步获得与B7-H3抗原有高亲和力的抗体，本实施例通过对抗体5D9重链的可变区进行体外亲和力成熟，获得亲和力成熟B7-H3抗体，制备方法包括以下步骤：

(1)亲和力成熟文库的生成，分别合成5D9重链互补决定区HC-CDR 1、HC-CDR 2、HC-CDR3的三联密码子上下游随机引物，经SOE-PCR获得5D9重链互补决定区随机突变文库，然后，将所得的随机突变文库克隆至噬菌粒载体并电击转化宿主细胞(TG1Electrocompetent Cells：Lucigen.)，获得5D9重链互补决定区随机突变噬菌体文库；

(2)亲和力成熟文库的筛淘，利用噬菌体展示技术实施亲和力成熟的抗体的生成，如前述实施例方法，亲和力成熟文库噬菌体文库经包装、三轮淘洗后，富集阳性克隆并测序，得到33个亲和力成熟变体，其中，33个亲和力成熟变体的可变轻链区(VL)序列为SEQ IDNo.9，重链框架区VH-FR1、VH-FR2、VH-FR3、VH-FR4序列分别为SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5。

各个变体的重链互补决定区VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3序列如表2所示。

表2

实施例4

本实施例对实施例3所述的亲和力成熟B7-H3抗体进行表达和纯化。

如实施例2所述方法，分别合成实施例4制备的编码亲和力成熟各变体的重链和轻链DNA，且将其克隆至表达载体pcDNA3.1中，用PEI转染法，将亲和力成熟各变体的重链和轻链表达质粒转染至293F细胞中，培养5～6天后，离心收集细胞培养上清，随后用ProteinA亲和层析柱(GE healthcare)纯化上清液中的抗体，共获得33株抗亲和力成熟B7-H3抗体。

实施例5

本实施例对实施例4制备的亲和力成熟各变体进行功能验证。

(1)ELISA法测定亲和力成熟各变体与人B7-H3抗原的结合活性

采用ELISA方法检测亲和力成熟变体与人B7-H3抗原的结合活性，以样品浓度的对数值为X轴，吸光度OD₄₅₀值为Y轴，绘制剂量反应曲线，计算EC₅₀，以EC₅₀代表样品与人B7-H3抗原结合的能力，实验设置阳性对照组Enoblituzumab模拟物以及阴性对照组hIgG，结果见图2A-图2I。

如图2A-图2I所示，亲和力成熟各变体与人B7-H3抗原有较高的结合活性，其结合活性大多与Enoblituzumab模拟物相似，结合活性(EC₅₀)如表3所示。

表3

(2)流式细胞术(FACS)测定亲和力成熟各变体与过表达B7-H3近膜端抗原细胞的结合活性

为了进一步研究上述的亲和力成熟各变体对人B7-H3抗原功能区的结合活性，本发明使用FACS检测其与过表达B7-H3近膜端抗原的细胞的结合活性。首先，构建稳定表达B7-H3近膜端(243-534bp)的细胞株，命名为Positive细胞；Negative细胞为不表达B7-H3近膜端的同种细胞。

收集Positive细胞和Negative细胞，以4℃预冷的2％FBS/PBS(稀释液)洗涤一次，再以稀释液重悬细胞，使细胞密度为5.0×10⁶/mL，将细胞接种于96孔板上，100μL/well，即5.0×10⁵/well，以稀释液配制所述亲和力成熟各变体，浓度为5μg/mL，取100μL抗体溶液分别与等体积的Negative细胞或Positive细胞混匀，即终浓度为2.5μg/mL，把96孔板置于4℃孵育1h，将96孔板在500×g、4℃离心5min，去除上清，再以200μL稀释液洗涤两次，用PEanti-human IgG FC(Invitrogen)稀释液重悬细胞，4℃避光孵育1h，将96孔板在500×g、4℃下离心5min，去除上清，再用200μL稀释液洗涤两次，用200μL稀释液重悬细胞后立刻上机检测，结果见图3A-图3E。

部分结果如3A-图3E所示，亲和力成熟各变体均可与表达B7-H3近膜端抗原的Positive细胞结合(图中右侧实线)，而不与Negative细胞结合(图中左侧实线)。

(3)检测亲和力成熟变体介导PBMC对B7-H3阳性肿瘤细胞杀伤活性

根据前述ELISA和FACS结果，选择与人B7-H3抗原有较高亲和力的15株亲和力成熟变体(44F2、43G11、46H7、45B11、43D4、42F7、45F4、46H9、46D4、47H4、48E9、49C3、49E1、50A1和50A6)，采用B7-H3阳性表达的细胞人胃癌细胞NCI-N87作为靶细胞，人外周血单核细胞PBMC作为效应细胞，检测亲和力成熟各变体介导PBMC杀伤NCI-N87肿瘤细胞的活性。

用胰酶消化NCI-N87细胞，制备单细胞悬液，用无酚红的5％FBS-RPMI1640培养基调整细胞密度为0.40×10⁶/mL，50μL/孔加入96孔板中；将效应细胞PBMC调整细胞密度为4.00×10⁶/mL，100μL/孔加入96孔板中；用无酚红的5％FBS-RPMI1640培养基将待测抗体稀释至40μg/mL，然后按1:4的比例进行倍比稀释，得到10个浓度，分别为40μg/mL、10μg/mL、2.5μg/mL、0.625μg/mL、0.1563μg/mL、0.0391μg/mL、0.0098μg/mL、0.0024μg/mL、0.0006μg/mL和0.00015μg/mL，50μL/孔加入96孔板中。96孔板混匀后置于37℃、5％CO₂培养箱中培养过夜，第二天(约20小时后)用乳酸脱氢酶细胞毒性试剂盒(Beyotime)来检测细胞的毒性，进而检测抗体的杀伤活性，杀伤率的计算公式为：Cytotoxicity％＝(OD样品-SR)/(MR-SR)×100％，其中，SR＝OD自发释放孔(靶细胞+效应细胞)，MR＝OD最大释放孔(靶细胞)，结果见图4A和图4B。

如图4A和图4B所示，15株亲和力成熟各变体均可介导PBMC杀伤B7-H3阳性的人胃癌细胞NCI-N87。

实施例6

本实施例提供一种靶向CD3和B7-H3的双特异性抗体。

(1)B7-H3×CD3双特异性抗体的序列设计

选择前述制备的亲和力成熟B7-H3抗体(42F7、43G11、49E1、46H7)以制备靶向CD3和B7-H3的双特异性抗体，本发明实施中的双特异性抗体，基于共同轻链和两条不同重链构建，结构示意图如图5所示，包括4条多肽链，分别命名为抗B7-H3重链(从N端至C端依次为VH-CH1-Hinge-CH2-CH3-)、抗CD3重链(从N端至C端依次为VH-CH1-Hinge-CH2-CH3-)、抗B7-H3轻链(从N端至C端依次为VL-CL)，抗CD3轻链((从N端至C端依次为VL-CL)，形成一个特异性结合B7-H3的免疫球蛋白Fab结构域，一个特异性结合CD3的免疫球蛋白Fab结构域以及一个异源二聚体Fc区域，其中抗B7-H3轻链和抗CD3轻链为共同轻链，两条重链的CH3结构域包含带相反电荷的不对称氨基酸修饰，形成上述所述的异源二聚体Fc区域。

特异性结合B7-H3的免疫球蛋白Fab结构域，包括抗B7-H3的重链和轻链，序列来源于前述实施例中制备亲和力成熟B7-H3抗体(42F7、43G11、49E1、46H7)的重链和轻链。

特异性结合CD3的免疫球蛋白Fab结构域，包括抗CD3的重链(SEQ ID No.49)和轻链(SEQ ID No.9)。

SEQ ID No.49：

EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADS VKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGNFGTSYVSWFAYWGQGTLVTVSS。

SEQ ID No.9：

DIQMTQEPSLTTSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLIGGKAALTITGVQPEDEAIYFCALWYSNLWVFGGGTKLEIK。

抗体Fc部分按照本发明人已经公开的PCT(WO2017034770A1)专利中的方法进行部分序列的改造，其中，抗B7-H3重链的Fc部分CH3结构域做如下突变：T394D、P395D、P396D(EU)，突变标记为OB，带负电荷；抗CD3重链的Fc部分CH3结构域做如下突变：P395K、P396K、V397K(EU)，突变标记为OA，带正电荷；为减少Fc与其受体FcγR的结合，抗B7-H3重链及抗CD3重链的Fc部分其CH2结构域都包含L234A、L235A和P329G(LALA-PG)突变。

(2)表达质粒的分子克隆

分别合成编码B7-H3抗体42F7、43G11、49E1、46H7重链和轻链的DNA，将其Fab形式基因片段基因片段构建至真核表达载体pFUSEss-CHIg-hG1-Fc1(包含OB、L234A、L235A突变及P329G突变)上，得到表达质粒命名为质粒1；将抗CD3的重链克隆到质粒pFUSE-hIgG1-Fc2(包含OA、N106T突变、L234A突变、L235A突变和P329G突变)上，得到的表达质粒命名为质粒2，将抗CD3的轻链克隆至pCDNA3.1上，得到的质粒命名为质粒3。

(3)表达、纯化

提取重组质粒1、质粒2和质粒3，使用PEI试剂与HEK293F细胞进行共转染，转染后的细胞悬浮液放置在37℃、5％CO₂、120rpm的培养摇床中避光培养6天，将培养上清液通过高速离心后，上样至protein A亲和层析柱纯化，并进行SDS-PAGE分析，以检测并确认每种BsAb的大小和纯度，共获得以下命名的B7-H3×CD3双特异性抗体：42F7×CD3、43G11×CD3、49E1×CD3和46H7×CD3，阳性对照抗体8H9单抗模拟物，亦通过同样的技术手段，构建8H9×CD3双特异性抗体。

实施例7

本实施例对实施例6制备的B7-H3×CD3双特异性抗体进行功能验证。

(1)B7-H3×CD3双特异性抗体的结合活性

采用间接ELISA法检测前述制备的B7-H3×CD3双特异性抗体结合B7-H3抗原活性，具体方法包括：将稀释为1μg/mL的B7-H3抗原，100μL/孔加入酶标板中，4℃包被过夜，次日，0.05％PBST洗涤后，室温封闭2h，再次用0.05％PBST洗涤后，加入梯度稀释的B7-H3×CD3双特异性抗体(PBS稀释)，室温孵育1h，使用0.05％PBST洗涤未结合物，随后加入HRP标记的羊抗人IgG(H+L)二抗(Proteintech，Cat.SA0001-17)，室温孵育1h，以0.05％PBST洗涤，加入TMB显色液，室温避光孵育5min，使用H₂SO₄终止反应，在酶标仪450nm处检测吸光度，以log(抗体浓度)为横坐标，吸光度OD₄₅₀为纵坐标，绘制剂量效应曲线，结果如图6所示，由图6可知，所有测试的B7-H3×CD3双特异性抗体均能以高活性结合人B7-H3抗原。

(2)B7-H3×CD3双特异性抗体对T细胞的激活作用检测

采用Jurkat/NFAT-Luc报告基因细胞系和B7-H3阳性的人肾癌细胞A498组成的检测系统，评价B7-H3×CD3对T细胞的激活作用，在Jurkat/NFAT-Luc细胞系中，荧光素酶基因受NFAT(Nuclear factor of activated T-cells)转录因子调控，作为效应细胞，B7-H3阳性的A498细胞作为靶细胞，当Jurkat/NFAT-Luc细胞与A498细胞共培养时，荧光素酶不表达，而当加入B7-H3×CD3时，A498细胞上的B7-H3可以通过B7-H3×CD3激活Jurkat/NFAT-Luc细胞内的CD3信号通路，促使荧光素酶表达，从而可以通过检测细胞中的荧光素酶表达量来判断Jurkat T细胞激活程度的强弱。

实验中，在96孔细胞培养板中依次加入A498细胞、Jurkat/NFAT-Luc细胞，再将B7-H3×CD3稀释到浓度为10μg/mL、2.5μg/mL、0.625μg/mL、0.15625μg/mL、0.0390μg/mL、0.0097μg/mL、0.0024μg/mL和0.0006μg/mL，将不同浓度的B7-H3×CD3加入到上述细胞培养板中，37℃静置培养6h，加入ONE-Glo Luciferase检测试剂，使用多功能酶标仪测定化学发光值，以抗体浓度的对数值为横坐标，平均化学发光值为纵坐标，进行四参数拟合，绘制剂量效应曲线，获得各曲线的EC₅₀值，以EC₅₀代表B7-H3×CD3激活T细胞的活性，实验设置阳性对照抗体8H9×CD3组。

结果如图7所示，当与B7-H3阳性肿瘤细胞A498、Jurkat/NFAT-Luc细胞共同孵育时，本发明构建的4株B7-H3×CD3双特异性抗体对Jurkat T细胞均有较好的激活作用。

(3)检测B7-H3×CD3双特异性抗体对B7-H3阳性细胞的杀伤作用

双特异性抗体B7-H3×CD3的CD3结合臂特异性地结合T细胞表面的CD3复合物，另一端B7-H3结合臂特异性地结合肿瘤细胞表面B7-H3分子，使T细胞与肿瘤细胞之间形成免疫桥联，继而激活T细胞，释放穿孔素(Perforin)和颗粒酶B(Granzyme B)等细胞杀伤蛋白，从而杀伤肿瘤细胞，当肿瘤细胞膜受损后，细胞膜通透性增大，胞浆中的乳酸脱氢酶(LDH)被释放到培养上清中。取一定量的上清，加入乳酸脱氢酶的反应底物乳酸后，乳酸脱氢酶催化脱氢反应，产生红色产物甲臜(Formazan)，可在490nm波长下产生吸收峰。细胞上清的乳酸脱氢酶含量越多，其颜色越深，吸光值越大；故可通过测定吸光值来定量肿瘤细胞释放乳酸脱氢酶的量，并计算B7-H3×CD3介导PBMC杀伤肿瘤细胞的杀伤活性，杀伤率的计算公式为：Cytotoxicity％＝(OD样品-SR)/(MR-SR)×100％，其中，SR＝OD自发释放孔(靶细胞+效应细胞)，MR＝OD最大释放孔(靶细胞)。

本发明采用B7-H3不同表达的细胞人胃癌细胞NCI-N87、A498、HepG2作为靶细胞，人外周血单核细胞PBMC作为效应细胞，检测4株B7-H3×CD3双特异性抗体介导PBMC杀伤肿瘤细胞的杀伤活性。

取新鲜分离的人外周血单核细胞PBMC，调整密度为2.00×10⁶个/mL，取生长状态良好的NCI-N87、A498、HepG2细胞，调整细胞浓度为2.00×10⁵个/mL，用1×PBS缓冲液(pH7.4)将样品稀释为30μg/mL，再进行4倍梯度稀释，共10个梯度，其浓度依次为30μg/mL、7.5μg/mL、1.875μg/mL、0.4688μg/mL、0.1172μg/mL、0.0293μg/mL、0.0073μg/mL、0.0018μg/mL、0.0005μg/mL和0.0001μg/mL，取96孔细胞培养板，依次加入50μL/well靶细胞、100μL/wellPBMC和50μL/well梯度稀释的样品，混匀，使得PBMC与靶细胞的比例为20:1，样品的起始浓度为10μg/mL，对照孔用无酚红RPMI 1640培养基补足200μL，把培养板置于37℃、5％CO₂培养箱内孵育，21±1h后，用乳酸脱氢酶细胞毒性试剂盒(碧云天)检测细胞的杀伤毒性，以抗体浓度的对数值为横坐标，杀伤活性为纵坐标，进行四参数拟合，绘制剂量效应曲线，获得各曲线的EC₅₀值，以EC₅₀代表B7-H3×CD3对靶细胞的杀伤活性，结果见图8A-图8C。

如8A-图8C所示，本发明构建的双特异性抗体B7-H3×CD3对B7-H3不同表达的NCI-N87、A498、HepG2细胞都有较好的杀伤效果。

(4)B7-H3×CD3双特异性抗体的稳定性研究

评估B7-H3×CD3双特异性抗体在40℃条件下放置不同时间的稳定性，将充分密封的样品(1mg/mL)放置于40℃恒温箱(BINDER KBF240)，在相应时间点(基线(第0天)、第14天)取20μg样品进行SEC-HPLC检测纯度。所述SEC-HPLC条件如下：

排阻色谱柱：Superdex20010/300GL increase；

流动相：50mM NaAc,51mM NaCl,0.05mM EDTApH 5.5；

流速：0.5mL/min；

紫外检测波长：280nm；

采集时间：35min。

所用仪器是AKTApure 25L1色谱仪，利用UNICORN软件记录图谱并计算剩余单体的比例。

如图9A-图9D所示，图9A代表46H7×CD3在40℃放置14天后SEC-HPLC检测纯度的结果，纯度＞98％；图9B代表43G11×CD3在40℃放置14天后SEC-HPLC检测纯度的结果，纯度＞98％；图9C代表49E1×CD3在40℃放置14天后SEC-HPLC检测纯度的结果，纯度＞98％；图9D代表42F7×CD3在40℃放置14天后SEC-HPLC检测纯度的结果，纯度＞98％，以上结果说明，在40℃实验条件下，所述抗体的多聚体比例未随时间延长而增加，故认为所述双特异四价抗体具备较好的热稳定性，具有可开发性。

(5)检测B7-H3×CD3双特异性抗体小鼠体内抗肿瘤作用

根据前述实施例结果，选择其中一种B7-H3×CD3双特异性抗体(42F7×CD3)，进行小鼠体内抗肿瘤杀伤作用的检测。

选用8周龄的雌性NOD-SCID小鼠(购自北京维通利华实验动物有限公司)，收集对数生长期的MC38/hB7-H3细胞和新鲜分离的PBMC，以100μL/只接种于小鼠右前肢，接种次日分组，分组当天定义为D0天，并于D0天开始给药，实验共分2组，每组6只小鼠，分别是同型对照hIgG组、B7-H3×CD35mg/kg组，于D1、D5、D8、D11、D15尾静脉注射给药(i.v.)，开始给药后，观测肿瘤大小并称量小鼠体重，瘤体积计算方式为：肿瘤体积(mm³)＝0.5×(肿瘤长径×肿瘤短径²)，利用肿瘤体积计算肿瘤增殖率(T/C％)和肿瘤抑制率(TGI)，根据肿瘤抑制率(TGI)进行疗效评价，结果见图10。

如图10所示，B7-H3×CD3对PBMC重建人免疫系统的NOD/SCID小鼠皮下建立的MC38/hB7-H3异种移植模型中小鼠肿瘤模型具有显著抑制肿瘤生长的作用。

综上所述，本发明的B7-H3抗体能够以高亲和力结合B7-H3抗原，通过对重链互补决定区进行突变，进一步提高了B7-H3抗体的亲和力，能够高效介导PBMC杀伤B7-H3阳性肿瘤，同时，本发明利用B7-H3抗体构建B7-H3×CD3双特异性抗体，所述双特性抗体具备高亲和力和稳定性，能够有效介导PBMC杀伤肿瘤细胞，具有显著抑制肿瘤生长的作用。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州爱思迈生物医药科技有限公司

<120> 一种B7-H3抗体及其应用

<130> 20210705

<160> 51

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<212> PRT

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<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<212> DNA

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<212> DNA

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