使用改良的肠杆菌科菌株生产l-色氨酸的方法
阅读说明:本技术 使用改良的肠杆菌科菌株生产l-色氨酸的方法 (Method for producing L-tryptophan using improved strains of the enterobacteriaceae family ) 是由 M·里平 S·耶伦特鲁普 N·杜施 于 2019-01-30 设计创作,主要内容包括:本发明提供了一种生产L-色氨酸的方法,该方法包括在发酵培养基中培养产生L-色氨酸的微生物(属于肠杆菌科);其中产生L-色氨酸的微生物已通过增强mdfA基因的表达水平或通过增强mdfA等位基因的表达水平而被修饰。(The present invention provides a method for producing L-tryptophan comprising culturing a microorganism (belonging to the family Enterobacteriaceae) that produces L-tryptophan in a fermentation medium, wherein the microorganism that produces L-tryptophan has been modified by increasing the expression level of the mdfA gene or by increasing the expression level of the mdfA allele.)
技术领域
本发明涉及使用修饰的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)微生物(其中mdfA基因的表达水平增强)发酵生产L-色氨酸的新方法。
背景技术
L-色氨酸用于人类医学和制药工业、食品工业和动物营养学。
L-色氨酸可以通过肠杆菌科菌株的发酵产生,尤其是大肠杆菌(E.coli)和粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。由于其重要意义,在改进生产方法方面正在不断努力。
方法改进可涉及与发酵技术相关的措施,例如搅拌和供氧,或营养培养基的组成,例如,选择所用的糖或发酵过程中的糖浓度,或后处理产品形式,例如通过离子交换色谱法,或微生物本身的固有性能特性。
在野生型菌株中,严格的调节机制阻止产生超过所述菌株所需的代谢产物如氨基酸并阻止释放到培养基中。因此,从制造商的观点来看,氨基酸过量产生菌株的构建需要克服这些代谢调节。
诱变、选择和突变体选择的方法用于去除所述控制机制和改善这些微生物的性能特性。
由于芳香族L-氨基酸如L-色氨酸的生物合成途径的复杂性以及由于其与细胞中许多其他代谢途径的相互连接,并不总是可以预测菌株的哪些遗传变异或修饰可以实现L-色氨酸产量的改进。
多药转运蛋白MdfA被称为由质子动力驱动的外排泵(Lewinson等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(4)1667-1672)。在WO2007/069782A1中已经报道了其作为Na+/H+逆向转运蛋白的额外功能及其参与氨基酸(例如L-赖氨酸、L-精氨酸、L-苏氨酸或L-组氨酸)的产生和积累。其中,公开了肠杆菌科的细菌,其具有增加的基因表达水平,所述基因选自nhaA、nhaB、nhaR、chaA、mdfA及其组合。
然而,WO 2007/069782 A1没有提及增强的mdfA表达水平对L-色氨酸生产力的影响。
鉴于上述情况,仍需要进一步优化特别是肠杆菌科的适合产生L-色氨酸的那些菌株,并使用肠杆菌科的这些微生物提供用于发酵生产L-色氨酸的改进方法。此外,特别希望建立能够调节参与芳族化合物转运过程的基因表达水平的新技术,因为(甚至少量)芳族氨基酸衍生物和中间体引起的毒性需要有效的转运系统。然而,基因表达水平应该适应细胞膜中丰富的转运蛋白的特定需要,而不影响细胞适应性和一般生产能力。
发明内容
本发明提供了一种生产L-色氨酸的方法,该方法包括在发酵培养基中培养产生L-色氨酸的微生物,所述微生物属于肠杆菌科;其中所述产生L-色氨酸的微生物已通过增强mdfA基因的表达水平或通过增强mdfA等位基因的表达水平而被修饰。
此外,本发明涉及通过转化、转导或接合来制备产生L-色氨酸的微生物的方法,其中所述转化、转导或接合通过载体进行,所述载体包括:
a)包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的多核苷酸序列;
b)在严格条件下与SEQ ID NO:1的互补链杂交的多核苷酸;
c)根据a)或b)的多核苷酸的天然存在的突变体或多态形式;
d)与SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有至少80%的序列同一性的多核苷酸;
e)相对于SEQ ID NO:1的核苷酸序列包含1至60个核苷酸的取代、缺失、插入或添加的多核苷酸;
f)编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸;
g)编码包含氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸,所述氨基酸序列在SEQ ID NO:2中包括1至20个氨基酸的取代、缺失、插入或添加;
并包括调节多核苷酸a)-g)表达的启动子。
此外,本发明提供了产生L-色氨酸的肠杆菌科的微生物,其中所述微生物已通过增强mdfA基因的表达水平或通过增强mdfA等位基因的表达水平而被修饰。
最后,本发明涉及上述微生物在用于生产L-色氨酸中的用途,或者上述微生物在用于生产含有L-色氨酸的饲料添加剂中的用途。
具体实施方式
在形成本发明基础的工作中,令人惊讶地发现,通过分别以适当的方式调节mdfA基因的表达水平或调节mdfA等位基因的表达水平,可显著增加产生L-色氨酸的肠杆菌科菌株中的L-色氨酸生产力(productivity)。
更具体地,本发明提供了一种生产L-色氨酸的方法,该方法包括在发酵培养基中培养产生L-色氨酸的微生物,所述微生物属于肠杆菌科;其中所述产生L-色氨酸的微生物已通过增强mdfA基因的表达水平或通过增强mdfA等位基因的表达水平而被修饰。
为了清楚和完整起见,mdfA基因的编码区如SEQ ID NO:1所示。MdfA的氨基酸序列描述于SEQ ID NO:2中。
等位基因是给定基因的变体。
根据本发明的mdfA等位基因可以为选自以下的多核苷酸:
a)包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的多核苷酸序列;
b)在严格条件下与SEQ ID NO:1的互补链杂交的多核苷酸;
c)根据a)或b)的多核苷酸的天然存在的突变体或多态形式;
d)与SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有至少80%、至少85%或至少90%,优选至少95%的序列同一性的多核苷酸;
e)相对于SEQ ID NO:1的核苷酸序列包括1至60个核苷酸的取代、缺失、插入或添加的多核苷酸;
f)编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸;
g)编码包含氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸,所述氨基酸序列在SEQ ID NO:2中包括1至20个氨基酸的取代、缺失、插入或添加。
术语“增强”或“增强的”或“过表达的”或“增加的表达水平”、“增强的表达水平”或“过表达”在本文中可互换使用并具有相似的含义。在这种情况下,这些术语描述了由相应的DNA编码的酶活性的细胞内活性的增加,例如通过增加基因的拷贝数,通过使用更强的启动子或通过使用具有增加的活性的等位基因和通过组合可能的这些措施。
可以通过将基因或等位基因的拷贝数增加至少1个来增强mdfA基因或mdfA等位基因的表达水平。
为了增加基因/等位基因的表达水平,优选在染色体上添加基因/等位基因的拷贝。可以在染色体基因组上存在一个或几个额外的拷贝,其可以通过本领域技术人员已知的重组方法引入。染色体外基因可以由不同类型的质粒或细菌人工染色体携带,这些质粒或细菌人工染色体在其复制起点方面不同,因此它们在细胞中的拷贝数不同。对应于具有紧密复制的低拷贝数质粒、中拷贝数质粒或高拷贝数质粒,它们可以1-5个拷贝、约20个或多达500个拷贝存在。
通过将基因整合到微生物的染色体中,mdfA基因或mdfA等位基因的拷贝数可以增加至少1。
还可以通过修饰基因的表达调控序列来增强mdfA基因或mdfA等位基因的表达水平。如前所述,mdfA基因或mdfA等位基因可以与更强的启动子组合。这些启动子可能是诱导型的;它们可以是同源的或异源的。本领域技术人员知晓哪种启动子是最方便的。
当基因被组织在操纵子中时,可以通过在单个启动子的控制下添加这些基因的一个补充拷贝来增强它们的表达水平。也可以通过用比野生型启动子更强的人工启动子替换染色体野生型启动子来增强表达。该领域的专家知道如何确定启动子强度。
根据本发明的微生物和用于本发明方法的微生物分别是肠杆菌科的代表,选自埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)和普罗维登西亚属(Providencia)。埃希氏菌属是优选的。必须特别提及大肠杆菌(Escherichia coli)物种。优选地,使用具有增加的Trp操纵子表达的微生物。
发明人惊奇地发现,在mdfA基因或mdfA等位基因整合到特定染色体或染色体外(extra-chromosomal)基因座的情况下,可以在产生L-色氨酸的肠杆菌科特别是大肠杆菌的菌株中实现特别强的L-色氨酸生产力。更具体地,本发明人发现,使用特定染色体或染色体外基因座进行mdfA整合能够调节mdfA的表达水平,从而当商业相关浓度在发酵液中积累时改进L-色氨酸的发酵能力。
如在本发明的上下文中所使用的,术语“表达水平的调节”是指设定导致氨基酸(L-色氨酸)产物的优化产率的平衡的表达水平。
稳定整合的基因的表达受整合位点的染色体环境中的调节序列的强烈影响,例如,已经描述的起始密码子和侧翼区域的组合效应(Stenstrom等,Gene 273(2):259-65(2001);Hui等,EMBO Journal 3(3):623-9(1984)。)。
在一个实施方案中,将具有天然表达信号的mdfA基因或mdfA等位基因的拷贝整合到染色体mtr基因座中,由此同时删除mtr基因。优选地,mtr启动子保持完整,如SEQ ID NO:25所示,即侧翼区域可能调节mdfA基因或mdfA等位基因的表达。
除此之外或作为上述的替代方案,mdfA基因或mdfA等位基因的拷贝可以整合到染色体aroP基因座中,由此同时删除aroP基因。优选地,aroP启动子保持完整,即侧翼区域可能调节mdfA基因或mdfA等位基因的表达。
因此,通过使用不同的整合基因座,mdfA表达水平可以适应细胞膜中MdfA蛋白丰度的特定需要,这是因为侧翼区的调节序列可能具有影响。
本发明的微生物和本发明方法中所用的微生物分别可以使用前述用于转化、转导或接合的方法制备。优选地,转化、转导或接合使用载体进行,所述载体包括:
a)包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的多核苷酸序列;
b)在严格条件下与SEQ ID NO:1的互补链杂交的多核苷酸;
c)根据a)或b)的多核苷酸的天然存在的突变体或多态形式;
d)与SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有至少80%、至少85%或至少90%,优选至少95%的序列同一性的多核苷酸;
e)相对于SEQ ID NO:1的核苷酸序列包含1至60个核苷酸的取代、缺失、插入或添加的多核苷酸;
f)编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸;
g)编码包含氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸,所述氨基酸序列在SEQ ID NO:2中包括1至20个氨基酸的取代、缺失、插入或添加;
和包括调节多核苷酸a)-g)表达的启动子。
为了制备本发明的肠杆菌科的菌株,优选使用已经具有在细胞中富集L-色氨酸和/或将其分泌到细胞周围的营养培养基中或将其在发酵液中累积的能力的菌株(起始菌株或亲本菌株)。表述“制备”也可用于此。
更具体地,用于本发明方式的菌株具有在≤(最多)120小时、≤96小时、≤48小时、≤36小时、≤24小时或≤12小时,在细胞和/或营养培养基或发酵液中富集或积累≥(至少)0.25g/l、≥0.5g/l、≥1.0g/l、≥1.5g/l、≥2.0g/l、≥4g/l、≥10g/l、≥20g/l、≥30g/l或≥50g/l L-色氨酸的能力。此处,菌株可以是通过诱变和选择、通过重组DNA技术或通过两种方法的组合制备的菌株。
含有本发明核苷酸序列的优选重组微生物可以从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、可能是淀粉、可能是纤维素或从甘油和乙醇,也可能从混合物中产生L-色氨酸。
适合亲本菌株并产生或分泌L-色氨酸的埃希氏菌属菌株,特别是大肠杆菌物种的菌株的实例是:
-大肠杆菌SV164(pGH5) (WO 94/08031)
-大肠杆菌AGX17(pGX44)(NRRL B-12263) (US 4,371,614)
-大肠杆菌AGX6(pGX50)aroP(NRRL B-12264) (US 4,371,614)
-大肠杆菌AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO 97/08333)
-大肠杆菌ATCC 31743 (CA 1182409)
-大肠杆菌C534/pD2310,pDM136(ATCC 39795) (WO8 7/01130)
-大肠杆菌JB102/p5LRPS2 (US 5,939,295)。
来自肠杆菌科的L-色氨酸生产菌株或L-色氨酸分泌菌株优选具有除其他外,一个或一个以上的遗传或表型特征,其选自:5-甲基-DL-色氨酸抗性,5-氟-色氨酸抗性,4-甲基-DL-色氨酸抗性,6-甲基-DL-色氨酸抗性,4-氟-色氨酸抗性,6-氟-色氨酸抗性,邻氨基苯甲酸抗性,吲唑氨丙酸(tryptazan)抗性,吲哚抗性,吲哚丙烯酸抗性,苯丙氨酸需求,酪氨酸需求,可能的蔗糖利用的能力,色氨酸操纵子增强,优选邻氨基苯甲酸合成酶,优选抗反馈形式,部分有缺陷的色氨酰-tRNA合成酶,减弱的色氨酸摄取,缺陷的色氨酸酶,灭活的阻遏蛋白,丝氨酸生物合成的增强,磷酸烯醇丙酮酸合成的增强,D-赤藓糖-4-磷酸酯合成的增强,3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖7-磷酸(DHAP)合成的增强,分支酸生物合成的增强。
此外,为了用肠杆菌科的菌株生产L-色氨酸,可能有利的是另外增强已知生物合成途径的一种或多种酶、或添补代谢(anaplerotic metabolism)的酶、或用于产生还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的酶、或糖酵解的酶、或PTS酶、或硫代谢的酶。通常优选使用内源基因。
此外,对于L-色氨酸的生产,可能有利的是另外关闭不希望的次级反应(Nakayama:"Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms",in:Overproductionof Microbial Products,Krumphanzl,Sikyta,Vanek(eds.),Academic Press,London,UK,1982)。
根据上述,本发明进一步提供了一种肠杆菌科的产生L-色氨酸的微生物,其中所述微生物已通过增强mdfA基因的表达水平或通过增强mdfA等位基因的表达水平而被修饰。
在一个实施方式中,mdfA等位基因为选自以下的多核苷酸:
a)包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的多核苷酸序列;
b)在严格条件下与SEQ ID NO:1的互补链杂交的多核苷酸;
c)根据a)或b)的多核苷酸的天然存在的突变体或多态形式;
d)与SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有至少80%、至少85%或至少90%,优选至少95%的序列同一性的多核苷酸;
e)相对于SEQ ID NO:1的核苷酸序列包含1至60个核苷酸的取代、缺失、插入或添加的多核苷酸;
f)编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸;
g)编码包含氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸,所述氨基酸序列在SEQ ID NO:2中包括1至20个氨基酸的取代、缺失、插入或添加。
为了增强mdfA表达,mdfA基因/等位基因优选整合在染色体mtr基因座中。在一个具体实施方式中,mdfA基因或mdfA等位基因的拷贝整合在mtr基因座中,同时缺失mtr基因。任选地,mtr基因座的染色体环境保持完整,并调节整合在mtr基因座中的mdfA基因或mdfA等位基因的表达。
上述产生L-色氨酸的微生物可用于生产L-色氨酸,或者用于生产含有L-色氨酸的饲料添加剂。
根据本发明的微生物和用于本发明方法的微生物分别在分批工艺、补料分批工艺、重复补料分批工艺或连续工艺中培养(DE102004028859.3或US 5,763,230)。这些工艺的概述参见教科书Chmiel(Bioprozesstechnik 1.Einführung in dieBioverfahrenstechnik[Bioprocess technology 1.Introduction to bioprocesstechnology](Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991)),或教科书Storhas(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen[Bioreactors and peripheral devices](Vieweg Verlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994))。
在分批工艺的情况下,除了一些例外,例如氧气和pH校正剂之外的所有起始材料最初以批料的形式加入,并且微生物在获得的培养基中培养。
在补料分批工艺的情况下,微生物最初通过分批工艺(分批阶段)培养。然后以连续或不连续的方式向培养物中加入对产物制备必需的起始材料,如果需要还加入多种起始材料(进料阶段)。
在重复补料分批工艺的情况下(涉及的是补料分批工艺),其中在发酵完成后,获得的一部分发酵液用作接种物以开始新的重复补料分批工艺。如有必要,该循环可重复多次。重复补料分批工艺例如描述于WO 02/18543和WO 05/014843中。
在连续工艺的情况下,在分批或补料分批工艺之后,将一种或多种,可能所有的起始材料连续添加到培养物中并同时除去发酵液。连续工艺例如描述在专利文献US 5,763,230、WO 05/014840、WO 05/014841和WO 05/014842。培养基必须以合适的方式满足特定菌株的需要。不同微生物的培养基描述于手册“Manual of Methods for GeneralBacteriology”of the American Society for Bacteriology(Washington D.C.,USA,1981)。术语培养基、发酵培养基和营养培养基或培养基是可互换的。
通常,培养基尤其含有一种或多种碳源、氮源和磷源。
可能作为碳源使用糖和碳水化合物,例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和可能的纤维素;油和脂肪,例如大豆油、葵花籽油、花生油和椰子脂;脂肪酸,例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸;醇类,例如甘油和乙醇;和有机酸,例如乙酸。这些物质可以单独使用或作为混合物使用。
可能作为氮源使用有机含氮化合物如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素,或无机化合物如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源可以单独使用或作为混合物使用。
可能作为磷源使用磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐。
此外,培养基必须含有金属盐,例如生长所必需的硫酸镁或硫酸铁。最后,除了上述物质之外,还可以使用必需的生长物质如氨基酸和维生素。此外,可以将合适的前体添加到培养基中。上述起始材料可以以单批的形式加入培养物中,或者在培养过程中适当地补料。
发酵通常在5.5至9.0,更特别是6.0至8.0的pH下进行。为了控制培养物的pH,适当地使用碱性化合物,例如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水,或酸性化合物,例如磷酸或硫酸。为了控制泡沫的产生,可以使用消泡剂,例如脂肪酸聚乙二醇酯。为了保持质粒的稳定性,可以向培养基中加入合适的选择性物质,例如抗生素。为了维持需氧条件,将氧气或含氧气体混合物(例如空气)引入培养物中。
培养温度通常为25℃至45℃,优选30℃至40℃。微生物的活性导致L-色氨酸在发酵或培养液中富集或积累。继续培养直至形成最大量的L-色氨酸。该目标通常在10小时至160小时内达到。在连续工艺中,可以有更长的培养时间。
发酵液或培养液理解为微生物已经在其中在一定温度下培养一段时间的发酵培养基。在发酵完成后,所得的发酵液相应地包括a)由于微生物细胞的繁殖而产生的微生物的生物质(=细胞质量),b)在发酵过程中形成的L-氨基酸(L-色氨酸),c)在发酵过程中形成的有机副产物,和d)未被发酵消耗的所用发酵培养基/培养基的成分或起始材料的成分,例如维生素如硫胺素或盐如硫酸镁。
然后可以收集产生的培养液或发酵液,并且可以获得或分离L-色氨酸或含L-色氨酸的产物。在一种方法变体中,如果需要,将发酵液浓缩,然后纯化L-色氨酸或以纯的或几乎纯的形式分离。纯化L-氨基酸如L-色氨酸的典型方法是离子交换色谱,结晶,提取方法和用活性炭处理。结果得到的主要是纯L-色氨酸,其含量≥90重量%、≥95重量%、≥96重量%、≥97重量%、≥98重量%或≥99重量%。
在另一种方法变体中,同样可以从通过以下方法产生的发酵液中制备产物,此方法通过将发酵液中存在的细菌生物质除去至完全程度(100%)或几乎完全程度,即多于或大于(>)90%、>95%、>97%、>99%,并且通过在产品中留下很大程度的发酵液的剩余成分,即达到30%-100%、40%-100%、50%-100%、60%-100%、70%-100%、80%-100%、或90%-100%,优选大于或等于(≥)50%、≥60%、≥70%、≥80%、≥90%或≥95%的程度,或者完全程度(100%)。
通过使用分离方法除去或分离生物质,例如离心、过滤、倾析、絮凝或其组合。然后使用已知方法增稠或浓缩所得的肉汤,例如借助于旋转蒸发器,借助于薄膜蒸发器,借助于降膜蒸发器,通过反渗透,通过纳米过滤或其组合。
然后通过冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾造粒或其它方法处理该浓缩肉汤,得到优选自由流动的细粉末。然后,这种自由流动的细粉末可进而通过合适的压实或造粒工艺转化成粗糙的,高度自由流动的,可储存的且基本上无尘的产品。此处,水被完全除去至90%以上的程度,因此产品中的水含量小于10重量%、小于5重量%、小于4重量%或小于3重量%。
通过离子交换色谱法,优选阳离子交换色谱法分离L-色氨酸,随后使用茚三酮进行柱后衍生,可以分析L-色氨酸以确定发酵过程中一或多个时间的浓度,参见Spackman等人(Analytical Chemistry 30:1190-1206(1958))。也可以使用邻苯二甲醛而不是茚三酮进行柱后衍生化。关于离子交换色谱的概述文章可参见Pickering(LC·GC(Magazine ofChromatographic Science)7(6),484-487(1989))。
同样可以进行柱前衍生化,例如使用邻苯二甲醛或异硫氰酸苯酯,并通过反相色谱法(RP)分馏所得的氨基酸衍生物,优选以高效液相色谱(HPLC)的形式。例如,此方法描述在Lindroth等人(Analytical Chemistry 51:1167-1174(1979))。通过光度法(吸收,荧光)进行检测。
根据本发明的方法和微生物用于发酵制备L-色氨酸。
附图说明
图1:含有DaroP缺失片段的替换载体pKO3DaroP的图谱
图2:含有mdfA基因的替换载体pKO3DaroP::mdfA的图谱
图3:含有Dmtr缺失片段的替换载体pKO3Dmtr的图谱
图4:含有mdfA基因的替换载体pKO3Dmtr::mdfA的图谱
图5:质粒pMU91的图谱
指定的长度应理解为近似值。所用缩写和名称的含义如下:
·CmR:氯霉素抗性基因
·sacB:来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的sacB基因
·RepA:质粒pSC101的温度敏感性复制区域
·pdhR':pdhR基因编码区的一部分
·mdfA:mdfA基因的编码区域
·'ampE:ampE基因编码区的一部分
·'yhbW:yhbW基因编码区的一部分
·'deaD:deaD基因编码区的一部分
·pSC101:质粒片段pSC101
·serA:编码D-3-磷酸甘油酸脱氢酶的serA基因的编码区
·trpE476DCBA:具有trpE476等位基因的色氨酸操纵子trpLEDCBA的一部分
·tetA:四环素抗性基因
限制性内切酶的缩写的含义如下
·SalI:来自白色链霉菌(Streptomyces albus G)的限制性内切核酸酶
·HindIII:来自流感嗜血杆菌Rd(Haemophilus influenzae Rd)的限制性内切核酸酶
·XhoI:来自黄单胞菌(Xanthomonas holcicola)的限制性内切核酸酶
进一步的细节可以在实施例中找到。
在下文中,通过非限制性实施例和示例性实施方案说明本发明。
实施例
用于大肠杆菌的最小(M9)和全培养基(LB)描述在J.H.Miller(A Short Coursein Bacterial Genetics(1992),Cold Spring Harbor Laboratory Press)。从大肠杆菌中分离质粒DNA,以及进行限制性消化,连接,Klenow处理和碱性磷酸酶处理的所有技术参见Sambrook等(Molecular Cloning-A Laboratory Manual(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press)。除非另有说明,否则大肠杆菌的转化方法按照Chung等(Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America,USA(1989)86:2172-2175)。
除非另有说明,菌株和转化体生产中的孵育温度为37℃。
实施例1
替换载体pKO3DaroP的构建
使用聚合酶链反应(PCR)扩增缺失aroP的缺失侧翼,并通过重叠PCR产生缺失片段。从大肠杆菌K-12MG1655的aroP基因的核苷酸序列(登录号NC_000913.3,区域:120178-121551,Blattner等人(Science 277:1453-1462(1997))和侧翼区域中开始,合成PCR引物(Eurofins Genomics GmbH(Ebersberg,Germany))。设计引物使得整个aroP基因缺失。
两个侧翼的引物设计和PCR
侧翼1
用于PCR的染色体大肠杆菌MG1655 DNA使用QIAGEN DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN GmbH,Hilden,Germany),根据制造商的信息分离。使用两种特异性引物“aroP-up1”和“aroP-up6”,在标准PCR条件下进行PCR扩增(Innis等人:PCR Protocols.A Guideto Methods and Applications,1990,Academic Press),其中使用Phusion DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific,Wattham,MA USA),以MG1655 DNA为模板,扩增片段“aroP-Flank1”(长度:775bp)。通过引物,将XbaI和NruI限制性位点插入PCR产物中。
侧翼2
使用两种引物“aroP-down2”和“aroP-down3”,用MG1655 DNA作为模板进行PCR以扩增片段“aroP-Flank2”(长度:717bp)。通过引物,将XbaI和NruI限制性位点插入PCR产物中。
通过重叠PCR融合两个侧翼
使用两个外部引物“aroP-up1”和“aroP-down2”,通过重叠PCR将两个侧翼通过它们的重叠区域融合在一起。所得产物“aroP-Del-Fragment”的长度为1462bp。限制酶XbaI的识别序列在两端。
将插入物克隆到pKO3中
使用Qiaquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN GmbH,Hilden,Germany)纯化上述融合产物,然后使用XbaI消化。这会产生XbaI“粘性末端”。使用Qiaquick PCR纯化试剂盒再次纯化消化物,这也导致短截止序列(short cut-off sequences)被除去。
同样用XbaI切割载体pKO3,同时用碱性磷酸酶去磷酸化。此后,使用Qiaquick PCR纯化试剂盒纯化消化物,这也导致XbaI位点之间的短片段被除去。限制性产物同样具有XbaI“粘性末端”。它们是未磷酸化的,阻止了质粒的自身连接。
连接通过使用T4连接酶,以1:3的摩尔比进行载体和插入物的连接。大肠杆菌克隆菌株NEB5alpha的化学感受态细胞的转化使用1μl连接反应,并铺板在含有20mg/l氯霉素的LB琼脂上。将板在30℃下孵育40小时。
检查质粒克隆
通过使用限制酶AvaI切割质粒pKO3DaroP来验证成功的克隆。
在每种情况下,挑取10个菌落,并在30℃/180rpm下在10ml LB+20mg/l氯霉素中培养过夜。
随后一天,在每种情况下离心2ml培养物,从沉淀物中制备小量提取物(minipreps)。
连接产物可以以两个方向包含插入物。AvaI限制允许证明插入物以及确定方向:
·插入方向s:片段148bp、1447bp和5494bp
·插入方向as:片段1351bp、1447bp和4291bp
·pKO3空载体:片段1043bp和5263bp
使用AvaI切割10个质粒克隆,并在0.8%TAE琼脂糖凝胶上分离产物。选择一个含有方向“s”的插入物的质粒克隆,称为“pKO3DaroP”。
使用引物“pKO3-L”和“pKO3-R”对所述克隆的插入物进行测序。
pKO3-L 5'AGGGCAGGGTCGTTAAATAGC 3' SEQ ID NO.:7
pKO3-R 5'TTAATGCGCCGCTACAGGGCG 3' SEQ ID NO.:8
通过使用引物“pKO3-L”和“pKO3-R”(Eurofins Genomics GmbH(Ebersberg,Germany))测定扩增片段“DaroP”的DNA序列。证实了该片段的预期序列,克隆的片段描述于SEQ ID NO.:9。
得到的替换载体pKO3DaroP如图1所示。
实施例2
替换载体pKO3Dmtr的构建
使用聚合酶链式反应(PCR)扩增mtr缺失的缺失侧翼,并通过重叠PCR产生缺失片段。从大肠杆菌K-12MG1655中的mtr基因的核苷酸序列(登录号NC_000913.3,区域:3304573-3305817,Blattner等人(Science 277:1453-1462(1997))和侧翼区域开始,合成PCR引物(Eurofins Genomics GmbH(Ebersberg,Germany))。设计引物使得整个mtr基因缺失。
两个侧翼的引物设计和PCR
侧翼1
用于PCR的染色体大肠杆菌MG1655 DNA使用QIAGEN DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN GmbH,Hilden,Germany),根据制造商的信息分离。使用两种特异性引物“mtr-del-Xba-1”和“mtr-del-Xba-2”,在标准PCR条件下进行PCR(Innis et al.:PCR Protocols.AGuide to Methods and Applications,1990,Academic Press),其使用Phusion DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific,Wattham,MA USA),以MG1655 DNA作为模板,扩增片段“mtr-Flank1”(长度:1009bp)。通过引物,将XbaI和NruI限制性位点插入PCR产物中。
侧翼2
使用两种引物“mtr-del-Xba-3”和“mtr-del-Xba-4”,用MG1655DNA作为模板进行PCR以扩增片段“mtr-Flank2”(长度:1014bp)。通过引物,将XbaI和NruI限制性位点插入PCR产物中。
通过重叠PCR融合两个侧翼
使用两个外部引物“mtr-del-Xba-1”和“mtr-del-Xba-4”,通过重叠PCR将两个侧翼通过它们的重叠区域融合在一起。所得产物“mtr-del-Fragment”的长度为2004bp。
将插入物克隆到pKO3中
根据制造商提供的信息,将扩增的“mtr-del-Fragment”连接到载体pCR-BluntII-TOPO(Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit,Thermo Fisher Scientific,Wattham,MAUSA)中,并转化到大肠杆菌TOP10中。在含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂上选择含有质粒的细胞。分离质粒DNA后,成功的克隆通过使用限制酶HincII切割质粒并在0.8%TAE琼脂糖凝胶上分离产物来进行验证。成功克隆的载体称为“pCRB1-mtr-del”。
然后使用限制酶NotI和SpeI切割载体,并在0.8%TAE琼脂糖凝胶上分离mtr-del-Fragment。然后使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN GmbH,Hilden,Germany)从凝胶中分离片段,并克隆到替换载体pKO3中(Link等,1997,J.Bacteriol.,179,20,6228-6237)。
使用NotI和XbaI切割载体pKO3。此后,使用Qiaquick PCR纯化试剂盒(QIAGENGmbH,Hilden,Germany)纯化消化物。
连接通过使用T4连接酶,以1:3的摩尔比进行载体和插入物的连接。大肠杆菌克隆菌株NEB5alpha的化学感受态细胞的转化使用1μl连接反应,并铺板在含有20mg/l氯霉素的LB琼脂上。将板在30℃下孵育40小时。
检查质粒克隆
通过使用限制酶HincII切割质粒pKO3Dmtr来验证成功的克隆。
正确的克隆具有以下切割模式:
·插入物mtr-del:片段822bp、1251bp、1611bp和4020bp
·pKO3空载体:片段822bp、1617bp和3232bp
在每种情况下,挑取10个菌落,并在30℃/180rpm下在10ml LB+20mg/l氯霉素中培养过夜。
随后一天,在每种情况下离心2ml培养物,从沉淀物中制备小量提取物(minipreps)。
使用HincII切割10个质粒克隆,并在0.8%TAE琼脂糖凝胶上分离产物。选择一个含有正确插入物的质粒克隆,称为“pKO3Dmtr”。
使用引物“pKO3-L”和“pKO3-R”对所述克隆的插入物进行测序。
pKO3-L 5'AGGGCAGGGTCGTTAAATAGC 3' SEQ ID NO.:7
pKO3-R 5'TTAATGCGCCGCTACAGGGCG 3' SEQ ID NO.:8
通过使用引物“pKO3-L”和“pKO3-R”(Eurofins Genomics GmbH(Ebersberg,Germany))测定扩增片段“Dmtr”的DNA序列。证实了该片段的预期序列,克隆的片段描述于SEQ ID NO.:14。
得到的替换载体pKO3Dmtr如图3所示。
实施例3
替换载体pKO3DaroP::mdfA和pKO3Dmtr::mdfA的构建
3.1载体pB-mdfA的构建
使用聚合酶链式反应(PCR)扩增mdfA等位基因。从大肠杆菌K12 MG1655(登录号NC_000913.3,区域:883673-884905,Blattner等(Science 277:1453-1462(1997))中的mdfA基因的核苷酸序列开始,合成PCR引物(Eurofins Genomics GmbH(Ebersberg,Germany))。
mdfA基因区域的引物设计和PCR
用于PCR的染色体大肠杆菌MG1655 DNA使用QIAGEN DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN GmbH,Hilden,Germany),根据制造商的信息分离。使用两种特异性引物“crmr-for”和“cmr-rev”,在标准PCR条件下进行PCR(Innis et al.:PCR Protocols.A Guide toMethods and Applications,1990,Academic Press),其使用Phusion DNA聚合酶(ThermoFisher Scientific,Wattham,MA USA),以MG1655 DNA为模板,扩增片段“mdfA-Insert”(长度:1562bp),如SEQ ID NO:19所述。通过引物,将NruI限制性位点插入PCR产物。
插入物克隆入pCR-Blunt II
根据制造商提供的信息,将扩增的片段“mdfA-Insert”连接到载体pCR-Blunt II-TOPO(Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit,Thermo Fisher Scientific,Wattham,MA USA)中,并转化到大肠杆菌TOP10中。在含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂上选择含有质粒的细胞。在分离质粒DNA后,成功克隆通过使用限制酶SphI切割质粒并在0.8%TAE琼脂糖凝胶上分离产物来进行验证。
连接产物可以包含两个方向的插入物。SphI限制酶允许证明插入物以及确定方向:
·插入方向s:片段1351bp、1385bp和2345bp
·插入方向as:片段305bp、1385bp和3391bp
·pCR-Blunt II空载体:片段1385bp和2134bp
使用SphI切割质粒克隆,并在0.8%TAE琼脂糖凝胶上分离产物。选择一个含有“as”方向的插入物的质粒克隆,称为“pB-mdfA”。
使用引物“M13uni(-21)”和“M13rev(-29)”对所述克隆的插入物进行测序。
M13uni(-21)5'TGTAAAACGACGGCCAGT 3' SEQ ID NO.:17
M13rev(-29)5'CAGGAAACAGCTATGACC 3' SEQ ID NO.:18
通过使用引物“M13uni(-21)”和“M13rev(-29)”(Eurofins Genomics GmbH(Ebersberg,Germany))测定扩增片段“mdfA”的DNA序列。确认了片段的预期序列。
3.2载体pKO3DaroP::mdfA的构建
使用限制酶NruI切割载体pB-mdfA,并将mdfA片段在0.8%TAE琼脂糖凝胶上分离。然后使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN GmbH,Hilden,Germany)从凝胶中分离片段,并克隆到产生的替换载体pKO3DaroP中。
使用NruI切割载体pKO3DaroP并同时使用碱性磷酸酶去磷酸化。该切割保留了仍然存在的aroP的启动子区域。此后,使用Qiaquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN GmbH,Hilden,Germany)纯化消化物。
连接通过使用T4连接酶,以1:3的摩尔比进行载体和插入物的连接。大肠杆菌克隆菌株NEB5alpha的化学感受态细胞的转化使用1μl连接反应,并铺板在含有20mg/l氯霉素的LB琼脂上。将板在30℃下孵育40小时。
检查质粒克隆
通过使用限制酶AseI切割质粒pKO3DaroP::mdfA来验证成功的克隆。
在每种情况下,挑取10个菌落,并在30℃/180rpm下在10ml LB+20mg/l氯霉素中培养过夜。
随后一天,在每种情况下离心2ml培养物,从沉淀物中制备小量提取物。
连接产物可以包含两个方向的插入物。AseI限制酶允许证明插入物以及确定方向:
·插入方向s:片段1603bp和7038bp
·插入方向as:片段101bp和8540bp
使用AseI切割10个质粒克隆,并在0.8%TAE琼脂糖凝胶上分离产物。选择一个含有方向“s”的插入物的质粒克隆,称为“pKO3DaroP::mdfA”。
使用引物“pKO3-L”,“pKO3-R”,“cmr-for”和“cmr-rev”对所述克隆的插入物进行测序。
插入物“DaroP::mdfA”的DNA序列通过使用引物“pKO3-L”,“pKO3-R”,“cmr-for”和“cmr-rev”(Eurofins Genomics GmbH(Ebersberg,Germany))测定。证实了该片段的预期序列,克隆的片段描述于SEQ ID NO:20。
得到的替换载体pKO3DaroP::mdfA如图2所示。
3.3载体pKO3Dmtr::mdfA的构建
使用限制酶NruI切割载体pB-mdfA,并将mdfA片段在0.8%TAE琼脂糖凝胶上分离。然后使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN GmbH,Hilden,Germany)从凝胶中分离片段,并克隆到产生的替换载体pKO3Dmtr中。
使用NruI切割载体pKO3Dmtr并同时使用碱性磷酸酶去磷酸化。该切割保留了仍然存在的mtr的启动子区域。此后,使用Qiaquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN GmbH,Hilden,Germany)纯化消化物。
连接通过使用T4连接酶,以1:3的摩尔比进行载体和插入物的连接。大肠杆菌克隆菌株NEB5alpha的化学感受态细胞的转化使用1μl连接反应,并铺板在含有20mg/l氯霉素的LB琼脂上。将板在30℃下孵育40小时。
检查质粒克隆
通过使用限制酶HincII切割质粒pKO3Dmtr::mdfA来验证成功的克隆。
在每种情况下,挑取10个菌落,并在30℃/180rpm下在10ml LB+20mg/l氯霉素中培养过夜。
随后一天,在每种情况下离心2ml培养物,从沉淀物中制备小量提取物。
连接产物可以包含两个方向的插入物。HincII限制酶允许证明插入物以及确定方向:
·插入方向s:片段354bp、822bp、1613bp、2449bp和4025bp
·插入方向as:片段822bp、1181bp、1613bp、1622bp和4025bp
使用HincII切割10个质粒克隆,并在0.8%TAE琼脂糖凝胶上分离产物。选择一个含有方向“s”的插入物的质粒克隆,称为“pKO3Dmtr::mdfA”。
使用引物“pKO3-L”,“pKO3-R”,“cmr-for”和“cmr-rev”对所述克隆的插入物进行测序。
插入物“Dmtr::mdfA”的DNA序列通过使用引物“pKO3-L”,“pKO3-R”,“cmr-for”和“cmr-rev”(Eurofins Genomics GmbH(Ebersberg,Germany))测定。证实了该片段的预期序列,克隆的片段描述于SEQ ID NO:21。
得到的替换载体pKO3Dmtr::mdfA如图4所示。
实施例4
由删除片段DaroP和DaroP::mdfA替换菌株DM2186的aroP等位基因
产生L-色氨酸的大肠杆菌菌株DM2186/pMU91是专利文献US-A-5,756,345中描述的大肠杆菌K-12菌株JP6015/pMU91的P1-转导-可获得的trpS+衍生物。pMU91是衍生自pSC101的质粒(Cohen等,Journal of Bacteriology 132:734-737(1977)),其携带TetR、trpE476DCBA和serA+。根据布达佩斯条约,JP6015/pMU91以DSM 10123保藏在LeibnizInstitute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(DSMZ,Braunschweig,Germany)。根据布达佩斯条约,DM2186于2018年11月22日以DSM 32961保藏在Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and CellCultures(DSMZ,Braunschweig,Germany)。
在菌株DM2186的染色体aroP等位基因中,存在移码突变。
用质粒编码的缺失构建体替换染色体aroP等位基因通过用质粒pKO3DaroP转化DM2186来进行。基因替换使用Link等(Journal of Bacteriology 179:6228-6237(1997))描述的选择方法进行,并通过测序验证。
在进行替换后,DM2186中存在的是缺失的aroP等位基因的形式,其在SEQ ID NO:22中描述(由Eurofins Genomics GmbH(Ebersberg,Germany)测序)。获得的菌株称为DM2186DaroP。
在大肠杆菌菌株DM2186/pMU91中整合到aroP基因座中的mdfA基因的表达增加
通过质粒编码的mdfA等位基因替换染色体aroP等位基因,同时删除aroP基因,aroP的启动子区域被保留,这些均通过用质粒pKO3DaroP::mdfA转化DM2186来进行。基因替换使用Link等(Journal of Bacteriology 179:6228-6237(1997))描述的选择方法进行,并通过测序验证。
在进行替换后,DM2186中存在的是mdfA基因的形式,其如SEQ ID NO:23所述,整合在aroP基因座中,同时缺失aroP等位基因(由Eurofins Genomics GmbH(Ebersberg,Germany)测序)。获得的菌株称为DM2186DaroP::mdfA。
在专利文献US-A-5,756,345中描述并携带有色氨酸生产的遗传信息的质粒pMU91从菌株JP6015/pMU91中分离。质粒如图5所示。菌株DM2186DaroP和DM2186DaroP::mdfA各自用该质粒转化。各个转化体称为DM2186DaroP/pMU91和DM2186DaroP::mdfA/pMU91。
实施例5
由删除片段Dmtr和Dmtr::mdfA替换菌株DM2186的mtr等位基因
产生L-色氨酸的大肠杆菌菌株DM2186/pMU91是专利文献US-A-5,756,345中描述的大肠杆菌K-12菌株JP6015/pMU91的P1-转导-可获得的trpS+衍生物。pMU91是衍生自pSC101的质粒(Cohen等,Journal of Bacteriology 132:734-737(1977)),其携带TetR,trpE476DCBA和serA+。根据布达佩斯条约,JP6015/pMU91以DSM 10123保藏在LeibnizInstitute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(DSMZ,Braunschweig,Germany)。根据布达佩斯条约,DM2186于2018年11月22日以DSM 32961保藏在Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and CellCultures(DSMZ,Braunschweig,Germany)。
在菌株DM2186的染色体mtr等位基因中,存在移码突变。
用质粒编码的缺失构建体替换染色体mtr等位基因通过用质粒pKO3Dmtr转化DM2186来进行。基因替换使用Link等(Journal of Bacteriology 179:6228-6237(1997))描述的选择方法进行,并通过测序验证。
在进行替换后,DM2186中存在的是缺失的mtr等位基因的形式,其如SEQ ID NO:24所述(由Eurofins Genomics GmbH(Ebersberg,Germany)测序)。获得的菌株称为DM2186Dmtr。
在大肠杆菌菌株DM2186/pMU91中整合到mtr基因座中的mdfA基因的表达增加
通过质粒编码的mdfA等位基因替换染色体mtr等位基因,同时删除mtr基因,mtr的启动子区域被保留,这些均通过用质粒pKO3Dmtr::mdfA转化DM2186来进行。基因替换使用Link等(Journal of Bacteriology 179:6228-6237(1997))描述的选择方法进行,并通过测序验证。
在进行替换后,DM2186中存在的是mdfA基因的形式,其如SEQ ID NO:25所述,整合在mtr基因座中,同时缺失mtr等位基因(由Eurofins Genomics GmbH(Ebersberg,Germany)测序)。获得的菌株称为DM2186Dmtr::mdfA。
在专利文献US-A-5,756,345中描述并携带有色氨酸生产的遗传信息的质粒pMU91从菌株JP6015/pMU91中分离。质粒如图5所示。菌株DM2186Dmtr和DM2186Dmtr::mdfA各自用该质粒转化。各个转化体称为DM2186Dmtr/pMU91和DM2186Dmtr::mdfA/pMU91。
实施例6
使用菌株DM2186DaroP/pMU91、DM2186DaroP::mdfA/pMU91、DM2186Dmtr/pMU91和DM2186Dmtr::mdfA/pMU91制备L-色氨酸
为了测试在两种不同染色体环境中从各种调节序列表达的额外拷贝的mdfA基因的影响,DM2186DaroP/pMU91、DM2186DaroP::mdfA/pMU91、DM2186Dmtr/pMU91、DM2186Dmtr::mdfA/pMU91和DM2186/pMU91进一步在30℃下在具有以下组成的LB培养基上繁殖:10g/l Bacto胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、10g/l NaCl(使用NaOH将pH调节至7.5)、2g/l葡萄糖、20g/l琼脂和5mg/l四环素。在包含在100ml锥形瓶中的10ml的分批培养物中检查L-色氨酸的形成。为此,接种10ml具有下述组成的预培养基,并在Infors AG(Bottmingen,Switzerland)的Infors HT Multitron标准培养箱中以30℃和180rpm温育16小时:1g/l酵母提取物、100ml/l MOPS缓冲液(10x)、10g/l葡萄糖、0.1mg/l硫胺素和5mg/l四环素。
根据表1至3,由溶液A和B制备10x MOPS缓冲液;将两倍体积的溶液A无菌添加到三个体积的溶液B中。
表1:10x MOPS缓冲液的溶液A(无菌过滤)。
组分
浓度
MOPS(吗啉丙磺酸)
418.6g/L
KOH(固体)
用于调节pH至7.4
表2:10x MOPS缓冲液的溶液B。通过高压灭菌(30分钟,121℃)灭菌。
表3:微量元素储备液(去离子水),用于10x MOPS缓冲液。
组分
浓度
(NH<sub>4</sub>)<sub>6</sub>Mo<sub>7</sub>O<sub>24</sub>x 4H<sub>2</sub>O
3.7mg/l
H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>
24.0mg/l
CoCl<sub>2</sub>x 6H<sub>2</sub>O
7.1mg/l
ZnSO<sub>4</sub>x 7H<sub>2</sub>O
28.7mg/l
MnCl<sub>2</sub>x 4H<sub>2</sub>O
15.8mg/l
CuSO<sub>4</sub>x 5H<sub>2</sub>O
2.5mg/l
在每种情况下,将100μl所述预培养物接种于根据表4的10ml生产培养基PM3P中,并在来自Infors AG(Bottmingen,Switzerland)的Infors HT Multitron标准培养箱中在33℃和180rpm温育44小时。孵育后,使用来自Macherey-Nagel GmbH&Co.KG(Düren,Germany)的Nanocolor 400D光度计在660nm的测量波长下测定培养悬浮液的光密度(OD)。
表4:PM3P培养基:用于100ml锥形瓶中的生产测试
组分
浓度
10x MOPS缓冲液
100ml/l
硫氨酸HCl(0.01%)
1.0ml/l
KH2PO4(45mM)
10ml/l
葡萄糖
10g/l
酪氨酸
0.02g/l
苯丙氨酸
0.02g/l
四环素
5mg/l
此后,通过反相HPLC测定在无菌过滤的培养上清液中形成的L-色氨酸的浓度,例如Lindroth等人(Analytical Chemistry(1979)51:1167-1174)中所述。
表5显示实验的结果。
表5:使用菌株DM2186DaroP/pMU91、DM2186DaroP::mdfA/pMU91、DM2186Dmtr/pMU91和DM2186Dmtr::mdfA/pMU91生产L-色氨酸
菌株
OD(660nm)
L-色氨酸,g/l
产率,净%
DM2186DaroP/pMU91
4.17
1.63
13.60
DM2186DaroP::mdfA/pMU91
4.02
1.66
13.82
DM2186Dmtr/pMU91
4.29
1.62
13.61
DM2186Dmtr::mdfA/pMU91
3.85
1.82
15.16
DM2186/pMU91
4.38
1.62
13.54
由此可推导出,mdfA基因的增强增加了L-色氨酸的产率。然而,mdfA的表达水平(和因此L-色氨酸产率)受所选择的整合基因座和整合的mdfA基因或等位基因的染色体环境的强烈影响。
将mdfA整合到染色体aroP基因座中导致L-色氨酸生产力的轻微增加,而mdfA整合到染色体mtr基因座中导致L-色氨酸生产力的强烈增加,即染色体环境调节mdfA的表达。与mdfA整合到aroP基因座中相比,在DM2186Dmtr::mdfA/pMU91中对L-色氨酸合成的积极作用更加显著。显然,对于L-色氨酸产生,在特定基因座中建立mdfA基因的额外拷贝的确定表达水平比通过基因拷贝数增加的整体表达增强更重要。特别是当商业相关浓度在发酵液中积累时,必须以适当的方式调节膜蛋白(例如转运蛋白和氨基酸输出物)的表达水平,而不影响细胞适应性和生产能力。
序列表
<110> 赢创德固赛有限公司
<120> 使用改良的肠杆菌科菌株生产L-色氨酸的方法
<130> 201800223
<160> 25
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1233
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1233)
<223> 编码区 mdfA
<400> 1
atg caa aat aaa tta gct tcc ggt gcc agg ctt gga cgt cag gcg tta 48
Met Gln Asn Lys Leu Ala Ser Gly Ala Arg Leu Gly Arg Gln Ala Leu
1 5 10 15
ctt ttc cct ctc tgt ctg gtg ctt tac gaa ttt tca acc tat atc ggc 96
Leu Phe Pro Leu Cys Leu Val Leu Tyr Glu Phe Ser Thr Tyr Ile Gly
20 25 30
aac gat atg att caa ccc ggt atg ttg gcc gtg gtg gaa caa tat cag 144
Asn Asp Met Ile Gln Pro Gly Met Leu Ala Val Val Glu Gln Tyr Gln
35 40 45
gcg ggc att gat tgg gtt cct act tcg atg acc gcg tat ctg gcg ggc 192
Ala Gly Ile Asp Trp Val Pro Thr Ser Met Thr Ala Tyr Leu Ala Gly
50 55 60
ggg atg ttt tta caa tgg ctg ctg ggg ccg ctg tcg gat cgt att ggt 240
Gly Met Phe Leu Gln Trp Leu Leu Gly Pro Leu Ser Asp Arg Ile Gly
65 70 75 80
cgc cgt ccg gtg atg ctg gcg gga gtg gtg tgg ttt atc gtc acc tgt 288
Arg Arg Pro Val Met Leu Ala Gly Val Val Trp Phe Ile Val Thr Cys
85 90 95
ctg gca ata ttg ctg gcg caa aac att gaa caa ttc acc ctg ttg cgc 336
Leu Ala Ile Leu Leu Ala Gln Asn Ile Glu Gln Phe Thr Leu Leu Arg
100 105 110
ttc ttg cag ggc ata agc ctc tgt ttc att ggc gct gtg gga tac gcc 384
Phe Leu Gln Gly Ile Ser Leu Cys Phe Ile Gly Ala Val Gly Tyr Ala
115 120 125
gca att cag gaa tcc ttc gaa gag gcg gtt tgt atc aag atc acc gcg 432
Ala Ile Gln Glu Ser Phe Glu Glu Ala Val Cys Ile Lys Ile Thr Ala
130 135 140
ctg atg gcg aac gtg gcg ctg att gct ccg cta ctt ggt ccg ctg gtg 480
Leu Met Ala Asn Val Ala Leu Ile Ala Pro Leu Leu Gly Pro Leu Val
145 150 155 160
ggc gcg gcg tgg atc cat gtg ctg ccc tgg gag ggg atg ttt gtt ttg 528
Gly Ala Ala Trp Ile His Val Leu Pro Trp Glu Gly Met Phe Val Leu
165 170 175
ttt gcc gca ttg gca gcg atc tcc ttt ttc ggt ctg caa cga gcc atg 576
Phe Ala Ala Leu Ala Ala Ile Ser Phe Phe Gly Leu Gln Arg Ala Met
180 185 190
cct gaa acc gcc acg cgt ata ggc gag aaa ctg tca ctg aaa gaa ctc 624
Pro Glu Thr Ala Thr Arg Ile Gly Glu Lys Leu Ser Leu Lys Glu Leu
195 200 205
ggt cgt gac tat aag ctg gtg ctg aag aac ggc cgc ttt gtg gcg ggg 672
Gly Arg Asp Tyr Lys Leu Val Leu Lys Asn Gly Arg Phe Val Ala Gly
210 215 220
gcg ctg gcg ctg gga ttc gtt agt ctg ccg ttg ctg gcg tgg atc gcc 720
Ala Leu Ala Leu Gly Phe Val Ser Leu Pro Leu Leu Ala Trp Ile Ala
225 230 235 240
cag tcg ccg att atc atc att acc ggc gag cag ttg agc agc tat gaa 768
Gln Ser Pro Ile Ile Ile Ile Thr Gly Glu Gln Leu Ser Ser Tyr Glu
245 250 255
tat ggc ttg ctg caa gtg cct att ttc ggg gcg tta att gcg ggt aac 816
Tyr Gly Leu Leu Gln Val Pro Ile Phe Gly Ala Leu Ile Ala Gly Asn
260 265 270
ttg ctg tta gcg cgt ctg acc tcg cgc cgc acc gta cgt tcg ctg att 864
Leu Leu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Arg Arg Thr Val Arg Ser Leu Ile
275 280 285
att atg ggc ggc tgg ccg att atg att ggt cta ttg gtc gct gct gcg 912
Ile Met Gly Gly Trp Pro Ile Met Ile Gly Leu Leu Val Ala Ala Ala
290 295 300
gca acg gtt atc tca tcg cac gcg tat tta tgg atg act gcc ggg tta 960
Ala Thr Val Ile Ser Ser His Ala Tyr Leu Trp Met Thr Ala Gly Leu
305 310 315 320
agt att tat gct ttc ggt att ggt ctg gcg aat gcg gga ctg gtg cga 1008
Ser Ile Tyr Ala Phe Gly Ile Gly Leu Ala Asn Ala Gly Leu Val Arg
325 330 335
tta acc ctg ttt gcc agc gat atg agt aaa ggt acg gtt tct gcc gcg 1056
Leu Thr Leu Phe Ala Ser Asp Met Ser Lys Gly Thr Val Ser Ala Ala
340 345 350
atg gga atg ctg caa atg ctg atc ttt acc gtt ggt att gaa atc agc 1104
Met Gly Met Leu Gln Met Leu Ile Phe Thr Val Gly Ile Glu Ile Ser
355 360 365
aaa cat gcc tgg ctg aac ggg ggc aac gga ctg ttt aat ctc ttc aac 1152
Lys His Ala Trp Leu Asn Gly Gly Asn Gly Leu Phe Asn Leu Phe Asn
370 375 380
ctt gtc aac gga att ttg tgg ctg tcg ctg atg gtt atc ttt tta aaa 1200
Leu Val Asn Gly Ile Leu Trp Leu Ser Leu Met Val Ile Phe Leu Lys
385 390 395 400
gat aaa cag atg gga aat tct cac gaa ggg taa 1233
Asp Lys Gln Met Gly Asn Ser His Glu Gly
405 410
<210> 2
<211> 410
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 2
Met Gln Asn Lys Leu Ala Ser Gly Ala Arg Leu Gly Arg Gln Ala Leu
1 5 10 15
Leu Phe Pro Leu Cys Leu Val Leu Tyr Glu Phe Ser Thr Tyr Ile Gly
20 25 30
Asn Asp Met Ile Gln Pro Gly Met Leu Ala Val Val Glu Gln Tyr Gln
35 40 45
Ala Gly Ile Asp Trp Val Pro Thr Ser Met Thr Ala Tyr Leu Ala Gly
50 55 60
Gly Met Phe Leu Gln Trp Leu Leu Gly Pro Leu Ser Asp Arg Ile Gly
65 70 75 80
Arg Arg Pro Val Met Leu Ala Gly Val Val Trp Phe Ile Val Thr Cys
85 90 95
Leu Ala Ile Leu Leu Ala Gln Asn Ile Glu Gln Phe Thr Leu Leu Arg
100 105 110
Phe Leu Gln Gly Ile Ser Leu Cys Phe Ile Gly Ala Val Gly Tyr Ala
115 120 125
Ala Ile Gln Glu Ser Phe Glu Glu Ala Val Cys Ile Lys Ile Thr Ala
130 135 140
Leu Met Ala Asn Val Ala Leu Ile Ala Pro Leu Leu Gly Pro Leu Val
145 150 155 160
Gly Ala Ala Trp Ile His Val Leu Pro Trp Glu Gly Met Phe Val Leu
165 170 175
Phe Ala Ala Leu Ala Ala Ile Ser Phe Phe Gly Leu Gln Arg Ala Met
180 185 190
Pro Glu Thr Ala Thr Arg Ile Gly Glu Lys Leu Ser Leu Lys Glu Leu
195 200 205
Gly Arg Asp Tyr Lys Leu Val Leu Lys Asn Gly Arg Phe Val Ala Gly
210 215 220
Ala Leu Ala Leu Gly Phe Val Ser Leu Pro Leu Leu Ala Trp Ile Ala
225 230 235 240
Gln Ser Pro Ile Ile Ile Ile Thr Gly Glu Gln Leu Ser Ser Tyr Glu
245 250 255
Tyr Gly Leu Leu Gln Val Pro Ile Phe Gly Ala Leu Ile Ala Gly Asn
260 265 270
Leu Leu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Arg Arg Thr Val Arg Ser Leu Ile
275 280 285
Ile Met Gly Gly Trp Pro Ile Met Ile Gly Leu Leu Val Ala Ala Ala
290 295 300
Ala Thr Val Ile Ser Ser His Ala Tyr Leu Trp Met Thr Ala Gly Leu
305 310 315 320
Ser Ile Tyr Ala Phe Gly Ile Gly Leu Ala Asn Ala Gly Leu Val Arg
325 330 335
Leu Thr Leu Phe Ala Ser Asp Met Ser Lys Gly Thr Val Ser Ala Ala
340 345 350
Met Gly Met Leu Gln Met Leu Ile Phe Thr Val Gly Ile Glu Ile Ser
355 360 365
Lys His Ala Trp Leu Asn Gly Gly Asn Gly Leu Phe Asn Leu Phe Asn
370 375 380
Leu Val Asn Gly Ile Leu Trp Leu Ser Leu Met Val Ile Phe Leu Lys
385 390 395 400
Asp Lys Gln Met Gly Asn Ser His Glu Gly
405 410
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(35)
<223> 引物 aroP-up1
<400> 3
gatctgagct ctagacctgg cgacgaagca acaag 35
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(37)
<223> 引物 aroP-up6
<400> 4
gcgttggtgt aatcgcgaac ctcgtgcggt ggttgtt 37
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(31)
<223> 引物 aroP-down2
<400> 5
gatctatcta gactgttacg cgcattgcag g 31
<210> 6
<211> 41
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(41)
<223> 引物 aroP-down3
<400> 6
accgcacgag gttcgcgatt acaccaacgc cccgtaaatc g 41
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> miscellaneous
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> 引物 pKO3-L
<400> 7
agggcagggt cgttaaatag c 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> miscellaneous
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> 引物 pKO3-R
<400> 8
ttaatgcgcc gctacagggc g 21
<210> 9
<211> 1568
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1568)
<223> DaroP; 用于删除 aroP的构建体
<400> 9
agggcagggt cgttaaatag ccgcttatgt ctattgctgg tctcggtacc cggggatcgc 60
ggccgcggac cggatcctct agacctggcg acgaagcaac aagcccttcg cttcgagacg 120
ttgaatcgcc tcacgcaagg agggacggga gacgtcaaac tgttttgcca gttcgcgttc 180
cggtgggagt ttttcgcccg ggcggagagt gccttcgagg atcaaaaact ccagttgctg 240
ctcaatcaca tcggagagtt ttggttggcg gattttgctg taggccatga gttcctgtct 300
taagccactt gccgaagtca attggtctta ccaatttcat gtctgtgacg ctaaagtaac 360
aaagtattca ccttatgtcc atacaggttt tgattgaaat catgaaactg tgcacatttt 420
aacaacttga catatataac gtttcaaagt tgtaactatg cacaaatgta gactttacgt 480
aggaaaggag ttttttaacg attattaaac tataaaaatc cgaattgaac cgattcactt 540
accaattttg tgatttttaa ttcaattaaa acgaatttaa attcattcta catattgaga 600
ggggttgagg ctgagcttta caaacggttt ctttttaagc aactcatctt caaccatgca 660
taaagcgggt gcattcgctg ccgcatacca ttattcttga tctgacggaa gtctttttgt 720
aacaattcaa acttctttga tgtaaacaaa ttaatacaac aaacggaatt gcaaacttac 780
acacgcatca ctgcgtagat caaaaaaaca accaccgcac gaggttcgcg attacaccaa 840
cgccccgtaa atcgtcagta gtgcaatcac caccacgacc acgaacgagg ttttcttcgc 900
cattgaaacc gctgccttcg gcgtctccac cttatcgaca tgcggttcac gcgccagaga 960
gaactgcgcc agacgcgtta acacctgata ctgcgaagta tggaaatcac ccagcgaagc 1020
aaaccaggcc ggtaacgctt tctcaccatg accgatcaag gcatatacca cacccgcaag 1080
acgaaccggc acccaatcca gtacatgaag cacggcatca atgccggact gtaaacgatg 1140
atgcggcgtc tgatatcgcg ccagccagta ttgccatgca cgcaaaaacg cataccccat 1200
cagcgtaacg ggtccccagg ttccccccac aatcagccag aacagcggtg caagataaaa 1260
acgaaagtta atccacagca atgcattttg cagctcacgc aaatactcac gttcgtcgca 1320
gcctgccggg acgccgtgaa tcatggtgag ttcgccagcc atcgtggcac gggcatggct 1380
atcattacgt gaagcagctg tcagataagc atgataatga agacgaactt tacctgcgcc 1440
aatacacagc aaaccaatca gcagccacac cagtagcgtg ggaacgttga acaatactcc 1500
ctgcaatgcg cgtaacagtc tagagtcgac cggtggcgaa tgggacgcgc cctgtagcgg 1560
cgcattaa 1568
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> 引物 mtr-del-Xba-1
<400> 10
ttgagaaccg cgagcgtcgt ctg 23
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(32)
<223> 引物 mtr-del-Xba-2
<400> 11
tctagattcg cgagggcttc tctccagtga aa 32
<210> 12
<211> 39
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(39)
<223> 引物 mtr-del-Xba-3
<400> 12
aagccctcgc gaatctagag taatcagcgg tgccttatc 39
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> 引物 mtr-del-Xba-4
<400> 13
gctggcagaa caccacaata tg 22
<210> 14
<211> 2183
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2183)
<223> Dmtr; 用于删除 mtr的构建体
<400> 14
agggcagggt cgttaaatag ccgcttatgt ctattgctgg tctcggtacc cggggatcgc 60
ggccgccagt gtgatggata tctgcagaat tcgcccttgc tggcagaaca ccacaatatg 120
actggcattg ccagtgctgc cacgtcggta ttgatcggct atctggcggc gaataccacc 180
acgctgcatc tggggtctgg cggcgtgatg ttgcctaacc actcaccgtt ggtcattgca 240
gaacagttcg gcacgcttaa tacactctat ccggggcgaa tcgatttggg gctgggtcgt 300
gctccgggta gtgaccaacg gacaatgatg gcgctacgtc gtcatatgag cggcgatatt 360
gataatttcc cccgcgatgt ggcggagctg gtggactggt ttgacgcccg cgatcccaat 420
ccgcatgtgc gcccggtacc aggctatggc gagaaaatcc ccgtgtggtt gttaggctcc 480
agcctttaca gcgcgcaact ggcggcgcag cttggtctgc cgtttgcgtt tgcctcacac 540
ttcgcgccgg atatgctgtt ccaggcgctg catctttatc gcagcaactt caaaccgtca 600
gcacggctgg aaaaaccata cgcgatggtg tgcatcaata ttatcgccgc cgacagcaac 660
cgcgacgctg aatttctgtt tacctcaatg cagcaagcct ttgtgaagct gcgccgtggc 720
gaaaccgggc aactgccgcc gccgattcaa aatatggatc agttctggtc accgtctgag 780
cagtatggcg tgcagcaggc gctgagtatg tcgttggtag gtgataaagc gaaagtgcgt 840
catggcttgc agtcgatcct gcgcgaaacc gacgccgatg agattatggt caacgggcag 900
attttcgacc accaggcgcg gctgcattcg tttgagctgg cgatggatgt taaggaagag 960
ttgttgggat agtgtgtctt aacgcgggaa gccttatccg agctggcaac gctgtcctac 1020
atagacctga taagcgaagc gcatcaggca ttgtgtaggc agcagaaatg tcggataagg 1080
caccgctgat tactctagat tcgcgagggc ttctctccag tgaaaaatag tgcgactgcg 1140
ttgttatgca ttgcactgta ccagtacacg agtacaaaag acagaaaaaa agccccgatg 1200
gtaaaaatcg gggctgtata tattatttta cagattgtgt tcgctgttca gcgatgatta 1260
cgcatcacca ccgaaacgac gacgaccggt agaatcatca cgacgcggag cgcggccttc 1320
acgacgttcg ccgctaaaac gacgaccatc accacggcca ccttcacggc gttcaccgct 1380
gaagttacga ccgccttcac gacgttcgcc accgaaacca cgaccaccgc cacgacgctc 1440
accgccagta tgcggctgtg catcgcccag taactgcatg ttcatcggct tgttgagaat 1500
gcgagtgcgc gtaaagtgtt gcagcacttc acccggcata cctttcggca gttcgatggt 1560
ggagtgagaa gcaaacagct tgatgttacc aatgtaacgg ctgctgatgt cgccttcgtt 1620
agcaatcgca ccaacgatat gacgaacttc aacaccatca tcgcggccca cttcaatgcg 1680
gtacagctgc atatcgccaa catcacgacg ttcacgacgc ggacgatctt cacggtcacc 1740
acgcgggcca cggtcgttac gatcgcgcgg accacggtca tcacggtcac ggaattcacg 1800
tttcggacgc atcggcgcat ctggcggtac gatcagagta cgttcaccct gtgccatttt 1860
cagcagtgcc gcagccagag tttcgagatc cagctcttca ccttcagcag tcggctgaat 1920
tttgctcagc agtgcgcggt attgatccag atcgctgctt tccagctgct gctgtacttt 1980
agcggcgaat ttttccagac ggcgtttgcc tagcagttct gcgttcggca gttctacttc 2040
cggaatagtc agcttcatag tacgttcaat gttgcgcagc agacgacgct cgcggttctc 2100
aaaagggcga attccagcac actggcggcc gttactagag tcgaccggtg gcgaatggga 2160
cgcgccctgt agcggcgcat taa 2183
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> miscellaneous
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(26)
<223> 引物 cmr-for
<400> 15
cgtcgcgata caggcaagtc gttgag 26
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> miscellaneous
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(26)
<223> 引物 cmr-rev
<400> 16
cctcgcgaca gattgacgac catcac 26
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> miscellaneous
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> 引物 M13uni(-21)
<400> 17
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> miscellaneous
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> 引物 M13rev(-29)
<400> 18
caggaaacag ctatgacc 18
<210> 19
<211> 1562
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1562)
<223> mdfA CDS 具有启动子和终止子
<400> 19
cgtcgcgata caggcaagtc gttgagaata aagtgcaggt taaactgggt aaagcggcat 60
cgtcttattt ccctcaagcg gcctgtttac ggtgggtgat tgtaacgggc ataggttaaa 120
taaaacttaa agaaagcgta gctatactcg taataatgta agaatgtgct taaccgtggt 180
ttcagctaca aaattcgctt tctcgttagc tgcgctttta ttaaactctg cgcgattatt 240
attggcgaag aaattgcatg caaaataaat tagcttccgg tgccaggctt ggacgtcagg 300
cgttactttt ccctctctgt ctggtgcttt acgaattttc aacctatatc ggcaacgata 360
tgattcaacc cggtatgttg gccgtggtgg aacaatatca ggcgggcatt gattgggttc 420
ctacttcgat gaccgcgtat ctggcgggcg ggatgttttt acaatggctg ctggggccgc 480
tgtcggatcg tattggtcgc cgtccggtga tgctggcggg agtggtgtgg tttatcgtca 540
cctgtctggc aatattgctg gcgcaaaaca ttgaacaatt caccctgttg cgcttcttgc 600
agggcataag cctctgtttc attggcgctg tgggatacgc cgcaattcag gaatccttcg 660
aagaggcggt ttgtatcaag atcaccgcgc tgatggcgaa cgtggcgctg attgctccgc 720
tacttggtcc gctggtgggc gcggcgtgga tccatgtgct gccctgggag gggatgtttg 780
ttttgtttgc cgcattggca gcgatctcct ttttcggtct gcaacgagcc atgcctgaaa 840
ccgccacgcg tataggcgag aaactgtcac tgaaagaact cggtcgtgac tataagctgg 900
tgctgaagaa cggccgcttt gtggcggggg cgctggcgct gggattcgtt agtctgccgt 960
tgctggcgtg gatcgcccag tcgccgatta tcatcattac cggcgagcag ttgagcagct 1020
atgaatatgg cttgctgcaa gtgcctattt tcggggcgtt aattgcgggt aacttgctgt 1080
tagcgcgtct gacctcgcgc cgcaccgtac gttcgctgat tattatgggc ggctggccga 1140
ttatgattgg tctattggtc gctgctgcgg caacggttat ctcatcgcac gcgtatttat 1200
ggatgactgc cgggttaagt atttatgctt tcggtattgg tctggcgaat gcgggactgg 1260
tgcgattaac cctgtttgcc agcgatatga gtaaaggtac ggtttctgcc gcgatgggaa 1320
tgctgcaaat gctgatcttt accgttggta ttgaaatcag caaacatgcc tggctgaacg 1380
ggggcaacgg actgtttaat ctcttcaacc ttgtcaacgg aattttgtgg ctgtcgctga 1440
tggttatctt tttaaaagat aaacagatgg gaaattctca cgaagggtaa aaaaatgcct 1500
gactgctttg tgcgatcagg cattctcgaa ttaatggtga tggtcgtcaa tctgtcgcga 1560
gg 1562
<210> 20
<211> 3120
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3120)
<223> DaroP::mdfA; 用于将mdfA整合进 delta aroP的构建体
<400> 20
agggcagggt cgttaaatag ccgcttatgt ctattgctgg tctcggtacc cggggatcgc 60
ggccgcggac cggatcctct agacctggcg acgaagcaac aagcccttcg cttcgagacg 120
ttgaatcgcc tcacgcaagg agggacggga gacgtcaaac tgttttgcca gttcgcgttc 180
cggtgggagt ttttcgcccg ggcggagagt gccttcgagg atcaaaaact ccagttgctg 240
ctcaatcaca tcggagagtt ttggttggcg gattttgctg taggccatga gttcctgtct 300
taagccactt gccgaagtca attggtctta ccaatttcat gtctgtgacg ctaaagtaac 360
aaagtattca ccttatgtcc atacaggttt tgattgaaat catgaaactg tgcacatttt 420
aacaacttga catatataac gtttcaaagt tgtaactatg cacaaatgta gactttacgt 480
aggaaaggag ttttttaacg attattaaac tataaaaatc cgaattgaac cgattcactt 540
accaattttg tgatttttaa ttcaattaaa acgaatttaa attcattcta catattgaga 600
ggggttgagg ctgagcttta caaacggttt ctttttaagc aactcatctt caaccatgca 660
taaagcgggt gcattcgctg ccgcatacca ttattcttga tctgacggaa gtctttttgt 720
aacaattcaa acttctttga tgtaaacaaa ttaatacaac aaacggaatt gcaaacttac 780
acacgcatca ctgcgtagat caaaaaaaca accaccgcac gaggttcgcg atacaggcaa 840
gtcgttgaga ataaagtgca ggttaaactg ggtaaagcgg catcgtctta tttccctcaa 900
gcggcctgtt tacggtgggt gattgtaacg ggcataggtt aaataaaact taaagaaagc 960
gtagctatac tcgtaataat gtaagaatgt gcttaaccgt ggtttcagct acaaaattcg 1020
ctttctcgtt agctgcgctt ttattaaact ctgcgcgatt attattggcg aagaaattgc 1080
atgcaaaata aattagcttc cggtgccagg cttggacgtc aggcgttact tttccctctc 1140
tgtctggtgc tttacgaatt ttcaacctat atcggcaacg atatgattca acccggtatg 1200
ttggccgtgg tggaacaata tcaggcgggc attgattggg ttcctacttc gatgaccgcg 1260
tatctggcgg gcgggatgtt tttacaatgg ctgctggggc cgctgtcgga tcgtattggt 1320
cgccgtccgg tgatgctggc gggagtggtg tggtttatcg tcacctgtct ggcaatattg 1380
ctggcgcaaa acattgaaca attcaccctg ttgcgcttct tgcagggcat aagcctctgt 1440
ttcattggcg ctgtgggata cgccgcaatt caggaatcct tcgaagaggc ggtttgtatc 1500
aagatcaccg cgctgatggc gaacgtggcg ctgattgctc cgctacttgg tccgctggtg 1560
ggcgcggcgt ggatccatgt gctgccctgg gaggggatgt ttgttttgtt tgccgcattg 1620
gcagcgatct cctttttcgg tctgcaacga gccatgcctg aaaccgccac gcgtataggc 1680
gagaaactgt cactgaaaga actcggtcgt gactataagc tggtgctgaa gaacggccgc 1740
tttgtggcgg gggcgctggc gctgggattc gttagtctgc cgttgctggc gtggatcgcc 1800
cagtcgccga ttatcatcat taccggcgag cagttgagca gctatgaata tggcttgctg 1860
caagtgccta ttttcggggc gttaattgcg ggtaacttgc tgttagcgcg tctgacctcg 1920
cgccgcaccg tacgttcgct gattattatg ggcggctggc cgattatgat tggtctattg 1980
gtcgctgctg cggcaacggt tatctcatcg cacgcgtatt tatggatgac tgccgggtta 2040
agtatttatg ctttcggtat tggtctggcg aatgcgggac tggtgcgatt aaccctgttt 2100
gccagcgata tgagtaaagg tacggtttct gccgcgatgg gaatgctgca aatgctgatc 2160
tttaccgttg gtattgaaat cagcaaacat gcctggctga acgggggcaa cggactgttt 2220
aatctcttca accttgtcaa cggaattttg tggctgtcgc tgatggttat ctttttaaaa 2280
gataaacaga tgggaaattc tcacgaaggg taaaaaaatg cctgactgct ttgtgcgatc 2340
aggcattctc gaattaatgg tgatggtcgt caatctgtcg cgattacacc aacgccccgt 2400
aaatcgtcag tagtgcaatc accaccacga ccacgaacga ggttttcttc gccattgaaa 2460
ccgctgcctt cggcgtctcc accttatcga catgcggttc acgcgccaga gagaactgcg 2520
ccagacgcgt taacacctga tactgcgaag tatggaaatc acccagcgaa gcaaaccagg 2580
ccggtaacgc tttctcacca tgaccgatca aggcatatac cacacccgca agacgaaccg 2640
gcacccaatc cagtacatga agcacggcat caatgccgga ctgtaaacga tgatgcggcg 2700
tctgatatcg cgccagccag tattgccatg cacgcaaaaa cgcatacccc atcagcgtaa 2760
cgggtcccca ggttcccccc acaatcagcc agaacagcgg tgcaagataa aaacgaaagt 2820
taatccacag caatgcattt tgcagctcac gcaaatactc acgttcgtcg cagcctgccg 2880
ggacgccgtg aatcatggtg agttcgccag ccatcgtggc acgggcatgg ctatcattac 2940
gtgaagcagc tgtcagataa gcatgataat gaagacgaac tttacctgcg ccaatacaca 3000
gcaaaccaat cagcagccac accagtagcg tgggaacgtt gaacaatact ccctgcaatg 3060
cgcgtaacag tctagagtcg accggtggcg aatgggacgc gccctgtagc ggcgcattaa 3120
<210> 21
<211> 3735
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3735)
<223> Dmtr::mdfA; 用于将mdfA整合进delta mtr的构建体
<400> 21
agggcagggt cgttaaatag ccgcttatgt ctattgctgg tctcggtacc cggggatcgc 60
ggccgccagt gtgatggata tctgcagaat tcgcccttgc tggcagaaca ccacaatatg 120
actggcattg ccagtgctgc cacgtcggta ttgatcggct atctggcggc gaataccacc 180
acgctgcatc tggggtctgg cggcgtgatg ttgcctaacc actcaccgtt ggtcattgca 240
gaacagttcg gcacgcttaa tacactctat ccggggcgaa tcgatttggg gctgggtcgt 300
gctccgggta gtgaccaacg gacaatgatg gcgctacgtc gtcatatgag cggcgatatt 360
gataatttcc cccgcgatgt ggcggagctg gtggactggt ttgacgcccg cgatcccaat 420
ccgcatgtgc gcccggtacc aggctatggc gagaaaatcc ccgtgtggtt gttaggctcc 480
agcctttaca gcgcgcaact ggcggcgcag cttggtctgc cgtttgcgtt tgcctcacac 540
ttcgcgccgg atatgctgtt ccaggcgctg catctttatc gcagcaactt caaaccgtca 600
gcacggctgg aaaaaccata cgcgatggtg tgcatcaata ttatcgccgc cgacagcaac 660
cgcgacgctg aatttctgtt tacctcaatg cagcaagcct ttgtgaagct gcgccgtggc 720
gaaaccgggc aactgccgcc gccgattcaa aatatggatc agttctggtc accgtctgag 780
cagtatggcg tgcagcaggc gctgagtatg tcgttggtag gtgataaagc gaaagtgcgt 840
catggcttgc agtcgatcct gcgcgaaacc gacgccgatg agattatggt caacgggcag 900
attttcgacc accaggcgcg gctgcattcg tttgagctgg cgatggatgt taaggaagag 960
ttgttgggat agtgtgtctt aacgcgggaa gccttatccg agctggcaac gctgtcctac 1020
atagacctga taagcgaagc gcatcaggca ttgtgtaggc agcagaaatg tcggataagg 1080
caccgctgat tactctagat tcgcgacaga ttgacgacca tcaccattaa ttcgagaatg 1140
cctgatcgca caaagcagtc aggcattttt ttacccttcg tgagaatttc ccatctgttt 1200
atcttttaaa aagataacca tcagcgacag ccacaaaatt ccgttgacaa ggttgaagag 1260
attaaacagt ccgttgcccc cgttcagcca ggcatgtttg ctgatttcaa taccaacggt 1320
aaagatcagc atttgcagca ttcccatcgc ggcagaaacc gtacctttac tcatatcgct 1380
ggcaaacagg gttaatcgca ccagtcccgc attcgccaga ccaataccga aagcataaat 1440
acttaacccg gcagtcatcc ataaatacgc gtgcgatgag ataaccgttg ccgcagcagc 1500
gaccaataga ccaatcataa tcggccagcc gcccataata atcagcgaac gtacggtgcg 1560
gcgcgaggtc agacgcgcta acagcaagtt acccgcaatt aacgccccga aaataggcac 1620
ttgcagcaag ccatattcat agctgctcaa ctgctcgccg gtaatgatga taatcggcga 1680
ctgggcgatc cacgccagca acggcagact aacgaatccc agcgccagcg cccccgccac 1740
aaagcggccg ttcttcagca ccagcttata gtcacgaccg agttctttca gtgacagttt 1800
ctcgcctata cgcgtggcgg tttcaggcat ggctcgttgc agaccgaaaa aggagatcgc 1860
tgccaatgcg gcaaacaaaa caaacatccc ctcccagggc agcacatgga tccacgccgc 1920
gcccaccagc ggaccaagta gcggagcaat cagcgccacg ttcgccatca gcgcggtgat 1980
cttgatacaa accgcctctt cgaaggattc ctgaattgcg gcgtatccca cagcgccaat 2040
gaaacagagg cttatgccct gcaagaagcg caacagggtg aattgttcaa tgttttgcgc 2100
cagcaatatt gccagacagg tgacgataaa ccacaccact cccgccagca tcaccggacg 2160
gcgaccaata cgatccgaca gcggccccag cagccattgt aaaaacatcc cgcccgccag 2220
atacgcggtc atcgaagtag gaacccaatc aatgcccgcc tgatattgtt ccaccacggc 2280
caacataccg ggttgaatca tatcgttgcc gatataggtt gaaaattcgt aaagcaccag 2340
acagagaggg aaaagtaacg cctgacgtcc aagcctggca ccggaagcta atttattttg 2400
catgcaattt cttcgccaat aataatcgcg cagagtttaa taaaagcgca gctaacgaga 2460
aagcgaattt tgtagctgaa accacggtta agcacattct tacattatta cgagtatagc 2520
tacgctttct ttaagtttta tttaacctat gcccgttaca atcacccacc gtaaacaggc 2580
cgcttgaggg aaataagacg atgccgcttt acccagttta acctgcactt tattctcaac 2640
gacttgcctg tatcgcgagg gcttctctcc agtgaaaaat agtgcgactg cgttgttatg 2700
cattgcactg taccagtaca cgagtacaaa agacagaaaa aaagccccga tggtaaaaat 2760
cggggctgta tatattattt tacagattgt gttcgctgtt cagcgatgat tacgcatcac 2820
caccgaaacg acgacgaccg gtagaatcat cacgacgcgg agcgcggcct tcacgacgtt 2880
cgccgctaaa acgacgacca tcaccacggc caccttcacg gcgttcaccg ctgaagttac 2940
gaccgccttc acgacgttcg ccaccgaaac cacgaccacc gccacgacgc tcaccgccag 3000
tatgcggctg tgcatcgccc agtaactgca tgttcatcgg cttgttgaga atgcgagtgc 3060
gcgtaaagtg ttgcagcact tcacccggca tacctttcgg cagttcgatg gtggagtgag 3120
aagcaaacag cttgatgtta ccaatgtaac ggctgctgat gtcgccttcg ttagcaatcg 3180
caccaacgat atgacgaact tcaacaccat catcgcggcc cacttcaatg cggtacagct 3240
gcatatcgcc aacatcacga cgttcacgac gcggacgatc ttcacggtca ccacgcgggc 3300
cacggtcgtt acgatcgcgc ggaccacggt catcacggtc acggaattca cgtttcggac 3360
gcatcggcgc atctggcggt acgatcagag tacgttcacc ctgtgccatt ttcagcagtg 3420
ccgcagccag agtttcgaga tccagctctt caccttcagc agtcggctga attttgctca 3480
gcagtgcgcg gtattgatcc agatcgctgc tttccagctg ctgctgtact ttagcggcga 3540
atttttccag acggcgtttg cctagcagtt ctgcgttcgg cagttctact tccggaatag 3600
tcagcttcat agtacgttca atgttgcgca gcagacgacg ctcgcggttc tcaaaagggc 3660
gaattccagc acactggcgg ccgttactag agtcgaccgg tggcgaatgg gacgcgccct 3720
gtagcggcgc attaa 3735
<210> 22
<211> 1436
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1436)
<223> 染色体上的delta aroP
<400> 22
cctggcgacg aagcaacaag cccttcgctt cgagacgttg aatcgcctca cgcaaggagg 60
gacgggagac gtcaaactgt tttgccagtt cgcgttccgg tgggagtttt tcgcccgggc 120
ggagagtgcc ttcgaggatc aaaaactcca gttgctgctc aatcacatcg gagagttttg 180
gttggcggat tttgctgtag gccatgagtt cctgtcttaa gccacttgcc gaagtcaatt 240
ggtcttacca atttcatgtc tgtgacgcta aagtaacaaa gtattcacct tatgtccata 300
caggttttga ttgaaatcat gaaactgtgc acattttaac aacttgacat atataacgtt 360
tcaaagttgt aactatgcac aaatgtagac tttacgtagg aaaggagttt tttaacgatt 420
attaaactat aaaaatccga attgaaccga ttcacttacc aattttgtga tttttaattc 480
aattaaaacg aatttaaatt cattctacat attgagaggg gttgaggctg agctttacaa 540
acggtttctt tttaagcaac tcatcttcaa ccatgcataa agcgggtgca ttcgctgccg 600
cataccatta ttcttgatct gacggaagtc tttttgtaac aattcaaact tctttgatgt 660
aaacaaatta atacaacaaa cggaattgca aacttacaca cgcatcactg cgtagatcaa 720
aaaaacaacc accgcacgag gttcgcgatt acaccaacgc cccgtaaatc gtcagtagtg 780
caatcaccac cacgaccacg aacgaggttt tcttcgccat tgaaaccgct gccttcggcg 840
tctccacctt atcgacatgc ggttcacgcg ccagagagaa ctgcgccaga cgcgttaaca 900
cctgatactg cgaagtatgg aaatcaccca gcgaagcaaa ccaggccggt aacgctttct 960
caccatgacc gatcaaggca tataccacac ccgcaagacg aaccggcacc caatccagta 1020
catgaagcac ggcatcaatg ccggactgta aacgatgatg cggcgtctga tatcgcgcca 1080
gccagtattg ccatgcacgc aaaaacgcat accccatcag cgtaacgggt ccccaggttc 1140
cccccacaat cagccagaac agcggtgcaa gataaaaacg aaagttaatc cacagcaatg 1200
cattttgcag ctcacgcaaa tactcacgtt cgtcgcagcc tgccgggacg ccgtgaatca 1260
tggtgagttc gccagccatc gtggcacggg catggctatc attacgtgaa gcagctgtca 1320
gataagcatg ataatgaaga cgaactttac ctgcgccaat acacagcaaa ccaatcagca 1380
gccacaccag tagcgtggga acgttgaaca atactccctg caatgcgcgt aacagt 1436
<210> 23
<211> 2988
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2988)
<223> 染色体上delta aroP中的mdfA
<400> 23
cctggcgacg aagcaacaag cccttcgctt cgagacgttg aatcgcctca cgcaaggagg 60
gacgggagac gtcaaactgt tttgccagtt cgcgttccgg tgggagtttt tcgcccgggc 120
ggagagtgcc ttcgaggatc aaaaactcca gttgctgctc aatcacatcg gagagttttg 180
gttggcggat tttgctgtag gccatgagtt cctgtcttaa gccacttgcc gaagtcaatt 240
ggtcttacca atttcatgtc tgtgacgcta aagtaacaaa gtattcacct tatgtccata 300
caggttttga ttgaaatcat gaaactgtgc acattttaac aacttgacat atataacgtt 360
tcaaagttgt aactatgcac aaatgtagac tttacgtagg aaaggagttt tttaacgatt 420
attaaactat aaaaatccga attgaaccga ttcacttacc aattttgtga tttttaattc 480
aattaaaacg aatttaaatt cattctacat attgagaggg gttgaggctg agctttacaa 540
acggtttctt tttaagcaac tcatcttcaa ccatgcataa agcgggtgca ttcgctgccg 600
cataccatta ttcttgatct gacggaagtc tttttgtaac aattcaaact tctttgatgt 660
aaacaaatta atacaacaaa cggaattgca aacttacaca cgcatcactg cgtagatcaa 720
aaaaacaacc accgcacgag gttcgcgata caggcaagtc gttgagaata aagtgcaggt 780
taaactgggt aaagcggcat cgtcttattt ccctcaagcg gcctgtttac ggtgggtgat 840
tgtaacgggc ataggttaaa taaaacttaa agaaagcgta gctatactcg taataatgta 900
agaatgtgct taaccgtggt ttcagctaca aaattcgctt tctcgttagc tgcgctttta 960
ttaaactctg cgcgattatt attggcgaag aaattgcatg caaaataaat tagcttccgg 1020
tgccaggctt ggacgtcagg cgttactttt ccctctctgt ctggtgcttt acgaattttc 1080
aacctatatc ggcaacgata tgattcaacc cggtatgttg gccgtggtgg aacaatatca 1140
ggcgggcatt gattgggttc ctacttcgat gaccgcgtat ctggcgggcg ggatgttttt 1200
acaatggctg ctggggccgc tgtcggatcg tattggtcgc cgtccggtga tgctggcggg 1260
agtggtgtgg tttatcgtca cctgtctggc aatattgctg gcgcaaaaca ttgaacaatt 1320
caccctgttg cgcttcttgc agggcataag cctctgtttc attggcgctg tgggatacgc 1380
cgcaattcag gaatccttcg aagaggcggt ttgtatcaag atcaccgcgc tgatggcgaa 1440
cgtggcgctg attgctccgc tacttggtcc gctggtgggc gcggcgtgga tccatgtgct 1500
gccctgggag gggatgtttg ttttgtttgc cgcattggca gcgatctcct ttttcggtct 1560
gcaacgagcc atgcctgaaa ccgccacgcg tataggcgag aaactgtcac tgaaagaact 1620
cggtcgtgac tataagctgg tgctgaagaa cggccgcttt gtggcggggg cgctggcgct 1680
gggattcgtt agtctgccgt tgctggcgtg gatcgcccag tcgccgatta tcatcattac 1740
cggcgagcag ttgagcagct atgaatatgg cttgctgcaa gtgcctattt tcggggcgtt 1800
aattgcgggt aacttgctgt tagcgcgtct gacctcgcgc cgcaccgtac gttcgctgat 1860
tattatgggc ggctggccga ttatgattgg tctattggtc gctgctgcgg caacggttat 1920
ctcatcgcac gcgtatttat ggatgactgc cgggttaagt atttatgctt tcggtattgg 1980
tctggcgaat gcgggactgg tgcgattaac cctgtttgcc agcgatatga gtaaaggtac 2040
ggtttctgcc gcgatgggaa tgctgcaaat gctgatcttt accgttggta ttgaaatcag 2100
caaacatgcc tggctgaacg ggggcaacgg actgtttaat ctcttcaacc ttgtcaacgg 2160
aattttgtgg ctgtcgctga tggttatctt tttaaaagat aaacagatgg gaaattctca 2220
cgaagggtaa aaaaatgcct gactgctttg tgcgatcagg cattctcgaa ttaatggtga 2280
tggtcgtcaa tctgtcgcga ttacaccaac gccccgtaaa tcgtcagtag tgcaatcacc 2340
accacgacca cgaacgaggt tttcttcgcc attgaaaccg ctgccttcgg cgtctccacc 2400
ttatcgacat gcggttcacg cgccagagag aactgcgcca gacgcgttaa cacctgatac 2460
tgcgaagtat ggaaatcacc cagcgaagca aaccaggccg gtaacgcttt ctcaccatga 2520
ccgatcaagg catataccac acccgcaaga cgaaccggca cccaatccag tacatgaagc 2580
acggcatcaa tgccggactg taaacgatga tgcggcgtct gatatcgcgc cagccagtat 2640
tgccatgcac gcaaaaacgc ataccccatc agcgtaacgg gtccccaggt tccccccaca 2700
atcagccaga acagcggtgc aagataaaaa cgaaagttaa tccacagcaa tgcattttgc 2760
agctcacgca aatactcacg ttcgtcgcag cctgccggga cgccgtgaat catggtgagt 2820
tcgccagcca tcgtggcacg ggcatggcta tcattacgtg aagcagctgt cagataagca 2880
tgataatgaa gacgaacttt acctgcgcca atacacagca aaccaatcag cagccacacc 2940
agtagcgtgg gaacgttgaa caatactccc tgcaatgcgc gtaacagt 2988
<210> 24
<211> 2004
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2004)
<223> 染色体上的delta mtr
<400> 24
gctggcagaa caccacaata tgactggcat tgccagtgct gccacgtcgg tattgatcgg 60
ctatctggcg gcgaatacca ccacgctgca tctggggtct ggcggcgtga tgttgcctaa 120
ccactcaccg ttggtcattg cagaacagtt cggcacgctt aatacactct atccggggcg 180
aatcgatttg gggctgggtc gtgctccggg tagtgaccaa cggacaatga tggcgctacg 240
tcgtcatatg agcggcgata ttgataattt cccccgcgat gtggcggagc tggtggactg 300
gtttgacgcc cgcgatccca atccgcatgt gcgcccggta ccaggctatg gcgagaaaat 360
ccccgtgtgg ttgttaggct ccagccttta cagcgcgcaa ctggcggcgc agcttggtct 420
gccgtttgcg tttgcctcac acttcgcgcc ggatatgctg ttccaggcgc tgcatcttta 480
tcgcagcaac ttcaaaccgt cagcacggct ggaaaaacca tacgcgatgg tgtgcatcaa 540
tattatcgcc gccgacagca accgcgacgc tgaatttctg tttacctcaa tgcagcaagc 600
ctttgtgaag ctgcgccgtg gcgaaaccgg gcaactgccg ccgccgattc aaaatatgga 660
tcagttctgg tcaccgtctg agcagtatgg cgtgcagcag gcgctgagta tgtcgttggt 720
aggtgataaa gcgaaagtgc gtcatggctt gcagtcgatc ctgcgcgaaa ccgacgccga 780
tgagattatg gtcaacgggc agattttcga ccaccaggcg cggctgcatt cgtttgagct 840
ggcgatggat gttaaggaag agttgttggg atagtgtgtc ttaacgcggg aagccttatc 900
cgagctggca acgctgtcct acatagacct gataagcgaa gcgcatcagg cattgtgtag 960
gcagcagaaa tgtcggataa ggcaccgctg attactctag attcgcgagg gcttctctcc 1020
agtgaaaaat agtgcgactg cgttgttatg cattgcactg taccagtaca cgagtacaaa 1080
agacagaaaa aaagccccga tggtaaaaat cggggctgta tatattattt tacagattgt 1140
gttcgctgtt cagcgatgat tacgcatcac caccgaaacg acgacgaccg gtagaatcat 1200
cacgacgcgg agcgcggcct tcacgacgtt cgccgctaaa acgacgacca tcaccacggc 1260
caccttcacg gcgttcaccg ctgaagttac gaccgccttc acgacgttcg ccaccgaaac 1320
cacgaccacc gccacgacgc tcaccgccag tatgcggctg tgcatcgccc agtaactgca 1380
tgttcatcgg cttgttgaga atgcgagtgc gcgtaaagtg ttgcagcact tcacccggca 1440
tacctttcgg cagttcgatg gtggagtgag aagcaaacag cttgatgtta ccaatgtaac 1500
ggctgctgat gtcgccttcg ttagcaatcg caccaacgat atgacgaact tcaacaccat 1560
catcgcggcc cacttcaatg cggtacagct gcatatcgcc aacatcacga cgttcacgac 1620
gcggacgatc ttcacggtca ccacgcgggc cacggtcgtt acgatcgcgc ggaccacggt 1680
catcacggtc acggaattca cgtttcggac gcatcggcgc atctggcggt acgatcagag 1740
tacgttcacc ctgtgccatt ttcagcagtg ccgcagccag agtttcgaga tccagctctt 1800
caccttcagc agtcggctga attttgctca gcagtgcgcg gtattgatcc agatcgctgc 1860
tttccagctg ctgctgtact ttagcggcga atttttccag acggcgtttg cctagcagtt 1920
ctgcgttcgg cagttctact tccggaatag tcagcttcat agtacgttca atgttgcgca 1980
gcagacgacg ctcgcggttc tcaa 2004
<210> 25
<211> 3553
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3553)
<223> 染色体上 delta mtr中的 mdfA
<400> 25
ctggcagaac accacaatat gactggcatt gccagtgctg ccacgtcggt attgatcggc 60
tatctggcgg cgaataccac cacgctgcat ctggggtctg gcggcgtgat gttgcctaac 120
cactcaccgt tggtcattgc agaacagttc ggcacgctta atacactcta tccggggcga 180
atcgatttgg ggctgggtcg tgctccgggt agtgaccaac ggacaatgat ggcgctacgt 240
cgtcatatga gcggcgatat tgataatttc ccccgcgatg tggcggagct ggtggactgg 300
tttgacgccc gcgatcccaa tccgcatgtg cgcccggtac caggctatgg cgagaaaatc 360
cccgtgtggt tgttaggctc cagcctttac agcgcgcaac tggcggcgca gcttggtctg 420
ccgtttgcgt ttgcctcaca cttcgcgccg gatatgctgt tccaggcgct gcatctttat 480
cgcagcaact tcaaaccgtc agcacggctg gaaaaaccat acgcgatggt gtgcatcaat 540
attatcgccg ccgacagcaa ccgcgacgct gaatttctgt ttacctcaat gcagcaagcc 600
tttgtgaagc tgcgccgtgg cgaaaccggg caactgccgc cgccgattca aaatatggat 660
cagttctggt caccgtctga gcagtatggc gtgcagcagg cgctgagtat gtcgttggta 720
ggtgataaag cgaaagtgcg tcatggcttg cagtcgatcc tgcgcgaaac cgacgccgat 780
gagattatgg tcaacgggca gattttcgac caccaggcgc ggctgcattc gtttgagctg 840
gcgatggatg ttaaggaaga gttgttggga tagtgtgtct taacgcggga agccttatcc 900
gagctggcaa cgctgtccta catagacctg ataagcgaag cgcatcaggc attgtgtagg 960
cagcagaaat gtcggataag gcaccgctga ttactctaga ttcgcgacag attgacgacc 1020
atcaccatta attcgagaat gcctgatcgc acaaagcagt caggcatttt tttacccttc 1080
gtgagaattt cccatctgtt tatcttttaa aaagataacc atcagcgaca gccacaaaat 1140
tccgttgaca aggttgaaga gattaaacag tccgttgccc ccgttcagcc aggcatgttt 1200
gctgatttca ataccaacgg taaagatcag catttgcagc attcccatcg cggcagaaac 1260
cgtaccttta ctcatatcgc tggcaaacag ggttaatcgc accagtcccg cattcgccag 1320
accaataccg aaagcataaa tacttaaccc ggcagtcatc cataaatacg cgtgcgatga 1380
gataaccgtt gccgcagcag cgaccaatag accaatcata atcggccagc cgcccataat 1440
aatcagcgaa cgtacggtgc ggcgcgaggt cagacgcgct aacagcaagt tacccgcaat 1500
taacgccccg aaaataggca cttgcagcaa gccatattca tagctgctca actgctcgcc 1560
ggtaatgatg ataatcggcg actgggcgat ccacgccagc aacggcagac taacgaatcc 1620
cagcgccagc gcccccgcca caaagcggcc gttcttcagc accagcttat agtcacgacc 1680
gagttctttc agtgacagtt tctcgcctat acgcgtggcg gtttcaggca tggctcgttg 1740
cagaccgaaa aaggagatcg ctgccaatgc ggcaaacaaa acaaacatcc cctcccaggg 1800
cagcacatgg atccacgccg cgcccaccag cggaccaagt agcggagcaa tcagcgccac 1860
gttcgccatc agcgcggtga tcttgataca aaccgcctct tcgaaggatt cctgaattgc 1920
ggcgtatccc acagcgccaa tgaaacagag gcttatgccc tgcaagaagc gcaacagggt 1980
gaattgttca atgttttgcg ccagcaatat tgccagacag gtgacgataa accacaccac 2040
tcccgccagc atcaccggac ggcgaccaat acgatccgac agcggcccca gcagccattg 2100
taaaaacatc ccgcccgcca gatacgcggt catcgaagta ggaacccaat caatgcccgc 2160
ctgatattgt tccaccacgg ccaacatacc gggttgaatc atatcgttgc cgatataggt 2220
tgaaaattcg taaagcacca gacagagagg gaaaagtaac gcctgacgtc caagcctggc 2280
accggaagct aatttatttt gcatgcaatt tcttcgccaa taataatcgc gcagagttta 2340
ataaaagcgc agctaacgag aaagcgaatt ttgtagctga aaccacggtt aagcacattc 2400
ttacattatt acgagtatag ctacgctttc tttaagtttt atttaaccta tgcccgttac 2460
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aacctgcact ttattctcaa cgacttgcct gtatcgcgag ggcttctctc cagtgaaaaa 2580
tagtgcgact gcgttgttat gcattgcact gtaccagtac acgagtacaa aagacagaaa 2640
aaaagccccg atggtaaaaa tcggggctgt atatattatt ttacagattg tgttcgctgt 2700
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