阅读说明：本技术 一种氧化磷哚衍生物及其制备方法与化学生物学应用 (Phosphoro indole derivative, preparation method and chemical and biological application thereof ) 是由 唐本忠 赵祖金 庄泽燕 秦安军 胡蓉蓉 王志明 于 2019-12-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种氧化磷哚衍生物及其制备方法与化学生物学应用。该氧化磷哚衍生物是以氧化磷哚为基本受体结构单元,在含磷五元环的α或β位点连接三苯胺作为给体单元,并在剩余的β或α位点连接吡啶作为烷基化成盐单元。该类化合物可应用于化学生物学领域。本发明提供的氧化磷哚衍生物能够应用在制备光动力治疗肿瘤或肿瘤细胞的药物中。本发明提供的氧化磷哚衍生物能够应用在细胞成像及死细胞特异性标记中。本发明提供的氧化磷哚衍生物能够应用在微生物成像及抗微生物黏附中。本发明化合物的特点是兼具良好的化学稳定性、热稳定性、抗光漂白能力、生物相容性及大的斯托克斯位移、高的聚集态荧光量子产率、高的成像信噪比。(The invention discloses a phosphorus oxide indole derivative, a preparation method and chemical and biological application thereof. The phosphorus oxide indole derivative is characterized in that phosphorus oxide is taken as a basic acceptor structural unit, triphenylamine is connected to alpha or beta sites of a phosphorus-containing five-membered ring to be taken as a donor unit, and pyridine is connected to the rest beta or alpha sites to be taken as an alkylation salifying unit. The compounds can be applied to the field of chemical biology. The phosphorus oxide indole derivative provided by the invention can be applied to the preparation of medicines for photodynamic therapy of tumors or tumor cells. The phosphorus oxide indole derivative provided by the invention can be applied to cell imaging and dead cell specific marking. The phosphorus oxide indole derivative provided by the invention can be applied to microbial imaging and antimicrobial adhesion. The compound has the characteristics of good chemical stability, thermal stability, photobleaching resistance, biocompatibility, large Stokes shift, high aggregative state fluorescence quantum yield and high imaging signal-to-noise ratio.)

一种氧化磷哚衍生物及其制备方法与化学生物学应用

技术领域

本发明涉及化学生物学领域，具体涉及一种氧化磷哚衍生物及其制备方法与化学生物学应用。

背景技术

化学生物学是一门新兴的通过化学的手段和方法在分子层面上研究生命现象和解决生物学问题的化学和生物学的交叉学科，同时涉及生物化学、细胞生物学、微生物生物学、分子生物学、分子药理学、分子毒理学等学科。化学生物学的发展和应用为药物创新和材料开发提供必不可少的理论依据和实验基础。

化学生物学研究的基本过程是以具有活性和功能的小分子化合物为基础，通过生物的技术方法寻找它在生物体内的靶向作用分子，并研究它们之间的相互作用关系，进一步运用化学方法对其进行相应功能的结构优化和改造，从而开发出全新的具有特定功能的活性小分子，进而探索它们在生物体内的相互作用机制，揭示生理或病理过程的发生、发展原理，并依据此来对诊断和治疗措施进行进一步的优化和完善。其研究内容包括化学分子的获得、生物化学功能、生物学功能及在生物医药领域的应用。

有机合成技术为化学生物学提供多样化的化学物质。其中，有机荧光分子由于其信号灵敏、直观且易于采集的特点，成为化学生物学研究中一类重要的研究对象，并在荧光成像、生物标记、化学传感、光动力治疗等方向具有广阔的应用前景。

目前商业化的有机荧光分子的设计和开发是以香豆素、氟化硼二吡咯、荧光素、罗丹、明恶嗪、花色素苷为代表的传统荧光发色团为单元核心进行功能修饰的，但其核心单元本身存在的斯托克斯位移小、聚集导致猝灭、抗光漂白性差、成像信噪比低等缺点，往往需要采取进一步复杂的化学修饰或物理工艺去规避这些问题，但与此同时又会带来制备方法复杂、稳定性下降、关键性质改变或性能下降等问题(ACS Chem.Biol.2014,9,855-866)。因此开发合成简单、具有高效稳定的荧光信号且具有特定生物功能的有机荧光分子是当前化学生物学发展的迫切需求。

发明内容

为了克服现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种氧化磷哚衍生物及其制备方法与化学生物学应用。

本发明的目的在于提供一种满足检测需求且具有特定生物功能氧化磷哚衍生物，以作为化学生物学研究中的基础化合物。该类化合物可应用于：制备光动力治疗肿瘤或肿瘤细胞的药物、细胞成像及死细胞特异性标记、微生物成像及抗微生物黏附。

本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。

本发明提供的氧化磷哚衍生物，是以氧化磷哚为基本受体结构单元，在含磷五元环的α或β位点连接三苯胺作为给体单元，并在剩余的β或α位点连接吡啶作为烷基化成盐单元，其结构通式为

中的一种；

其中，R₁为C_1-12的烷基、C_1-12的烷氧基或芳基；R₂为取代苯；R₃为取代苯；R₄为取代苯；R₅为取代吡啶；R₆为C_1-12的烷基；R₇为碘离子、溴离子、氯离子、六氟磷酸根、取代苯磺酸根或取代苯硼酸根离子。

本发明提供的一种制备所述的氧化磷哚衍生物的方法，其化学方程式如下所示：

其中，R₁为C_1-12的烷基、C_1-12的烷氧基或芳基；R₂为取代苯；R₃为取代苯；R₄为取代苯；R₅为取代吡啶；R₆为C_1-12的烷基；X为碘、溴或氯原子； A为钠、钾离子；R₇为六氟磷酸根、取代苯磺酸根或取代苯硼酸根离子。

本发明提供的氧化磷哚衍生物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将具有目标取代基的内炔中间体、取代苯基膦酸乙酯和催化剂加入有机溶剂中，混合均匀，升温进行成环反应，层析色谱柱分离，得到未成盐的氧化磷哚衍生物；

(2)将步骤(1)所述未成盐的氧化磷哚衍生物与烷基化试剂加入有机溶剂中，升温进行加热反应，重结晶得到以含卤素负离子的成盐氧化磷哚衍生物；

(3)将步骤(3)所述含卤素负离子的成盐氧化磷哚衍生物与金属盐在水中室温反应，沉淀得到所述氧化磷哚衍生物。

进一步地，步骤(1)所述取代苯基膦酸乙酯的结构式如下所示：

其中，R₁为C_1-12的烷基、C_1-12的烷氧基或芳基；R₂为取代苯；

步骤(1)所述具有目标取代基的内炔中间体的取代基为取代三苯胺或取代吡啶；所述具有目标取代基的内炔中间体的结构式如下所示：

其中，R₃为取代苯；R₄为取代苯；R₅为取代吡啶。

进一步地，步骤(1)所述催化剂为氧化银、硝酸银或醋酸银；所述催化剂与具有目标取代基的内炔中间体、取代苯基膦酸乙酯的当量比(摩尔比)为 (2-4):1:(2-4)；所述有机溶剂为二甲基甲酰胺、乙腈、甲苯或二氧六环；所述取代苯基膦酸乙酯与有机溶剂的质量体积比为1g：(10-50)mL；所述成环反应的温度为80-150℃，成环反应的时间为6-24小时。

进一步地，步骤(2)所述烷基化试剂为含烷基链长度为1-12的1-卤素取代物，所述卤素取代物为碘取代物、溴取代物及氯取代物中的一种；所述未成盐的氧化磷哚衍生物与烷基化试剂的当量比(摩尔比)为1:(1-10)；所述有机溶剂为四氢呋喃、乙腈、甲苯及二氧六环中的一种及以上；所述未成盐的氧化磷哚衍生物与有机溶剂的质量体积比为1g：(10-50)mL；步骤(2)所述加热反应的温度为80-150℃，加热反应的时间为0-24h。

进一步地，步骤(3)所述金属盐为含钠或钾离子的金属盐；所述金属盐为六氟磷酸盐、取代苯磺酸盐或取代苯硼酸盐；所述含卤素负离子的成盐氧化磷哚衍生物与金属盐的当量比为1:(1-10)；所述含卤素负离子的成盐氧化磷哚衍生物与水的质量体积比为1g：(10-50)mL，反应的时间为0-24h。

本发明提供的氧化磷哚衍生物能够应用在制备光动力治疗肿瘤或肿瘤细胞的药物中。

本发明提供的氧化磷哚衍生物能够应用在细胞成像及死细胞特异性标记中。

本发明提供的氧化磷哚衍生物能够应用在微生物成像及抗微生物黏附中。

本发明化合物的特点是兼具良好的化学稳定性、热稳定性、抗光漂白能力、生物相容性及大的斯托克斯位移、高的聚集态荧光量子产率、高的成像信噪比。其中，未成盐化合物具有良好的亲脂性，发光颜色为黄绿光；成盐化合物具有良好的两亲性，发光颜色为红光。

根据需要及目标结构化合物，通过简单的合成步骤，即可获得本发明所述的氧化磷哚衍生物。

在实施例中，未成盐的氧化磷哚衍生物可通过连接目标取代基(三苯胺和吡啶)的内炔中间体与苯基膦酸乙酯进行成环反应，同时制得两种同分异构体，通过层析色谱柱法分离。所得化合物与相应的烷基化试剂反应，即可通过重结晶得到相应的成盐的氧化磷哚衍生物。

将本发明所述的氧化磷哚衍生物应用于化学生物学领域，具体为制备光动力治疗肿瘤或肿瘤细胞的药物、细胞成像及死细胞特异性标记、微生物成像及抗微生物黏附。

其具体实施方法分别为：

使用有机溶剂将所述化合物溶解后加入到细胞培养液中，与待测细胞共培养0.5-24h，使化合物与细胞充分作用后，施以光照后再培养0.5-24h，随后检测细胞活力以证明化合物进行光动力治疗肿瘤细胞的能力。

使用有机溶剂将所述化合物溶解后加入到细胞培养液中，与待测细胞共培养0.5-24h，使化合物与细胞充分作用后，进行荧光显微观察以证明化合物进行细胞荧光成像的效果。化合物的特异性标记能力通过比较不同细胞中的作用效果实现。

使用有机溶剂将所述化合物溶解后加入到微生物培养液中，与待测微生物共培养0.5-24h，使化合物与微生物充分作用后，进行荧光显微观察以证明化合物进行微生物荧光成像的效果、检测微生物生长曲线以证明化合物的抗微生物黏附能力。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

(1)本发明提供的氧化磷哚衍生物具有良好的化学稳定性、热稳定性、抗光漂白能力、生物相容性及大的斯托克斯位移、高的聚集态荧光量子产率、高的成像信噪比；

(2)本发明提供的氧化磷哚衍生物未成盐化合物时，具有良好的亲脂性，发光颜色为黄绿光；成盐化合物时，具有良好的两亲性，发光颜色为红光；可用于细胞成像及死细胞特异性标记中；

(3)本发明提供的氧化磷哚衍生物，能够通过简单的合成步骤得到，成本低。

附图说明

图1为化合物α-TPA-PIO和化合物β-TPA-PIO在磷酸缓冲盐溶液中和海拉细胞内的活性氧生成能力折线图；

图2为化合物α-TPA-PIO和化合物β-TPA-PIO对细胞进行的不同光照剂量和浓度剂量的光动力杀伤后的细胞存活率折线图；

图3为化合物α-TPA-PIO-Me-I在活细胞和死细胞中的荧光成像图片；

图4为化合物α-TPA-PIO-Me-PF₆在金黄色葡萄球菌中的荧光成像图片。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。

实施例1

一种氧化磷哚衍生物，其合成方法，包括如下步骤：

按照如下合成路线，具体合成化合物α-TPA-PIO和化合物β-TPA-PIO：在双口瓶中称取3.46g分子1、3.40g苯基膦酸乙酯和4.62g氧化银，加入60mL N，N-二甲基甲酰胺，在氮气保护下100℃下反应10h；冷却到室温后，通过硅藻土过滤除去反应物中的不溶性固体；滤液用饱和食盐水萃取三次；随后以石油醚/四氢呋喃(4/1v/v)作为洗脱剂进行层析硅胶柱分离，得到黄色固体(化合物α-TPA-PIO)2.4g，产率为47％；继续以石油醚/四氢呋喃(2/1v/v)作为洗脱剂进行层析硅胶柱分离，得到黄色固体(化合物β-TPA-PIO)1.1g，产率为23％。

化合物α-TPA-PIO：¹H NMR(500MHz,CD₂Cl₂),δ(TMS,ppm):8.68(d,J＝ 4.5Hz,2H),7.75–7.68(m,1H),7.48–7.38(m,2H),7.30–7.23(m,6H),7.22–7.18 (m,2H),7.09–7.03(m,6H),7.00–6.96(m,1H),6.86–6.81(m,2H),4.12–4.02(m, 2H),1.30–1.23(m,3H).¹³C NMR(125MHz,CD₂Cl₂),δ(TMS,ppm):151.0,148.5, 147.4,143.7(d,J＝29.0Hz),143.5(d,J＝18.9Hz),141.6(d,J＝34.0Hz),133.6 (d,J＝1.3Hz),131.4(d,J＝123.5Hz),130.1(d,J＝6.5Hz),129.8,129.4(d,J＝ 12.6Hz),128.1(d,J＝8.8Hz),127.2(d,J＝133.6Hz),125.69,124.9(d,J＝8.8 Hz)124.32,124.22,123.5(d,J＝12.6Hz),121.77,62.69(d,J＝6.3Hz),16.69(d, J＝6.3Hz).HRMS(C₃₃H₂₇N₂O₂P):m/z 514.1780(M⁺,calcd 514.1810).

化合物β-TPA-PIO：¹H NMR(500MHz,CD₂Cl₂),δ(TMS,ppm):8.48(d,J＝ 5.0Hz,2H),7.77–7.71(m,1H),7.56–7.45(m,2H),7.37–7.33(m,1H),7.31(m, 6H),7.17–7.12(m,4H),7.12–7.03(m,6H),4.10–3.97(m,2H),1.26–1.20(m,3H). ¹³C NMR(125MHz,CD₂Cl₂),δ(TMS,ppm):152.3(d,J＝26.3Hz),150.2,149.3, 147.5,141.6(d,J＝33.8Hz),141.4(d,J＝8.8Hz),133.5(d,J＝1.3Hz),130.2, 130.1(d,J＝11.3Hz),129.9,128.1(d,J＝133.6Hz),128.0(d,J＝8.8Hz),127.2 (d,J＝123.5Hz),125.9(d,J＝17.6Hz),125.6,125.0(d,J＝1.3Hz),124.2,123.7, 122.5,62.7(d,J＝6.3Hz),16.7(d,J＝6.3Hz).HRMS(C₃₃H₂₇N₂O₂P):m/z 514.1793(M⁺,calcd 514.1810).

实施例2按照如下合成路线，具体合成化合物α-TPA-PIO-Me-I和化合物α-TPA-PIO-Me-PF₆：在茄形瓶中称取100mg分子α-TPA-PIO溶于10mL四氢呋喃中，加入0.1mL碘甲烷，加热回流反应12h(温度为100℃)。冷却到室温后，将沉淀过滤，并用正己烷洗涤沉淀物，得到红色固体(化合物α-TPA-PIO-Me-I)110mg，产率为86％；在茄形瓶中称取50mg分子α-TPA-PIO-Me-I和30mg六氟磷酸钾溶于10mL水中反应2h后，将沉淀过滤，并用正己烷洗涤沉淀物，得到红色固体(化合物α-TPA-PIO-Me-PF₆)47mg，产率为92％。

化合物α-TPA-PIO-Me-I：¹H NMR(500MHz,CD₃OD),δ(TMS,ppm):8.98 (d,J＝7.0Hz,2H),8.13(d,J＝7.0Hz,2H),7.87–7.81(m,1H),7.65–7.51(m,3H), 7.34–7.12(m,6H),7.14–7.09(m,3H),7.09–7.05(m,3H),6.86(d,J＝9.0Hz,2H), 4.43(s,3H),4.21–4.09(m,2H),1.31–1.24(m,3H).³¹P NMR(202MHz,CD₃OD) δ(TMS,ppm):45.1.HRMS(C₃₄H₃₀IN₂O₂P):m/z529.2036(M⁺,calcd 529.2039).

化合物α-TPA-PIO-Me-PF₆：¹H NMR(500MHz,CD₃OD),δ(TMS,ppm): 8.93(d,J＝6.5Hz,2H),8.08(d,J＝6.0Hz,2H),7.85–7.77(m,1H),7.60–7.45(m, 3H),7.31–7.24(m,4H),7.16(d,J＝8.5Hz,2H),7.12–6.98(m,6H),6.82(d,J＝ 8.5Hz,2H),4.40(s,3H),4.18–4.05(m,2H),1.29–1.18(m,3H).³¹P NMR(202 MHz,CD₃OD)δ(TMS,ppm):45.1,144.6(hept,J＝706.0Hz).¹⁹F NMR(471MHz, CD₃OD)δ75.6(d,J＝707.9Hz).HRMS(C₃₄H₃₀F₆N₂O₂P₂):m/z529.2099(M⁺, calcd 529.2039).

实施例3

将化合物α-TPA-PIO或化合物β-TPA-PIO溶于二甲基亚砜中得到浓度为1 mM的母液。取2uL母液加入含1uM活性氧指示剂2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐的磷酸缓冲盐溶液中配置成2mL检测液。随后使用荧光光谱仪检测480nm激发下的522nm处的荧光波长强度随光照时间(20mW cm^-2的白光)的变化以指示活性氧的生成速率。取1uL母液加入培养基中，混匀，即得1mL细胞染色工作液。以该工作液与海拉细胞共培养30min后，移去染色工作液，加入含1uM活性氧指示剂2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐的培养液与海拉细胞共培养30 min，随后于激光共聚焦显微镜下观察488nm激发下的520nm处的荧光波长强度随光照时间(强度3％的405nm激光)的变化以指示活性氧的生成速率。图1为化合物α-TPA-PIO和化合物β-TPA-PIO在磷酸缓冲盐溶液中和海拉细胞内的活性氧生成能力折线图，其中图1的A部分为在磷酸缓冲盐溶液中的活性氧生成情况，B部分为在海拉细胞内的活性氧生成情况。图1表明，化合物α-TPA-PIO和化合物β-TPA-PIO在溶液中和细胞中均具有明显的活性氧生成能力。

分别取1、2、5、10uL化合物α-TPA-PIO或化合物β-TPA-PIO的母液加入培养基中，混匀，即得1mL含不同浓度染色剂的细胞染色工作液。以该工作液与海拉细胞共培养30min后，施以0、5、10、20、30min的光照(20mW cm^-2的白光)，培养至24h后，加入噻唑蓝溶液检测细胞活力。图2为化合物α-TPA-PIO和化合物β-TPA-PIO对细胞进行的不同光照剂量和浓度剂量的光动力杀伤后的细胞存活率折线图，其中图2的A部分为化合物α-TPA-PIO对细胞光动力杀伤后的细胞存活率折线图，图2的B部分为化合物β-TPA-PIO对细胞光动力杀伤后的细胞存活率折线图。图2表明，化合物α-TPA-PIO和化合物β-TPA-PIO均对海拉细胞具有明显的光动力杀伤效果。因此，实施例1制得的氧化磷哚衍生物(化合物α-TPA-PIO和化合物β-TPA-PIO)具有抗癌作用，可用于制备抗癌药物。

实施例4

将化合物α-TPA-PIO-Me-I溶于二甲基亚砜中得到浓度为1mM的母液。取10uL母液加入培养基中，混匀，即得1mL细胞染色工作液。以该工作液分别与活细胞、死细胞共培养30min后，于激光共聚焦显微镜下观察488nm 激发下的荧光信号。图3表明，化合物α-TPA-PIO-Me-I具有死细胞荧光成像和特异性标记能力。

实施例5

将化合物α-TPA-PIO-Me-PF₆溶于二甲基亚砜中得到浓度为1mM的母液。取10uL母液加入培养基中，混匀，即得1mL细胞染色工作液。以该工作液与金黄色葡萄球菌共培养1h后，于激光共聚焦显微镜下观察488nm激发下的荧光信号。图4表明，化合物α-TPA-PIO-Me-PF₆具有微生物荧光成像能力。携带正电荷的化合物α-TPA-PIO-Me-PF₆具有潜在的抗微生物生长能力。

以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。