抗hpv16e7蛋白单抗69e2、杂交瘤细胞株及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 抗hpv16e7蛋白单抗69e2、杂交瘤细胞株及其制备方法和应用 (Monoclonal antibody 69E2 for resisting HPV16E7 protein, hybridoma cell strain, and preparation method and application thereof ) 是由 胡仁建 蔡家利 于 2020-03-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了抗HPV16E7蛋白单抗69E2、杂交瘤细胞株及其制备方法和应用,该杂交瘤细胞保存于中国典型培养物保藏中心,保藏号为：CCTCC NO：C2019181,该杂交瘤细胞能够分泌效价高的单克隆抗体,获得抗体能够与HPV16阳性的细胞株CaSki和HPV16阳性宫颈癌鳞癌石蜡组织切片反应,具有很好的特异性；可以作为ELISA试剂盒、免疫化学试剂盒、免疫荧光试剂盒、化学发光免疫分析检测试剂盒等的检测试剂。(The invention discloses an anti-HPV 16E7 protein monoclonal antibody 69E2, a hybridoma cell strain, a preparation method and an application thereof, wherein the hybridoma cell is preserved in China center for type culture collection with the preservation number of CCTCC NO: C2019181, can secrete monoclonal antibodies with high titer, can react with HPV16 positive cell strains CaSki and HPV16 positive cervical cancer squamous cell carcinoma paraffin tissue slices to obtain antibodies, has good specificity, and can be used as detection reagents of E L ISA kits, immunochemical kits, immunofluorescence kits, chemiluminescence immunoassay detection kits and the like.)
技术领域
本发明涉及免疫学领域，具体涉及分泌抗HPV16E7蛋白单抗69E2的杂交瘤细胞，还涉 及由该细胞分泌的单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
宫颈癌是全球妇女癌症中居第四位的癌症，每年新增530，000病例和死亡275，000例， 这些病例中大约85％来源于发展中国家。在中国，宫颈癌发病率居女性生殖道恶性肿瘤的首 位。宫颈的高危型人乳头瘤病毒(High risk human papillomavirus，HR-HPV)的持续性感染 是导致宫颈上皮内瘤变(CIN)和宫颈癌的直接病因，其中HPV16型最高，占53％。HPVE7 蛋白是HPV致癌的关键分子，E7致癌蛋白选择性表达在肿瘤细胞中，不在正常细胞中表达， 随着宫颈上皮内瘤CIN从低级别向高级别(从CIN1经历CIN2、CIN3到侵蚀性宫颈癌)进 展，E7致癌蛋白的表达向外层推进越明显且表达量越来越高，最终致癌蛋白E7蛋白出现在 宫颈脱落细胞中。HR-HPVDNA检测联合细胞学检查(如TCT)，可以增加宫颈上皮内瘤变CIN3的检出率并减少宫颈癌的发生，共同检测方法也可增加宫颈原位腺癌和浸润性宫颈腺癌 的检出率。对30～65岁女性进行细胞学和HPVDNA共同检测，不可避免会出现少部分细胞学检查结果阴性但HR-HPVDNA检测阳性者。美国最新的宫颈癌筛查指南提供了2种方案：(1)在12个月时重复细胞学和HR—HPVDNA共同检测。如果重复共同检测时HPV阳性或 细胞学检查结果为LSIL或更严重者，则应行阴道镜检查；(2)立即行HPV基因分型检测 (HPVl6或HPVl8)。新的筛查指南对HR—HPVDNA检测结果阳性者缺乏肯定、一致的处理 方案，而且阴道镜检查是有创伤的检查，也增加患者心理负担和经济负担，主要因为对于细 胞学阴性而HR-HPV的DNA检测阳性患者不能预测哪些患者最终发展为宫颈内瘤变CIN1、 CIN2、CIN3和宫颈浸润癌，如果针对那些细胞学检查结果阴性但HR-HPV的DNA检测阳性 的妇女，补充检测HR-HPV的E7致癌蛋白比如HPV16E7、HPV18E7致癌蛋白等，很可能在 宫颈上皮内瘤CIN2、CIN3时期甚至CIN1时期就发现有癌细胞的存在，最终达到早期预警、 早期诊断和早期治疗宫颈癌的目的。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗HPV16E7蛋白单抗69E2；本发明的目的之二 在于提供分泌抗HPV16E7蛋白单抗69E2的杂交瘤细胞；本发明的目的之三在于提供所述抗 HPV16E7蛋白单抗69E2的制备方法；本发明的目的之四在于提供所述抗HPV16E7蛋白单抗 69E2制备检测HPV16E7蛋白的试剂盒中的应用；本发明的目的之五在于提供含有所述抗HPV16E7蛋白单抗69E2的试剂盒。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、抗HPV16E7蛋白单抗69E2，所述单抗69E2包括重链和轻链，所述重链的可变区CDR1、 CDR2、CDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6的第50-54位、第69～85位、第118-127位所 示；所述轻链的可变区CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO.8的第46-55位、第 71-77位和第110-118位所示。
优选的，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
优选的，所述重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
优选的，所述单抗由杂交瘤细胞株HPV16E7-69E2分泌，保藏号为CCTCC NO：C2019181。
2、分泌抗HPV16E7蛋白单抗69E2的杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞保存于中国典型培养 物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2019181。
3、所述抗HPV16E7蛋白单抗69E2的制备方法，包括如下步骤：以HPV16E7蛋白为抗原免疫小鼠，用杂交瘤技术将SP2/0与免疫BALB/c小鼠的脾细胞或淋巴结细胞融合，筛选稳定性好、高效价的抗HPV16E7蛋白的杂交瘤细胞株，制备单抗腹水，经纯化获得抗HPV16E7蛋白单抗69E2。
4、所述抗HPV16E7蛋白单抗69E2制备检测HPV16的试剂盒中的应用。
优选的，试剂盒中单抗69E2作为检测抗体。
5、含有所述抗HPV16E7蛋白单抗69E2的试剂盒。
优选的，所述试剂盒为所述试剂盒为ELISA试剂盒、免疫化学试剂盒、免疫荧光试剂盒、 化学发光检测试剂盒、Western Blot检测试剂。
本发明的有益效果在于：本发明公开了分泌抗HPV16E7蛋白单抗69E2的杂交瘤细胞， 该杂交瘤细胞能够分泌抗HPV16E7蛋白单抗69E2，可以用于HPV16E7蛋白的定量检测，并 且具有特异性好、灵敏度高的优点，对宫颈癌早期诊断具有重要意义。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为Western Western Blot检测纯化HPV16E7蛋白与组氨酸标签抗体反应结果。
图2为纯化后的单抗69E2的10％SDS-PAGE电泳图(M：Marker；1和2道发现在分子量50kDa和25kDa处分别出现两条带)。
图3为单抗69E2的最高效价图。
图4为4对可以配对单抗的单抗。
图5为单抗69E2的亲和力测定图。
图6为单抗69E2与CaSki细胞和HeLa细胞的免疫细胞化学结果图(10×20)。
图7为单抗69E2与HPV16阳性的宫颈癌鳞癌、HPV18阳性的宫颈癌腺癌的免疫组织化 学结果图。
图8为单抗69E2与CaSki细胞和HeLa细胞的间接免疫荧光反应结果图(10×40)。
图9为单抗69E2与CaSki细胞和HeLa细胞的总蛋白的Western Blot反应结果图。
图10为抗原HPV16E7蛋白在ng级以等比等差稀释法稀释时的线性关系(A：当抗原HPV16E7蛋白在ng级以等比等差法(0、25、50、100、200、400、600、800、1000ng/孔) 稀释时，制备的参考曲线的直线拟合的判定系数R2＝0.9723，R2为判定系数，又称为决定系 数，又称拟合优度，是建立在回归分析基础上的用于研究一个随机变量对另一个随机变量的 解释程度，该值在0～1，越接近1说明自变量对因变量的解释程度越高；B：变异系数CV＝ 原始数据标准差/原始数据平均数，以抗原为0和变异系数CV低于10％的低浓度含量两点为 横坐标，对应的OD值为纵坐标，获得计算检测限的方程为Y＝0.01122*X+0.6896和判定系数 R2值＝0.9889；C：信噪比S/N＝待测样品OD值/阴性对照OD值，S为待测样品Sample，N 为阴性对照Negative，以信噪比S/N＝3的高标准确定定量下限的OD450nm＝3*0.6896＝2.0688， 定量下限＝(2.0688-0.6896)/0.01122＝122.9234ng。
图11为检测宫颈癌标本的参考曲线和标本中HPV16E7蛋白含量图(A、B、C依次为检测宫颈癌标本的参考曲线的直线拟合、双对数拟合和信噪比；D为计算检测限的参考曲线和方程；E为4例宫颈正常组织、12例HPV16阳性的宫颈癌组织及其4例HPV52阳性的宫颈 癌组织共3组组织的HPV16E7含量图)。
图12为单抗69E2的表位鉴定结果图(A：重叠肽的间接ELISA法结果；B：间接竞争ELISA法结果；C：单抗69E2的特异性表位在HPV16E7蛋白的三维晶体结构建模图上的定位)。
图13为单抗69E2的特异性表位的保守性分析比对图。
保藏说明
将分泌抗体79A11、69A6、69E2的杂交瘤细胞株送中国典型培养物保藏中心，保藏地址 为中国武汉武汉大学，分别命名为HPV16E7-79A11、HPV16E7-69A6、HPV16E7-69E2；HPV16E7-79A11保藏日为2017年4月10日，保藏号为CCTCC NO：C201718，分类命名为 单克隆杂交瘤细胞株HPV16E7-79A11；HPV16E7-69A6保藏日为2017年4月10日，保藏号为 CCTCCNO：C201720，分类命名为单克隆杂交瘤细胞株HPV16E7-69A6；HPV16E7-69E2保 藏日为2019年8月21日，保藏号为CCTCC NO：C2019181，分类命名为小鼠杂交瘤细胞株 HPV16E7-69E2。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的 理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明用基因工程技术克隆和表达HPV16E7基因，以纯化的HPV16E7蛋白为抗原免疫 BALB/c小鼠，用杂交瘤技术融合SP2/0与免疫BALB/c小鼠的脾细胞和淋巴结细胞，筛选获 得稳定性好、高效价的抗HPV16E7蛋白单克隆杂交瘤细胞株，制备了单抗腹水，用盐析、亲 和层析结合凝胶层析等综合方法纯化得到了3纯度较高、效价较高的单抗，命名为79A11、 69A6、69E2。
实施例1、制备HPV16E7蛋白
根据HPV16E7全长基因设计带有6个组氨酸标签的特异性引物，引物F和R的序列(下 划线为核酸内切酶)如下：
F:5'-gcccatggaccatcaccatcaccatatgcatggagatacacctac-3’(SEQ ID NO.1)；
R:5'-gcaagcttttatggtttctgygaacagatggggcacac-3’(SEQ ID NO.2)。
以CaSki细胞基因组总DNA为模板，PCR扩增HPV16E7全长基因，PCR反应条件如下：94℃预变性5min，94℃30s，55℃～70℃30s和72℃60s35个循环，72℃延伸7min。Nco Ⅰ和HindⅢ限制性酶酶切PCR产物HV16E7基因片段和质粒pET-28a(+)，将鉴定正确的重组质 粒pET-28a(+)-HPV16E7转化感受态细胞Rosetta(DE3)pLysS，将工程菌 pET-28a(+)-HPV16E7-Rosetta(DE3)pLysS在LB培养基中1mM IPTG在37℃诱导4h，破菌液离 心，12％SDS-PAGE电泳确定HPV16E7蛋白的表达量和表达形式，用镍柱亲和层析结合阴离子 交换层析纯化HPV16E7蛋白，获得纯度大于95％的HPV16E7蛋白。Western Blot分析如图1所 示，组氨酸标签抗体可以与表达的HPV16E7蛋白反应，说明表达的HPV16E7蛋白带有组氨酸 标签。12％SDS-PAGE电泳结果显示表达的HPV16E7蛋白的表达量较高，且呈可溶性表达，分 子量大约在18kDa，HPV16E7蛋白的预测的理论分子量大约为11988.32Da，接近12kDa，PI＝4.59(图2)。但目前表达的HPV16E7蛋白的分子量在18kDa，大于HPV16E7蛋白的理论分子量12kDa，HPV16E7蛋白出现电泳异常行为现象，原因正如文献(Armstrong DJ and Roman A.Biochem Biophys Res Commun，1993)报道的野生型的HPV16E7蛋白因为带有大量的负电荷， 所以HPV16E7蛋白在电泳时会在14～21kDa迁移，本研究表达的HPV16E7蛋白表达的分子量 大约在18kDa，正好与文献报道的HPV16E7蛋白在14～21kDa迁移相符合。
其中PCR扩增产物序列如(SEQ ID NO.3)所示：
编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示：
MDHHHHHMHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQFNDSSE
EEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCP ICSQKP
实施例2、抗HPV16E7蛋白单克隆抗体的制备
用杂交瘤技术以HPV16E7蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，将免疫小鼠的后腿腹股沟淋巴 结B淋巴细胞和脾脏细胞分别与骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14融合，培养筛选、多次克隆化获得抗 HPV16E7蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，结果如表1和表2所示。
表1展示了脾脏来源的效价高的阳性多克隆杂交瘤细胞株，经过多次克隆化后筛选的单克 隆抗体的杂交瘤细胞株的名称、细胞上清液的抗体的OD450nm值和抗体亚型，其中效价高和亚 型非常明确的单抗有79A11(IgM)、38E11(IgM)、74F3(IgG2a为主)和72E6(亚型不明确)。从 中可以看出脾脏来源的单抗抗体的亚型主要是IgM。
表1、来源于脾细胞的阳性多克隆和单克隆杂交瘤细胞株
表2展示了腹股沟淋巴结来源的效价高的阳性多克隆杂交瘤细胞株，经过多次克隆化后筛 选的单克隆抗体的杂交瘤细胞株的名称、细胞上清液的抗体的OD450nm值和抗体亚型，其中的 单抗69E2、、69D10、69B11、54D5、54F4和54G5的抗体亚型都为IgG2a，但是淋巴结来源的 单克隆抗体69A6的亚型却是IgM。
表2、来源于淋巴结细胞的阳性多克隆和单克隆杂交瘤细胞株
单抗亚型鉴定及制备单抗腹水，分别按IgM和IgG的纯化方案纯化单抗。
单克隆抗体的亚型鉴定：用单抗亚型鉴定试剂盒鉴定阳性单克隆抗体细胞上清液的亚型 有两种：IgG2a和IgM。IgG2a亚型的阳性单克隆杂交瘤细胞株主要来源于淋巴结，包括69B11、 69D10、69E2、54D5、54F4、54G5等,而；而淋巴结来源的单抗69A6的亚型是IgM；IgM亚型 的阳性单克隆杂交瘤细胞株主要来源于脾脏，主要有79A11、56E4、38E11等，而脾脏来源的 单抗74F3的亚型不明确，以IgG2a为主，脾脏来源的单抗72E6的亚型也不明确(表3)。
表3、单抗亚型鉴定的OD450nm值及其亚型结果
单抗腹水制备、收集和保存：
动物体内诱生法制备单抗腹水，结果显示实际注射BALB/c小鼠的杂交瘤细胞数量是： 1.5*106-2.7*106/只，大部分的小鼠产生腹水的体积在3-5mL/只之间，小部分可以达到8-10mL/ 只，注射到2.0*106/只产生的腹水多于1.5*106/只。用9号针头在消毒腹部后进入腹腔抽取腹水， 腹水收集后4℃离心，细胞可以加细胞冻存液冻存，这种细胞以后复苏后会生长得更好，上清 液为腹水单抗，在56℃水浴锅里灭活45min后加入同体积的甘油放在-80℃保存。
以2μg/mL包被抗原HPV16E7蛋白，间接ELISA法一共检测了25株单抗腹水，抗体稀释度 从1:5000开始倍比稀释到1:5120000，信噪比S/N值≥2.1为阳性判断阳性来最高效价，信噪比 S/N＝待测样品的OD值/阴性对照的OD值，25株中的单抗腹水最高效价在1:128000以上的单抗 腹水有11株：79A11、69E2、69A6、69A11、69B11、38E11、54D5、54F4、54G5、56E4和56E5 (见表4)。
表4、效价≥1:128000的11株单抗腹水的最高效价
间接ELISA测定纯化后的单抗的效价：
间接ELISA法测定纯化后的8株纯度较高的单抗，以信噪比S/N≥2.1判断为阳性，单抗 79A11、69A6、69E2、54G5、54D5、54F4、74F3和72E6的最高效价依次为6.25ng、0.78ng、0.19ng、1.56ng、0.39ng、1.56ng、6.25ng和6.25ng(表5)。
表5、纯化后的8株单抗的效价
用二步法-辛酸-硫酸铵沉淀和Protein G纯化的IgG2a亚型的单抗的纯度高达95％以上， 而且效价高，其中一株单抗69E2的效价最高(0.19ng)；用四步法-硫酸铵沉淀加凝胶过滤层 析加IgM柱加凝胶过滤层析纯化的IgM亚型单抗的纯度高达95％以上，单抗79A11效价较 高，大约6.25ng。单抗的高纯度和高活性对于后续的单抗的表征分析和检测方法的建立很重 要。
将3株稳定分泌单克隆抗体的的杂交瘤细胞株79A11、69A6和69E2送中国典型培养物 保藏中心保藏，保藏地址为中国武汉武汉大学，分别命名为HPV16E7-79A11、HPV16E7-69A6、 HPV16E7-69E2；HPV16E7-79A11保藏日为2017年4月10日，保藏号为CCTCC NO：C201718， 分类命名为单克隆杂交瘤细胞株HPV16E7-79A11；HPV16E7-69A6保藏日为2017年4月10 日，保藏号为CCTCC NO：C201720，分类命名为单克隆杂交瘤细胞株HPV16E7-69A6；HPV16E7-69E2保藏日为2019年8月21日，保藏号为CCTCC NO：C2019181，分类命名为 小鼠杂交瘤细胞株HPV16E7-69E2。
实施例3、单抗69E2的鉴定
用二步法-辛酸-硫酸铵沉淀和Protein G纯化的IgG2a亚型的单抗69E2。10％SDS-PAGE 电泳中1和2道是单抗69E2用Protein G纯化后的洗脱峰，可以在1和2道发现在分子量50kDa 和25kDa处分别出现两条带，正好与IgG亚型抗体的重链和轻链的分子量一致，没有发现其 他杂带(见图2)。说明用二步法-辛酸-硫酸铵沉淀和Protein G纯化单抗69E2的纯度较高， 大于95％，可以用于单抗69E2的鉴定和检测。
南京金斯瑞生物技术有限公司用杂交瘤细胞株69E2来测定单抗69E2的核苷酸序列，用 单抗69E2的核苷酸序列预测单抗69E2的氨基酸序列，结果如下：
单抗69E2的重链核酸序列如SEQ ID NO.5(1407bp)所示，结构为Leadersequence-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-Constant region-Stop codon，黑体表示CDR 序列：
编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.6(468aa)所示，结构为Leader sequence-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-Constant region-Stop codon，黑体为CDR序 列：
轻链核苷酸序列如SEQ ID NO.7(708bp)所示，Leader sequence-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-Constant region-Stop codon，黑体为CDR序 列：
轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.8(235aa)所示，结构为 Leader sequence-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-Constant region-Stop codon，黑体为 CDR序列：
实施例4、单抗69E2的检测
1、间接ELISA法检测单抗69E2的效价
(1)包被抗原：抗原HPV16E7蛋白的包被浓度为1μg/mL，100μL/孔，其林贝儿的MH-1微 孔板振荡器室温震荡酶标板10min后盖上塑料板，放于37℃静置反应1h，转入4℃静置反应过 夜12～14h，次日用PBST洗板3次，每次3-5min；
(2)封闭：0.25％BSA溶解于PBST中作为封闭液，300μL/孔，MH-1微孔板振荡器室温震 荡酶标板10min，放于37℃静置反应2h，用PBST洗板3次，每次3-5min；
(3)加一抗：将79A11和69E2用封闭液稀释，第一孔的浓度为1μg/mL，倍比稀释到第8孔 的浓度为7.8ng/mL，100μL/孔，同时设置4个对照：阳性血清对照、阴性血清对照，只加二抗 羊抗鼠IgG-HRP的对照和空白对照。MH-1微孔板振荡器室温震荡酶标板10min，放于37℃静 置反应1h，用PBST洗板3次，每次3-5min；
(4)加二抗：用封闭液0.25％BSA以1:10000稀释羊抗鼠IgG-HRP，100μL/孔，MH-1微孔板 振荡器室温震荡酶标板10min，放于37℃静置反应1h，用PBST洗板3次，每次3-5min；
(5)加底物TMB显色：将TMB双组份显色液试剂盒中的A液和B液以1:1混合，100μL/孔， MH-1微孔板振荡器室温震荡酶标板10min，放于37℃静置反应20分钟；
(6)加终止液：2MH2SO4终止反应，50μL/孔,室温震荡酶标板2min；
(7)用全波长酶标仪测定OD450nm值及数据处理。
以标本/阴性对照的比值来判定间接ELISA的结果，以信噪比S/N大于2.1判定为阳性，S 为样本Sample，N为阴性对照Negative。包被抗原HPV16E7全蛋白2μg/ml，单抗69E2从4μg/ml 倍比稀释至0.1953μg/ml，100μl/well，12个浓度的单抗69E2分别与抗原HPV16E7全蛋白反 应，单抗69E2在0.19ng时的S/N值＝8.9257，远远大于2.1的阳性结果所以单抗69E2的最 高效价至少为0.19ng，见表6和图3。
表6间接ELISA法测定单抗69E2的最高效价结果
2、直接ELISA检测偶联物HRP-69E2的抗体效价
将放置后的检测抗体69E2(IgG2a)用凝胶层析柱分离未降解的抗体IgG2a及其已经降解 的小分子片段，将未降解的检测抗体69E2约1mg用于标记HRP，用货号为LK51试剂盒Proxidase Labeling Kit-NH2(for 1mg)中的HRP标记检测抗体69E2约1mg。以信噪比S/N值≥2.1判断为阳 性来判定偶联物HRP-69E2的抗体效价至少在0.78ng(表7)，说明检测抗体69E2被标记HRP 后的效果不错，可以用于定量方法的建立。
表7、直接ELISA检测偶联物HRP-69E2的信噪比S/N值和抗体效价
3、单抗69E2与其他单抗配对的方法和结果
单抗69E2不标记辣根过氧化物酶HRP作为捕获抗体，与其他7株标记了HRP的抗HPV16E7蛋白的单抗(79A11-HRP、69A6-HRP、54D5-HRP、54G5-HRP、54F4-HRP、74F3-HRP、72E6-HRP)作为检测抗体配对，进行双抗夹心ELISA实验；单抗69E2标记辣根过氧化物酶HRP作为检测抗体，与其他7株没有标记了HRP的抗HPV16E7蛋白的单抗(79A11、69A6、 54D5、54G5、54F4、74F3、72E6)作为捕获抗体配对，进行双抗夹心ELISA实验。
结果：56对配对单抗中，有4对单抗可以配对：79A11与69E2-HRP、79A11与74F3-HRP、 79A11与69A6-HRP、79A11与54D5-HRP(见图4)。对于单抗69E2来说，只有当单抗79A11为捕获抗体时，单抗69E2-HRP为检测抗体配对检测抗原HPV16E7蛋白时，有比较强的阳性信号；单抗69E2为捕获抗体时与其他7株单抗配对没有阳性信号。说明单抗69E2在双抗夹心ELISA中不适合做捕获抗体，适合作为检测抗体。
4、单抗69E2的亲和力测定
将纯度大于95％的单抗69E2及其抗原HPV16E7全蛋白送南京金斯瑞生物科技有限公司 测定单抗69E2与抗原HPV16E7全蛋白的亲和力，结果如表8和图5。结果显示，抗原HPV16E7 与单抗69E2的亲和力为5.60E-09M，表明单抗69E2的亲和力很高。
表8、单抗69E2的亲和力测定结果
5、单抗69E2在免疫细胞化学和免疫组织化学中的初步应用
A、单抗69E2在免疫细胞化学中的初步应用
方法：制备宫颈癌细胞株CaSki和HeLa的细胞爬片，把单抗69E2配制成不同的浓度分 别与CaSki和HeLa的细胞反应，加DAB显色，结果如图6所示。免疫细胞化学结果显示， 当单抗69E2的含量依次为1μg/孔，0.5μg/孔，0.25μg/孔，0.125μg/孔，0.0625μg/孔，0.03125μg/ 孔，0.015625μg/孔，0.0078125μg/孔时，分别与CaSki细胞(HPV16阳性)进行反应，单抗69E2的含量从7.8125ng/孔到1μg/孔时，CaSki细胞中出现逐渐增强的棕黄色颗粒，即反应灵 敏度至少为7.8125ng/孔，验证了单抗69E2的有效性；而与HeLa细胞(HPV18阳性)反应时，单抗69E2的含量从7.8125ng/孔到1μg/孔时，HeLa细胞中都没有出现棕黄色颗粒，验证了单抗69E2的特异性，提示单抗69E2在免疫细胞化学中检测天然的HPV16E7蛋白具有潜 在的应用价值。
B、单抗69E2在免疫组织化学中的应用
将单抗69E2分别与HPV16阳性的宫颈癌鳞癌石蜡切片和HPV18阳性的宫颈癌腺癌石蜡切 片进行免疫组织化学反应，以初步验证这3株抗HPV16E7蛋白单抗检测宫颈癌组织中的 HPV16E7蛋白的有效性和特异性，用于初步分析单抗69E2在免疫组织化学反应中的应用价 值。具体步骤如下：
(1)烤片：取重庆市九院病理科提供的宫颈癌鳞癌(病理号7532)和宫颈癌腺癌石蜡组 织作(病理号2255)，60℃烤片2h；
(2)脱蜡和水化：依次用二甲苯Ⅰ15min、二甲苯Ⅱ15min、1/2二甲苯(二甲苯：无水乙醇＝1:1)10min、无水乙醇10min、95％乙醇5min、85％乙醇5min、75％乙醇5min、水5min进行脱蜡和水化，PBS洗3次，每次5min；
(3)细胞通透：用含0.5％Triton X-100的0.01MPBS，pH7.2室温作用20min，PBS洗3次， 每次5min；
(4)抗原修复：用工作浓度的柠檬酸钠修复液在85℃水浴锅内修复45min，自然冷却， PBS洗3次，每次5min；
(5)灭活内源性过氧化物酶和生物素：每片加3％H2O2在室温下反应20min，以消除内源 性过氧化物酶和生物素,PBS洗细胞3次，每次5min；
(6)封闭：用含5％BSA或5％山羊血清的0.01MPBS，pH7.2室温作用60min，不用PBS洗 细胞，直接加一抗；
(7)加一抗：在每一张切片组织的周围用蜡笔画一个圈，3株单抗79A11、69E2和69A6 的浓度依次为8.95μg/ml、50μg/ml和50μg/ml等，200μl/片，设置一个不加一抗只加二抗的阴性 对照，加PBS即空白对照，4℃过夜，PBS洗片3次，每次5min；
(8)加试剂1(聚合物辅助剂或反应增强剂)：每张切片加入中衫金桥的货号为PV-9002 的小鼠超敏二步法检测试剂盒中试剂1(聚合物辅助剂)，200μl/片，室温作用20min，PBS洗 片3次，每次5min；
(9)加试剂2(辣根酶标记抗小鼠IgG多聚体)：加200μl/片的试剂2,PBS洗片3次，每次5min；
(10)DAB显色：用中衫金桥的货号为ZLI-9018的DAB显色试剂盒(20*)的工作浓度显 色，在显微镜下进行；
(11)复染：用中衫金桥的货号为ZLI-9615的苏木素染液复染2-6min；
(12)水冲洗10-15min、重复脱水(与脱蜡的顺序相反)、透明、中性树胶封片和在显微 镜下拍照。
结果如图7所示。免疫组织化学结果显示，单抗69E2与HPV16阳性的宫颈癌鳞癌反应可 以出现典型的棕黄色颗粒，与HPV18阳性的宫颈癌腺癌反应不出现棕黄色的颗粒。说明单抗 69E2可以检测到HPV16阳性的宫颈癌鳞癌中的HPV16E7蛋白，而不能检测到HPV18阳性 的宫颈癌鳞癌中的HPV18E7蛋白，提示单抗69E2在HPV16阳性的宫颈癌的免疫组织化学的检测中具有潜在应用价值。
C.单抗69E2在间接免疫荧光法中的初步应用
通过在自制的湿盒中，将一抗即单抗69E2与CaSki细胞和HeLa细胞爬片上细胞中相应 抗原结合，形成抗原抗体复合物，然后以荧光素标记的第二抗体与一抗结合，经反应后在荧 光显微镜下观察反应的结果，以此初步建立基于HPV16E7-69E2免疫荧光试剂盒。利用免疫 荧光技术定位HPV16E7蛋白在HPV16阳性的CaSki细胞中的表达情况，将稀释程度为1μg/ 孔，0.5μg/孔，0.25μg/孔，0.125μg/孔，0.0625μg/孔，0.03125μg/孔，0.015625μg/孔，0.0078125μg/ 孔的一抗与CaSki细胞进行反应，当一抗69E2的稀释程度达到最大，即7.8125ng/孔时，CaSki 细胞的细胞核绿色荧光仍然较明显，即反应灵敏度至少为7.8125ng/孔；而在相同浓度的一抗 69E2和二抗时，与HPV18阳性的HeLa细胞反应没有出现绿色荧光信号(见图8)。
D、单抗69E2与CaSki和HeLa细胞的总蛋白的Western Blot反应
培养和收集CaSki和HeLa细胞，用RIPA裂解液提取CaSki和HeLa细胞中的总蛋白，CaSki细胞总蛋白中含有HPV16E7蛋白，HeLa细胞中的总蛋白中含有HPV18E7蛋白，所以 先用12％SDS-PAGE电泳分离CaSki和HeLa细胞中的总蛋白以及一个带有组氨酸标签的其 他蛋白c-myc(his-tag-c-myc，分子量62kDa)，再将胶转印到NC膜上，然后再用5％脱脂乳封闭NC膜，再将一抗69E2与NC膜上的蛋白反应，加二抗羊抗鼠IgG-HRP，曝光后拍照，结 果如图9所示。
Western Blot反应的结果显示：显示单抗69E2与一个带有组氨酸标签的其他蛋白c-myc (his-tag-c-myc)反应后没有曝光的条带出现，提示单抗69E2与组氨酸标签不发生反应；单 抗69E2与CaSki细胞总蛋白反应出现强的曝光条带，而与HeLa细胞中的总蛋白反应没有出 现强的曝光条带。因为CaSki细胞总蛋白中含有HPV16E7蛋白，HeLa细胞中的总蛋白中含 有HPV18E7蛋白，所以单抗69E2可以检测到CaSki细胞总蛋白中的HPV16E7蛋白，单抗 69E2不能检测到HeLa细胞总蛋白中的HPV18E7蛋白。提示69E2在检测HPV16E7蛋白的Western Blot中有潜在应用价值。
E.基于单抗79A11和69E2-HRP+TMB检测系统建立的定量检测HPV16E7蛋白的常规双抗 夹心ELISA法
该检测系统的优化条件为：捕获抗体79A11的最佳包被浓度为2μg/ml，检测抗体HRP-69E2 的最佳工作浓度为1μg/ml，5％脱脂乳封闭2h的本底低和信号强。双抗夹心ELISA显示当抗原 HPV16E7蛋白在ng级以等比等差法(0、25、50、100、200、400、600、800、1000ng/孔)稀 释时，制备的直线拟合的参考曲线的判定系数R2＝0.9723(图10、A)，R2为判定系数，又称为 决定系数，又称拟合优度，是建立在回归分析基础上的用于研究一个随机变量对另一个随机 变量的解释程度，该值在0～1,越接近1说明自变量对因变量的解释程度越高。变异系数CV＝原 始数据标准差/原始数据平均数，以抗原为0和变异系数CV低于10％的低浓度25ng含量两点为 横坐标，对应的OD值为纵坐标，获得计算检测限的方程为Y＝0.01122*X+0.6896和R2值＝0.9889 (图10、B)。S为待测样品Sample，N为阴性对照Negative，信噪比S/N＝待测样品OD值/阴性 对照OD值,以信噪比S/N＝3的高标准作为定量下限的OD450nm＝3*0.6896＝2.0688，定量下限＝ (2.0688-0.6896)/0.01122＝122.9234ng(图10、C)，灵敏度不理想，需要探索更加灵敏的方 法。
F.基于单抗79A11和69E2-Biotin+HRP-Streptavidin检测系统建立的定量检测HPV16E7蛋 白的化学发光免疫分析方法的初步分析
化学发光免疫分析方法的优化条件如下：捕获抗体79A11的包被浓度为2ug/mL，0.25％BSA％封闭液封闭2h，抗原HPV16E7蛋白在ng级以等比等差法稀释与捕获抗体在37℃反 应2h，检测抗体Biotin-69E2和HRP-Streptavidin的工作浓度都为1ug/mL，鲁米诺反应10min等。 以抗原HPV16E7蛋白的9个浓度0、25、50、100、200、400、600、800、1000ng/孔的含量为 横坐标，对应的OD425nm值为纵坐标，获得参考曲线。结果如图11所示，其直线拟合的回归方 程为Y＝53.35*X+10294，直线拟合和双对数拟合的R2依次为0.9666和0.956；以抗原HPV16E7 蛋白的0和低浓度25ng的含量为横坐标，对应的OD425nm值为纵坐标，获得计算检测下限的回 归方程Y＝363.1*X+3441，判定系数R2＝0.9823，信噪比S/N＝3的OD425nm＝3*3441＝10324，检测 限＝(10324-3441)/363.1＝18.9562ng，变异系数CV在1.5184％～11.9649％，小于20％，说明这 个检测下限也是定量下限，与常规双抗夹心ELISA法定量检测HPV16E7癌蛋白的定量下限 122.9234ng相比，灵敏度提高6.48倍。将标本的OD425nm值带入方程Y＝53.35*X+10294得到4个 正常宫颈组织和4例HPV52阳性中的宫颈癌组织的HPV16E7蛋白都小于定量下限18.9562ng； 12例HPV16阳性的宫颈癌HPV16E7蛋白含量波动在102.1743～438.2473ng，其信噪比S/N值都 大于3.0，为阳性，与正常组织和HPV52阳性宫颈癌组织相比有显著差异(P＜0.01)，说明 本课题建立的化学发光免疫分析法在检测HPV16阳性的宫颈癌组织中的HPV16E7蛋白初步有 效。
实施例6、单抗69E2的表位鉴定
1、HPV16E7步移重叠18肽的合成
(1)查找HPV16E7氨基酸序列：在NCBI网站中查到CaSki細胞株里面的的HPV16 E7蛋白序列(Seguence ID：NC-001526.2)。HPV16 E7蛋白全长98个氨基酸，具体氨基酸序列如下：
MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKC
DSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP
(2)短肽合成：从1号氨基酸开始一次步移6个氨基酸，设计含18个氨基酸的重叠肽，委托上海强耀公司合成，共15条，纯度大于95％，用DMSO溶解合成的重叠肽至1mg/ml 的储存浓度，分装后于-80℃保存。
2、重叠肽的间接ELISA法筛选抗HPV16E7单抗的优势线性B细胞表位
(1)包被抗原：将BSA设置为阴性对照蛋白，将15个肽以1:1的比例混合在一起的pool 设置为阳性对照蛋白。15个重叠肽、阴性对照蛋白和阳性对照蛋白的包被含量均为5μg/孔， 100μl/孔，4℃过夜，第二日用PBST洗板4次，每次3min；
(2)封闭：用PBST配制1.5％BSA，250μl/孔，37℃2h，用PBST洗板3次，每次3分 钟；
(3)加一抗：单抗69E2的浓度为1.84mg/ml，稀释1:8000；100μl/孔，37℃1h，用PBST洗板4次，每次3min；
(4)加二抗：将CST公司的货号7076S的Anti-mouse IgG,HRP-linked Antibody以1:3000 稀释，100μl/孔，37℃45分钟，用PBST洗板4次，每次3min；
(5)加TMB显色液：将北京索莱宝PR1210的TMB双组份的显色试剂盒中的A液和B 液以1:1稀释，100μl/孔，37℃5-8min；
(6)终止反应：加2MH2SO4，50μl/孔；
(7)测定OD450nm及数据分析。
结果如图12中A所示。结果显示，重叠肽的间接ELISA法显示单抗69E2与重叠肽HPV16E749-66的反应信号最强(P<0.01)，与重叠肽HPV16E749-66的前后重叠肽HPV16E743-60和HPV16E755-72、HPV16E761-78都有反应，符合重叠肽反应的规律。
3、重叠肽的间接竞争ELISA法筛选抗HPV16E7单抗69E2的优势线性B细胞表位
因为用重叠肽的间接ELISA法筛选到的线性表位的优势是可以筛选到疏水性氨基酸强的 重叠肽，但劣势是漏掉亲水性氨基酸强的重叠肽。因为间接ELISA依赖的是重叠肽的固定化 效率、位阻和单抗的亲和力，而间接竞争ELISA只依赖亲和力和位阻，间接竞争ELISA的 灵敏度会下降，但可靠性会增加，所以结合间接竞争ELISA共同筛选优势线性B细胞表位。 在用间接竞争ELISA实验前，需要做棋盘实验确定抗原HPV16E7全蛋白的最佳包被浓度和 单抗的最佳反应浓度，以OD450nm值在0.7-0.8来确定。
A、间接ELISA的棋盘实验
(1)包被抗原：HPV16E7全蛋白：将HPV16E7全蛋白配置成4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml，每个浓度包被12孔，100μl/孔，4℃过夜，第二日用PBST洗板4次，每次3分钟；
(2)封闭：用PBST配制1.5％BSA，250μl/孔，37℃2h，用PBST洗板3次，每次3分钟；
(3)加一抗：将单抗69E2分别配制第一个梯度为4μg/ml，依次倍比稀释8个梯度，分别 加入含4个浓度的抗原孔，100μl/孔，第9、10、11、12列依次为HPV16E7的阳性血清、阴 性血清、二抗对照和空白对照，100μl/孔，37℃1h，用PBST洗板4次，每次3min；
(4)加二抗：将CST公司的货号7076S的Anti-mouse IgG-HRP以1:3000稀释，100μl/孔， 37℃45min，用PBST洗板4次，每次3min；
(5)加TMB显色液：将北京索莱宝PR1210的TMB双组份的显色试剂盒中的A液和B 液以1:1稀释，100μl/孔，37℃5-8min；
(6)终止反应：加2MH2SO4，50μl/孔；
(7)测定OD450nm及数据分析。
B、重叠肽在1μmol/L时的间接竞争ELISA法初步筛选单抗69E2的优势线性B细胞表位
(1)包被抗原HPV16E7全蛋白：选择棋盘实验中OD450nm在0.7-0.8的抗原和抗体比例包 被HPV16E7全蛋白。对于单抗69E2的抗原HPV16E7蛋白的包被浓度为0.25μg/ml，对应的单抗69E2与重叠肽反应的浓度为0.125μg/ml，100μl/孔，4℃过夜第二日用PBST洗板4次，每次3分钟；
(2)封闭：用PBST配制1.0％BSA，250μl/孔，37℃2h，用PBST洗板3次，每次3分钟；
(3)加一抗和重叠肽反应的混合物：将单抗69E2分别配制2μg/ml，把15个重叠肽配成 2μmol/L，同时将BSA配成2mg/ml，将单抗分别与重叠肽、BSA、PBST以1:1比例混合，25℃震荡反应30分钟后加入板中，100μl/孔，37℃1h，用PBST洗板4次，每次3分钟；
(4)加二抗：将CST公司的货号7076S的Anti-mouse IgG-HRP以1:3000稀释，100μl/孔， 37℃45分钟，用PBST洗板4次，每次3分钟；
(5)加TMB显色液：将北京索莱宝PR1210的TMB双组份的显色试剂盒中的A液和B 液以1:1稀释，100μl/孔，37℃5-8分钟；
(6)终止反应：加2MH2SO4，50μl/孔；
(7)测定OD450nm及数据分析。
C、重叠肽在10μmol/L的间接竞争ELISA法初步筛选单抗69E2的优势线性B细胞表位
因为重叠肽在1μmol/L时，单抗69E2抑制重叠肽时的OD450nm没有到达二抗对照的OD450nm，所以需要提高重叠肽的浓度到10μmol/L。在方法上与重叠肽在1μmol/L的间接竞争ELISA法的一个不同点是加一抗和重叠肽反应的混合物：将单抗69E2配制0.25μg/ml，选择重叠肽在1μmol/L时被单抗抑制的几个重叠肽段和1-2个没有被单抗抑制的重叠肽段为阴性 对照，BSA为阳性对照。把几个重叠肽配成20μmol/L，同时将BSA配成20mg/ml，将单抗 分别与重叠肽、BSA、PBST以1:1比例混合，25℃震荡反应30min后加入板中，其余步骤与 重叠肽在1μmol/L的相同。
间接竞争ELISA筛选含亲水性强的氨基酸肽段，结果如图12中B所示。用抑制率法判 定间接竞争ELISA法的结果。抑制率＝(阴性对照BSA的OD450nm值-被抑制肽的OD450nm值)*100％/阴性对照BSA的OD450nm值，抑制率≥50％为阳性，抑制率小于50％为阴性。结果显示，重叠肽在10μmol/L时的间接竞争ELISA法显示单抗69E2可以抑制显著抑制肽段HPV16E767-84、HPV16E773-90和HPV16E785-98、HPV16E749-66，有显著差异(P<0.01)。
综合间接ELISA和间接竞争ELISA结果，可以发现单抗69E2与4个重叠肽段HPV16E767-84、HPV16E773-90和HPV16E785-98、HPV16E749-66都有特异结合，但是具体的表位 是由哪些氨基酸组成不是很清楚。目前虽然没有检索到HPV16E7蛋白的三维晶体结构， HPV16E7蛋白的氨基酸序列与HPV45E7蛋白的氨基酸序列序列的同源性46％，HPV45E7蛋 白有三维晶体结构，利用SWISS-MODEL同源建模，获得以HPV45蛋白为模型的HPV16E7 第46-97位氨基酸的三维晶体结构建模图。用PyMOL(The PyMOL Molecular Graphics System 2.2.0)呈现HPV16E7蛋白的三维晶体结构建模图，目前只解析了HPV16E7蛋白的第46-97aa 的结构，HPV16E7蛋白的两个单体是通过锌结合结构域连成二聚体，呈二重旋转对称轴，二 级结构主要为α螺旋。用圆二色谱测定HPV16E7蛋白的二级结构的确为α螺旋。
从HPV16E7蛋白的三维晶体结构建模图中发现2个肽段HPV16E767-72和HPV16E786-90在内部，3个肽段HPV16E749-66、HPV16E773-85和HPV16E791-97外露、不连续和位置邻近， 外露的肽段才是表位所在部位，这3个外露肽段不连续，说明单抗69E2的表位是构象性表位， 单抗69E2的效价高，亲和力强，说明单抗69E2的表位也是刚性的表位。
将间接ELISA中单抗有反应的肽和间接竞争ELISA显示有显著抑制的肽标示在HPV16E7蛋白的三维晶体结构建模图中，标示为红色的肽段是单抗69E2有特异性结合的肽段部分；单抗69E2与单抗79A11可以配对，所以同时用蓝色标示配对单抗79A11的特异性 外露表位(图12中C)。单抗69E2与单抗79A11配对的结果说明单抗69E2与单抗79A11分 别与同一个HPV16E7蛋白的两个不同的单体的表位反应，这样才能配对而不发生冲突。
4、单抗69E2的特异性表位的保守性分析
单抗69E2的特异性表位是3个外露的肽段：HPV16E749-66、HPV16E773-85和HPV16E791-97。 用软件MEGA7.0比对这3个外露的肽段的氨基酸序列与从NCBI中下载另外的30株HPV16 毒株中的HPV16E7蛋白的氨基酸序列。保守性比对结果发现这3个外露的肽段(HPV16E749-66、 HPV16E773-85和HPV16E791-97)与NCBI中下载的另外30株HPV16毒株中的HPV16E7蛋白 的氨基酸的同源性很高，说明保守性高，提示这株单抗69E2具有潜在的广谱性应用价值(图 13)。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限 于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范 围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 重庆理工大学
<120> 抗HPV16E7蛋白单抗69E2、杂交瘤细胞株及其制备方法和应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 1
gcccatggac catcaccatc accatatgca tggagataca cctac 45
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 2
gcaagctttt atggtttctg ygaacagatg gggcacac 38
<210> 3
<211> 322
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 3
gcccatggac catcaccatc accatatgca tggagataca cctacattgc atgaatatat 60
gttagatttg caaccagaga caactgatct ctactgttat gagcaattca atgacagctc 120
agaggaggag gatgaaatag atggtccagc tggacaagca gaaccggaca gagcccatta 180
caatattgta accttttgtt gcaagtgtga ctctacgctt cggttgtgcg tacaaagcac 240
acacgtagac attcgtactt tggaagacct gttaatgggc acactaggaa ttgtgtgccc 300
catctgttca cagaaaccat aa 322
<210> 4
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 4
Met Asp His His His His His Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His
1 5 10 15
Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr
20 25 30
Glu Gln Phe Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro
35 40 45
Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe
50 55 60
Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His
65 70 75 80
Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile
85 90 95
Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro
100 105
<210> 5
<211> 1407
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 5
atgggttgga gctgtatcat cttctttctg gtagcaacag ctacaggtgt gcactcccag 60
gtccagctgc agcagtctgg gcctgaggtg gtgaggcctg gggtctcagt gaagatttcc 120
tgcaagggtt ccggctacac attcactgat tatgctatgc actgggtgaa gcagagtcat 180
gcaaagagtc tagagtggat tggagttatt agtacttaca atggtaatac aaactacaac 240
cagaagttta agggcaaggc cacagtgact gtagacaaat cctccagcac agcctatatg 300
gaacttgcca gattgacatc tgaggattct gccatctatt actgtgcaag aagagggttt 360
ggtaactcct ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgcagccaaa 420
acaacagccc catcggtcta tccactggcc cctgtgtgtg gagatacaac tggctcctcg 480
gtgactctag gatgcctggt caagggttat ttccctgagc cagtgacctt gacctggaac 540
tctggatccc tgtccagtgg tgtgcacacc ttcccagctg tcctgcagtc tgacctctac 600
accctcagca gctcagtgac tgtaacctcg agcacctggc ccagccagtc catcacctgc 660
aatgtggccc acccggcaag cagcaccaag gtggacaaga aaattgagcc cagagggccc 720
acaatcaagc cctgtcctcc atgcaaatgc ccagcaccta acctcttggg tggaccatcc 780
gtcttcatct tccctccaaa gatcaaggat gtactcatga tctccctgag ccccatagtc 840
acatgtgtgg tggtggatgt gagcgaggat gacccagatg tccagatcag ctggtttgtg 900
aacaacgtgg aagtacacac agctcagaca caaacccata gagaggatta caacagtact 960
ctccgggtgg tcagtgccct ccccatccag caccaggact ggatgagtgg caaggagttc 1020
aaatgcaagg tcaacaacaa agacctccca gcgcccatcg agagaaccat ctcaaaaccc 1080
aaagggtcag taagagctcc acaggtatat gtcttgcctc caccagaaga agagatgact 1140
aagaaacagg tcactctgac ctgcatggtc acagacttca tgcctgaaga catttacgtg 1200
gagtggacca acaacgggaa aacagagcta aactacaaga acactgaacc agtcctggac 1260
tctgatggtt cttacttcat gtacagcaag ctgagagtgg aaaagaagaa ctgggtggaa 1320
agaaatagct actcctgttc agtggtccac gagggtctgc acaatcacca cacgactaag 1380
agcttctccc ggactccggg taaatga 1407
<210> 6
<211> 468
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 6
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Phe Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Arg
20 25 30
Pro Gly Val Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asp Tyr Ala Met His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Val Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Phe Gly Asn Ser Trp Phe Ala Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro
130 135 140
Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser
145 150 155 160
Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
165 170 175
Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro
180 185 190
Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val
195 200 205
Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His
210 215 220
Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro
225 230 235 240
Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu
245 250 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu
260 265 270
Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
275 280 285
Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu
290 295 300
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr
305 310 315 320
Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser
325 330 335
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro
340 345 350
Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln
355 360 365
Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val
370 375 380
Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val
385 390 395 400
Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu
405 410 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg
420 425 430
Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val
435 440 445
Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg
450 455 460
Thr Pro Gly Lys
465
<210> 7
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 7
atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt catgatgtcc 60
agaggagaaa atgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatctcc agggggaaag 120
gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaggt gtgagttaca tgcactggta ccagcagaag 180
tcaagcacct cccccaaact ctggatttat gacacatcca acctggcttc tggagtccca 240
ggtcgcttca gtggcagtgg gtctggaaac tcttactctc tcacgatcag cagcatggag 300
gctgaagatg ttgccactta ttactgtttt caggggagtg ggtacccatt cacgttcggc 360
tcggggacaa agttggaaat tagacgggct gatgctgcac caactgtatc catcttccca 420
ccatccagtg agcagttaac atctggaggt gcctcagtcg tgtgcttctt gaacaacttc 480
taccccaaag acatcaatgt caagtggaag attgatggca gtgaacgaca aaatggcgtc 540
ctgaacagtt ggactgatca ggacagcaaa gacagcacct acagcatgag cagcaccctc 600
acgttgacca aggacgagta tgaacgacat aacagctata cctgtgaggc cactcacaag 660
acatcaactt cacccattgt caagagcttc aacaggaatg agtgttag 708
<210> 8
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 8
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Met Met Ser Arg Gly Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile
20 25 30
Met Ser Ala Ser Pro Gly Gly Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser
35 40 45
Ser Gly Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Ser Thr Ser
50 55 60
Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
100 105 110
Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg
115 120 125
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
130 135 140
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
165 170 175
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
180 185 190
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
195 200 205
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
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Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225 230 235
<210> 9
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 9
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
35 40 45
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
50 55 60
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln
85 90 95
Lys Pro