阅读说明：本技术 一种酶法生产左旋多巴的转化及提取方法 (Conversion and extraction method for producing levodopa by enzyme method ) 是由 任明 刘建民 孙荣 张雷 于 2020-05-14 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种酶法生产左旋多巴的转化及提取方法,该方法按如下步骤进行：1.酪氨酸酚裂解酶的制备：发酵液离心收集大肠杆菌,用磷酸盐缓冲液重悬菌体后通过高压均质机进行破壁处理；将破壁液过陶瓷膜,除去菌体碎片,收集滤液；将滤液过超滤膜,除去胞内小分子杂质,收集截留液；将截留液经脱色树脂处理,收集流出液,获得酪氨酸酚裂解酶。2.酶转化生产左旋多巴：按照3000-10000U/L向反应体系中加入酪氨酸酚裂解酶,加入反应底料,并在转化过程中分批次补加邻苯二酚、丙酮酸钠和氯化铵,转化液中左旋多巴的产量为120-150g/L。3.左旋多巴的提取：将转化液调整pH至3-4,4-8℃静置8-16h；离心收集沉淀,用5-10倍体积的纯水打浆后抽滤,重复此步骤2-5次；抽干后用乙醇淋洗晶体1-5次,抽滤至干；晶体置于40-80℃干燥1-4h,获得左旋多巴产品。左旋多巴含量达到98%以上,总收率达到80%以上。(The invention provides a method for converting and extracting levodopa by an enzyme method, which comprises the following steps of 1, preparing a tyrosol lyase, centrifugally collecting escherichia coli from a fermentation liquid, carrying out wall breaking treatment by a high-pressure homogenizer after the escherichia coli is resuspended by using a phosphate buffer solution, passing the wall breaking liquid through a ceramic membrane, removing thallus fragments, collecting filtrate, passing the filtrate through an ultrafiltration membrane, removing small molecular impurities in cells, collecting trapped liquid, carrying out decolorizing resin treatment on the trapped liquid, collecting effluent liquid, and obtaining the tyrosol lyase 2, carrying out enzyme conversion to produce the levodopa, adding the tyrosol lyase into a reaction system according to 3000-minus 10000U/L, adding a reaction bottom material, supplementing catechol, sodium pyruvate and ammonium chloride in batches in the conversion process, wherein the yield of the levodopa in the conversion liquid is 150 g/L, 3, carrying out extraction on the levodopa, regulating the pH of the conversion liquid to 3-4, standing for 8-16h at 4 ℃, centrifugally collecting precipitates, carrying out centrifugal collection, pulping by using pure water with the volume of 5-10 times, repeating the steps for 2-5, leaching, carrying out suction filtration to obtain the crystal with the total yield of the levodopa of more than 80-80%, and drying the crystal at the temperature of 80-40 ℃, and obtaining the total yield of the levodopa.)

一种酶法生产左旋多巴的转化及提取方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是一种利用酪氨酸酚裂解酶转化生产左旋多巴的转化及提取方法。

背景技术

左旋多巴（L-DOPA）又名3,4-二羟基苯丙氨酸，可以通过血脑屏障，在中枢神经脱羧酶的作用下转化为多巴胺，从而使脑组织中多巴胺含量增加以达到治疗帕金森综合征的目的。1970年，被美国食品药品监督管理局（FDA）批准为治疗帕金森综合征的药物。迄今为止，左旋多巴在国内外一直是治疗帕金森综合征的首选和最有效的药物。

上世纪60年代，国外许多学者开始致力于微生物酶法合成L-DOPA的研究，与植物提取法和化学合成法相比，酶法转化生产左旋多巴是一种反应条件温和、对环境友好的制备方法。通过微生物发酵制备酪氨酸酚裂解酶（TPL），TPL可催化邻苯二酚、丙酮酸钠和氯化铵生成左旋多巴，转化过程一般采用全细胞、游离酶或固定化酶，转化液大多经过调节至强酸后固液分离、活性炭脱色、多次酸碱法重结晶等步骤获得到左旋多巴产品。

酪氨酸酚裂解酶法制备左旋多巴，主要面临过量的邻苯二酚抑制TPL酶活力、转化过程中左旋多巴易被氧化、活性炭脱色对左旋多巴的吸附率高达20%、反复重结晶造成酸碱用量过大等问题。针对上述问题，科研人员对TPL法生产左旋多巴的转化和提取工艺进行了研究和改进。CN106117071B公开了采用陶瓷膜进行转化液固液分离。CN107141229A公布了TPL转化液中提取左旋多巴的同时，采用吸附树脂对反应底物邻苯二酚进行回收。CN110055291A公布了提取过程中，提前加入左旋多巴晶种，诱导结晶的方法。CN109161568A和CN110791536A提出了分批添加邻苯二酚和丙酮酸铵，解除底物对TPL的抑制。

本发明提供一种TPL生产左旋多巴的转化和提取工艺，将转化过程的脱色及除杂过程提前，取消重结晶步骤，极大的降低了酸碱用量；取消活性炭脱色，避免了提取过程中脱色环节对左旋多巴造成的损失，也避免了因加热引起的酪氨酸酚裂解酶的变性及反应体系中副产物的合成。本发明工艺步骤绿色环保，精简流畅，左旋多巴产量达到120-150g/L，提取总收率达到80%以上。所得产品左旋多巴含量达到98%以上。

发明内容

本发明提供一种酶法生产左旋多巴的转化及提取技术，本技术将纯化和脱色步骤前置，取消活性炭脱色和重结晶步骤，以达到减少酸碱用量、缩短提取处理时间、降低产物损失的目的。本发明的目的可通过如下技术措施来实现：

该方法按如下步骤进行：

1．酪氨酸酚裂解酶的制备

a.破壁：发酵液离心收集大肠杆菌，用发酵液体积10-20%的0.2M的磷酸缓冲液（pH7.2）重悬菌体，通过高压均质机进行破壁处理，压力为500-1000bar，处理时间为10-40min；

b.微滤：将a步骤获得的破壁液过陶瓷膜，微滤膜孔径为50-200nm，加入破壁液体积30%-100%的纯水清洗陶瓷膜，收集滤液，除去菌体碎片等物质；

c.超滤：将滤液过超滤膜，超滤膜截留分子量为100-150KD，加入料液体积30%-100%的纯水清洗超滤膜，收集截留液，除去胞内小分子杂质；

d.脱色：将c步骤获取的截留液经脱色树脂处理，流速为0.5-5BV，控制流出液T₄₅₀大于95%，收集流出液，获得酪氨酸酚裂解酶。

所述发酵液的制备方法：在发酵培养基（含10-100mg/L卡那霉素）中接入大肠杆菌进行培养，初始培养温度为30-40℃，培养至OD₆₀₀=2-10时加入终浓度为0.1-1mM的IPTG作为诱导剂，诱导温度为15-30℃，在转速为200-400rpm的条件下培养20-30h得到大肠杆菌发酵液。

所述发酵培养基主要成分及其含量为: 胰蛋白胨5-20g/L，酵母提取物1-10g/L，NaCl 4-15g/L，pH 7.0。

2．酶转化生产左旋多巴按

反应体系中加入底料，按照3000-10000U/L加入酪氨酸酚裂解酶；每10-40min，每升转化液补加邻苯二酚1-5g、丙酮酸钠1-5g；每2-4h，每升转化液补加氯化铵5-30g；整个转化过程中通小量氮气保持正压，全程控制pH值为8.0-8.5，100-200rpm缓慢搅拌，控制温度为15-25℃，控制邻苯二酚残留浓度不超过5g/L。

所述的反应体系中的底料为：邻苯二酚5-15g/L、丙酮酸钠5-15 g/L、氯化铵30-50g/L、EDTA0.5-5 g/L、亚硫酸钠0.5-5 g/L、维生素C0.1-2g/L、PLP0.1-0.2g/L。

所述的转化液中左旋多巴的终产量为120-150g/L，反应结束时间为连续两次测得邻苯二酚浓度降低至1 g/L。

3．左旋多巴的提取

a.用30-50%的H₂SO₄调整转化液pH至3.0-4.0，4-8℃静置8-16h；

b.将转化液经5000-10000rpm离心1-5min，收集沉淀；

c.将沉淀用5-10倍质量的纯水打浆后，抽滤，重复此步骤2-5次；

d.抽干后用0.1-0.5倍质量的乙醇淋洗晶体1-5次，抽滤至干；

e.晶体置于40-80℃干燥1-4h，获得左旋多巴产品，提取总收率达到80%以上，所得产品左旋多巴含量达到98%以上。

所述的提取方法适用于不同菌种来源的酪氨酸酚裂解酶、酪氨酸酶、转氨酶、酰基转移酶生产左旋多巴的提取过程。

该方法的技术路线：

发酵液离心→菌体重悬→高压均质破壁→陶瓷膜微滤→超滤→脱色→酶转化→析晶→离心→水洗晶体→乙醇淋洗→抽滤→烘干→左旋多巴成品。

本发明的有益效果在于：

1.将酪氨酸酚裂解酶进行纯化后再加入转化体系，使得左旋多巴的提取工艺中的脱色和除杂步骤前置， 缩短了后续处理时间，最大程度的避免了左旋多巴产品在提取精制过程中发生氧化。

2. 转化过程中，分批次添加底物，控制邻苯二酚残留浓度不超过5g/L，降低邻苯二酚对酪氨酸酚裂解酶的抑制作用。

3. 舍弃了重结晶步骤，极大减少了酸碱用量，与传统工艺相比，每生产1公斤左旋多巴，减少浓硫酸用量为0.3公斤，减少氨水用量为3公斤。

4.取消活性炭脱色，避免了提取过程中活性炭对左旋多巴的吸附，也避免了因加热引起的酪氨酸酚裂解酶的变性及反应体系中副产物的合成。

具体实施方式

：

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1：大肠杆菌发酵液的制备

斜面培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉15g/L。pH至7.0，卡那霉素的终浓度为50mg/L。

种子培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH至7.0，卡那霉素的终浓度为50mg/L。

发酵培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH至7.0，卡那霉素的终浓度为50mg/L。

取1环新鲜培养的大肠杆菌接种于种子培养基，37℃，180rpm培养16h。采用20L全自动发酵罐进行发酵培养，将液体种子以5%的接种量接种于发酵培养基，于37℃，300rpm条件下，培养至OD₆₀₀=6时，加入终浓度为0.2mM的IPTG（过滤除菌）作为诱导剂，25℃进行诱导产酶，培养24h。获得的大肠杆菌湿重为25.5g/L，酪氨酸酚裂解酶活力为106U/g湿菌体。

实施例2：酪氨酸酚裂解酶的制备

发酵液8000rpm离心10min收集大肠杆菌，用发酵液体积10%的0.2M的磷酸缓冲液（pH7.2）重悬菌体，通过高压均质机进行破壁处理，压力为800bar，处理15min；破壁液过陶瓷膜，孔径为200nm，加入料液体积80%的纯水清洗陶瓷膜，收集滤液；将滤液过超滤膜，截留分子量为100KD，加入料液体积80%的纯水清洗超滤膜，收集截留液；将截留液经大孔吸附型脱色树脂（SP207）处理，控制流速为2BV，收集流出液，获得酪氨酸酚裂解酶，酶活力为55.6U/mL。

实施例3：酪氨酸酚裂解酶的制备

发酵液6000rpm离心20min收集大肠杆菌，用发酵液体积20%的0.2M的磷酸缓冲液（pH7.2）重悬菌体，通过高压均质机进行破壁处理，压力为600bar，处理30min；破壁液过陶瓷膜，孔径为100nm，加入料液体积30%的纯水清洗陶瓷膜，收集滤液；将滤液过超滤膜，截留分子量为150KD，加入料液体积30%的纯水清洗超滤膜，收集截留液；将截留液经离子交换型脱色树脂（A-722）处理，控制流速为1BV，收集流出液，获得酪氨酸酚裂解酶，酶活力为53.1U/mL。

实施例4：TPL转化生产左旋多巴

在1L的转化体系中加入6000U的酪氨酸酚裂解酶，加入邻苯二酚8g/L、丙酮酸钠10g/L、氯化铵30g/L、EDTA2 g/L、亚硫酸钠2 g/L、维生素C0.5g/L、PLP0.1g/L。控制pH值为8.0，100rpm搅拌，控制温度为18℃，整个转化过程中通小量氮气保持正压。每间隔30min，补加邻苯二酚2.5g、丙酮酸钠3g；每间隔4h，补加氯化铵15g。转化12h，转化液中左旋多巴的终浓度为137.5g/L，转化率为99.7%。

实施例5：TPL转化生产左旋多巴

在1L的转化体系中加入8000U的酪氨酸酚裂解酶，加入邻苯二酚12g/L、丙酮酸钠15g/L、氯化铵50g/L、EDTA3.5 g/L、亚硫酸钠3.5 g/L、维生素C1.5g/L、PLP0.2g/L。控制pH值为8.5，200rpm搅拌，控制温度为23℃，整个转化过程中通小量氮气保持正压。每间隔40min，补加邻苯二酚5g、丙酮酸钠5g；每间隔2h，补加氯化铵10g。转化10h，转化液中左旋多巴的终浓度为146g/L，转化率为99.4%。

实施例6：左旋多巴的提取与精制

用50%的H₂SO₄调整转化液pH至3.0，4℃静置8h；将转化液经8000rpm离心3min，收集沉淀；将沉淀用5倍质量的纯水打浆后，抽滤，重复此步骤5次；抽干后用0.5倍质量的乙醇淋洗晶体3次，抽滤至干；晶体置于60℃干燥2h，获得左旋多巴产品。经HPLC检测，左旋多巴含量为99.5%，总收率为85.6%。

实施例7：左旋多巴的提取与精制

用30%的H₂SO₄调整转化液pH至4.0，6℃静置12h；将转化液经10000rpm离心2min，收集沉淀；将沉淀用10倍质量的纯水打浆后，抽滤，重复此步骤2次；抽干后用0.2倍质量的乙醇淋洗晶体5次，抽滤至干；晶体置于40℃干燥4h，获得左旋多巴产品。经HPLC检测，左旋多巴含量为98.5%，总收率为83.2%。

实施例8：邻苯二酚及左旋多巴的检测方法

1.邻苯二酚的检测方法

采用HPLC检测转化过程中邻苯二酚的残留量，色谱柱为Inertsil ODS-3（5μm, 4.6*250mm）；紫外检测器；波长：215nm；流动相A：水，流动相B：乙腈，A:B=90:10；柱温30℃；流速1mL/min。

2.左旋多巴的含量检测方法

采用HPLC检测左旋多巴的含量，色谱柱为Inertsil ODS-3（5μm, 4.6*250mm）；紫外检测器；波长280nm；流动相A：0.1%三氟乙酸水溶液，流动相B：四氢呋喃，A:B=97:3；柱温25℃；流速1mL/min。