阅读说明：本技术 一种基于酶促拆分法的混菌发酵产d-赖氨酸 (Enzymatic resolution method-based D-lysine produced by mixed fermentation ) 是由 陈可泉 许晟 王昕� 冯娇 于 2020-03-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于酶促拆分法的混菌发酵产D-赖氨酸。该方法包括以下步骤：构建重组菌株E.coli BL-pTrc99a-DapA；构建E.coli BL-pET28a-LYR葡萄糖代谢缺陷型菌株；选取重组菌株E.coli BL-pTrc99a-DapA和E.coli BL-pET28a-LYR加入发酵培养基中,葡萄糖和甘油为碳源,生产DL-赖氨酸,最后采用含有赖氨酸脱羧酶的粗酶液将DL-赖氨酸中L-赖氨酸转化为1,5-戊二胺。与现有技术相比,降低了生产成本,终产物D-赖氨酸的产量提高。相比于利用E.coli BL-pET28a-LYR单一发酵生产,D-赖氨酸的摩尔收率提高了35%。(The invention discloses a method for producing D-lysine by mixed fermentation based on an enzymatic resolution method, which comprises the following steps of constructing a recombinant strain E.coli B L-pTrc 99a-DapA, constructing an E.coli B L-pET 28 a-L0 YR glucose metabolism defective strain, selecting the recombinant strain E.coli B L-pTrc 99-DapA and E.coli B L-pET 28 a-L YR, adding glucose and glycerol as carbon sources into a fermentation culture medium, producing D L-lysine, and finally adopting crude enzyme liquid containing lysine decarboxylase to convert L-lysine in D L-lysine into 1, 5-pentanediamine.)

一种基于酶促拆分法的混菌发酵产D-赖氨酸

技术领域

本发明涉及D-赖氨酸制备技术领域，具体涉及一种基于酶促拆分法的混菌发酵产D-赖氨酸。

背景技术

D-赖氨酸在常温常压下稳定，呈针状或片状结晶，溶于水、酸，微溶于氯仿、乙醚、乙醇。其具有较好的抗菌性，在医药上具有较为重要的用途，它可以作为前体参与促黄体生成素释放激素类似物的合成，它能够抑制一些不是酶的蛋白质的糖基化，从而能够预防糖尿病的一些并发症。一些D-赖氨酸参与合成的药物（口服和静脉给药）都可以大大减少肾对放射性肽的摄取，因此，相对于L-赖氨酸而言，D-赖氨酸更加适合用于癌症的治疗。以D-赖氨酸为原料合成的抗菌肽 CM15 能够显著增强细胞膜通透能力、能显著降低细胞毒性、能够防止蛋白酶水解。此外，D-赖氨酸的多聚体能够刺激人脑星形胶质细胞和软骨细胞的增殖，同时它也是一种药物的良好载体。

目前，主要采用化学法、生物酶法或者化学与生物相偶联的方法来进行D-赖氨酸的合成。其中由化学消旋获得DL-赖氨酸的操作流程较为复杂，并且需要在高温、强酸或强碱等较为苛刻的条件下进行。同时，化学法拆分DL-赖氨酸不仅收率不高，且手性拆分剂的价格较为昂贵，其价格往往会超出目的产物的价格。而采用生物酶法消旋制备D-赖氨酸则具有反应条件温和、立体选择性强、催化效率高等优点，此法已成为拆分或合成手性化合物的重要途径。

酶法拆分是指利用从微生物细胞内分离出来的酶或者直接利用含有此酶微生物活细胞来进行手性化合物的拆分。酶拆分的独特之处就在于酶蛋白质的活性中心是一个由L-氨基酸构成的不对称环境。在一定条件下，酶这一特殊的的活性中心使得其只能与外消旋混合物中的一个对映体进行结合并发生某个反应，使其变为另一种与对映体的性质差别较大的化合物，从而达到拆分两个对映体的目的。我国的科研工作者们也在相关领域作出了贡献。如钱绍松等先将(DL)-茶氨酸经乙酰化生成(DL)-N-乙酰基茶氨酸，然后利用米曲霉氨基酰化酶拆分(DL)-N-乙酰基茶氨酸得L-茶氨酸，收率85%，光学纯度为98%。黄冠华等在固定化青霉素酰化酶(IPA-750)存在下，通过N-苯乙酰-(DL)-苯丙氨酸的选择性水解完成了酶法拆分(DL)-苯丙氨酸制备D-苯丙氨酸的过程，收率67%，光学纯度达到91%。目前关于D-赖氨酸的酶促拆分的研究较少，主要有刘毅等先采用化学消旋法将L-赖氨酸消旋为DL-赖氨酸，再以蜂房哈夫尼菌(Hafniaalvei) 中的赖氨酸脱羧酶对DL-赖氨酸进行立体选择性生物转化，从30 g DL-赖氨酸中获得8.5 g D-赖氨酸，收率为28%。Takahashi 等利用化学生物偶联法，以L-赖氨酸盐酸盐为原料，通过化学消旋的方式得到质量浓度为100 g/L的DL-赖氨酸 反应液，再经加氧酶和脱氨酶将L-赖氨酸直接降解掉，最终，混合反应液中剩余47 g/L 的D-赖氨酸，结晶分离后D-赖氨酸的收率为38%。上述两种方法都是采用先化学消旋后酶促拆分来合成D-赖氨酸，但是该方法的收率都不高，操作流程较为复杂且环境污染较大。

目前为止，通过将DapA和LYR分开表达在两个细胞中，利用混菌发酵的方式，使得中间产物积累减少，提高DL-赖氨酸的产量，并通过酶促拆分法获得终产物的D-赖氨酸生产方法尚未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于酶促拆分法的混菌发酵产D-赖氨酸，该方法实现L-赖氨酸不与DL-赖氨酸合成菌竞争葡萄糖，再结合酶促拆分法制备D-赖氨酸条件温和，中间产物少，适合大规模工业化生产。

一种基于酶促拆分法的混菌发酵产D-赖氨酸，包括以下步骤：

步骤1，构建重组菌株E.coli BL-pTrc99a-DapA；

步骤2，构建E.coli BL-pET28a-LYR葡萄糖代谢缺陷型菌株；

步骤3，选取重组菌株E.coli BL-pTrc99a-DapA和E.coli BL-pET28a-LYR加入发酵培养基中，以葡萄糖和甘油为碳源，培养至OD约为0.6时用IPTG诱导，继续培养生产DL-赖氨酸；

步骤4，采用含有赖氨酸脱羧酶的粗酶液将DL-赖氨酸中L-赖氨酸转化为1,5-戊二胺，从而获得D-赖氨酸。

作为改进的是，步骤1中E.coli BL-pTrc99a-DapA构建方法为：选取引物，通过PCR复制大肠杆菌MG1655上的二氢吡啶甲酸合酶，再与载体pTrc99a连接，并转入克隆载体Trans1-T1，经过LB平板初筛后，挑点进行菌落PCR验证后测序。

作为改进的是，步骤2中E.coli BL-pET28a-LYR葡萄糖代谢缺陷型菌株构建方法为：将来源于P. mirabilis BCRC10725 的基因LYR基因密码子优化后交由金唯智公司合成于载体pET28a的NcoI /XhoI酶切位点之间，转入克隆载体Trans1-T1，经过LB平板初筛后，挑点进行菌落PCR验证后测序。

作为改进的是，步骤2中所述E .coli BL-pET28a-LYR葡萄糖代谢缺陷型菌株构建方

法如下：利用Crispr-Cas9编辑技术敲除大肠杆菌BL21（DE3）的磷酸转移酶系统(PTS) ptsG、ptsH、ptsI、crr和glk基因编码的蛋白，将构建好的质粒pET28a-LYR转化至葡萄糖代谢缺陷型的BL21（DE3）的感受态中，即得E.coli BL-pET28a-LYR葡萄糖代谢缺陷型菌株。

作为改进的是，步骤3中所述将重组菌株E.coli BL-pTrc99a-DapA和E.coli BL-pET28a-LYR的细胞OD比为3：1。

作为改进的是，步骤3中所述葡萄糖和甘油的添加的摩尔比为6：1。

作为改进的是，步骤3中所述诱导温度为35℃。

作为改进的是，步骤4中所述含有赖氨酸脱羧酶的粗酶液中添加的终浓度为1mg/mL。

有益效果：

与现有技术相比，本发明一种混菌发酵生产D-赖氨酸的方法的优势在于：

1、利用Crispr-Cas9技术敲除磷酸转移酶系统(PTS) ptsG、ptsH、ptsI、crr和glk等基因编码的蛋白，实现L-赖氨酸不与DL-赖氨酸合成菌竞争葡萄糖，从而提高DL-赖氨酸的产量和减少副产物的生成。

2、利用酶促拆分法拆分DL-赖氨酸制备高浓度D-赖氨酸，即拆分过程中反应条件温和、立体选择性强、催化效率高等优点。

3、混菌发酵方式对解除单一菌株的发酵瓶颈，在提高D-赖氨酸的产量和产率方面具有显著的效果。相比于利用E.coli BL-pET28a-LYR单一利用L-赖氨酸发酵生产，降低了生产成本，D-赖氨酸的摩尔收率提高了35%。

附图说明

图1为E.coli BL-pTrc99a-DapA和E.coli BL-pET28a-LYR1在OD600下OD接种比例优化情况；

图2为E.coli BL-pTrc99a-DapA和E.coli BL-pET28a-LYR1混菌培养初始葡萄糖和甘油的摩尔浓度比例优化情况；

图3为E.coli BL-pTrc99a-DapA和E.coli BL-pET28a-LYR1混菌培养的诱导温度优化情况；

图4为赖氨酸脱羧酶粗酶液的浓度对获得高纯度D-赖氨酸的影响。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

本实验中大肠杆菌MG1655，大肠杆菌Trans1-T1，大肠杆菌BL21(DE3)，质粒pTrc99a，质粒pET28a均为商业化物品，可以常规购买；工程菌大肠杆菌AST3构建方法见申请号 为2020101559422，名称为一种葡萄糖代谢缺陷型菌株的构建方法及其混菌发酵产1,5-戊二胺的专利。

实施例1 重组菌株E.coli BL-pTrc99a-DapA的构建

以大肠杆菌MG1655全基因组为模板选取引物

DapA-99a-F: cacacaggaaacagaccatgttcacgggaagtattgtcgc,

DapA-99a-R：cacacaggaaacagaccatgttcacgggaagtattgtcgc，

通过PCR复制大肠杆菌MG1655上的二氢吡啶甲酸合酶，得到的序列经1％琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段，再与载体pTrc99a连接，将连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1。PCR 筛选阳性菌株Trans1-T1-pTrc99a-DapA并进行DNA测序，验证重组质粒构建正确。

将阳性菌株接种至5ml LB/Amp 液体培养基，LB/Amp液体培养基组成为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L，于37℃、200rpm 条件下振荡培养过夜。24小时后按照天根质粒提试剂盒操作说明提取质粒pTrc99a-DapA。取2μlpTrc99a-DapA质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中，并涂布在含有50mg/L氨苄青霉素抗性的平板上，37℃过夜培养，得到重组菌株E.coli BL-pTrc99a-DapA。

实施例2 E.coli BL-pET28a-LYR葡萄糖代谢缺陷型菌株的构建

将来源于P. mirabilis BCRC10725 的基因LYR基因密码子优化后交由金唯智公司合成于载体pET28a的NcoI /XhoI酶切位点之间，将连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1。PCR 筛选阳性菌株Trans1-T1-pET28a-panD并进行DNA测序，验证重组质粒构建正确。

将阳性菌株接种至5ml LB/kanR 液体培养基，LB/kanR 液体培养基组成为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L，于37℃、200rpm 条件下振荡培养过夜。24小时后按照天根质粒提试剂盒操作说明提取质粒pET28a-LYR。

利用Crispr-Cas9编辑技术敲除大肠杆菌BL21（DE3）的磷酸转移酶系统(PTS)ptsG、ptsH、ptsI、crr和glk基因编码的蛋白，即得葡萄糖代谢缺陷型菌株感受态细胞BL21(DE3)-1。取2μl 构建好的pET28a-LYR质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)-1中，并涂布在含有50mg/L卡那霉素抗性的平板上，37℃过夜培养，即得E.coli BL-pET28a-LYR葡萄糖代谢缺陷型菌株。

实施例3 混菌发酵产D-赖氨酸

将重组菌株E.coli BL-pTrc99a-DapA的单菌落接种到含有50mg/L氨苄青霉素抗性的5mlLB摇管里，37℃培养6-8h后，得到重组菌株E .coli BL-pTrc99a-DapA的种子液；

挑取重组菌株E.coli BL-pET28a-LYR的单菌落接种到含有50mg/L卡那霉素抗性的5mlLB摇管里，37℃培养6-8h后，得到重组菌株E.coli BL-pET28a-LYR的种子液；

将实验室现有的利用L-赖氨酸产1，5-戊二胺的工程菌大肠杆菌AST3的单菌落接种到含有50m g/L 氨苄青霉素和34 mg/L 的氯霉素抗性的5mlLB摇管里，37℃培养6-8h后，得到重组菌株AST3的种子液，然后将种子液全部转接至含有50m g/L 氨苄青霉素和34 mg/L 的氯霉素抗性的100mL LB摇瓶中，37℃培养至OD约为0.6时，加入2‰的乳糖诱导12h，12000r/min离心5 min，收集AST3菌体，用0.2 mol/L 磷酸钾缓冲溶液( pH 7.0)重悬，且利用0.5% Triton X-100处理后破碎，离心收集上清即得含有赖氨酸脱羧酶粗酶液。

将E.coli BL-pTrc99a-DapA和E.coli BL-pET28a-LYR细胞种子液在OD600条件下按照1:1至5：1比例添加（OD比例优化情况如图1所示，当E .coli BL-pTrc99a-DapA和E.coli BL-pET28a-LYR的细胞OD比例关系为3：1时，其DL-赖氨酸产量最佳），加入葡萄糖与甘油摩尔比例1:1至8：1（葡萄糖与甘油摩尔比的结果如图2所示，当葡萄糖和甘油的添加的摩尔比为6：1时，其DL-赖氨酸产量最佳），在OD约为0.6时用IPTG诱导,诱导温度为20℃~40℃（诱导温度优化情况如图3所示，当诱导温度为35℃时，其DL-赖氨酸产量最佳）时发酵生成DL-赖氨酸。反应结束后在生成的DL-赖氨酸的发酵液中添加0.5~2.5mg/mL（添加含有赖氨酸脱羧酶的粗酶液浓度优化如图4所示，在添加1mg/mL时，其D-赖氨酸产量最佳）的含有赖氨酸脱羧酶的粗酶液拆分DL-赖氨酸，即得D-赖氨酸。（原始反应参数为E.coli BL-pTrc99a-DapA和E.coli BL-pET28a-LYR细胞种子液OD比例为：1：1；葡萄糖与甘油摩尔比为2：1；IPTG诱导温度为30℃；添加含有赖氨酸脱羧酶的粗酶液浓度为1mg/mL；每进行一个参数的优化实验时，其他的参数都是相同的。且本实施例中提及的优化手段均为本领域常规技术手段。）

E.coli BL-pTrc99a-DapA和E.coli BL-pET28a-LYR在细胞种子液OD比例为3：1，葡萄糖与甘油摩尔比为6：1，IPTG诱导温度为35℃，添加含有赖氨酸脱羧酶的粗酶液浓度为1mg/mL的情况下发酵生产D-赖氨酸情况相比于利用E.coli BL-pET28a-LYR单一利用L-赖氨酸发酵生产，降低了生产成本，D-赖氨酸的摩尔收率提高了35%。

序列表

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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