阅读说明：本技术 一种化学酶法制备d-谷氨酰胺的方法 (Method for preparing D-glutamine by chemical enzyme method ) 是由 陈诚 吴聪 程文莹 甘飞 *** 刘均忠 焦庆才 于 2019-11-14 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种化学酶法制备D-谷氨酰胺的方法。所述方法按以下步骤进行：1、制备N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸；2、制备N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸酐；3、制备N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酰胺；4、制备DL-谷氨酰胺；5、培养制备氨肽酶；6、氨肽酶拆分DL-谷氨酰胺。本发明利用成本低廉的DL-谷氨酸为原料,经四步简单的化学反应制备DL-谷氨酰胺,并对工艺参数进行优化,DL-谷氨酰胺收率由57%提高至67%；利用氨肽酶拆分DL-谷氨酰胺,得到L-谷氨酸和D-谷氨酰胺,D-谷氨酰胺达到理论收率的95%。本发明原料成本低、工艺路线简单、绿色环保,有利于工业化实施。(The invention provides a method for preparing D-glutamine by a chemical enzyme method. The method comprises the following steps: 1. preparing N-phthaloyl-DL-glutamic acid; 2. preparing N-phthaloyl-DL-glutamic anhydride; 3. preparing N-phthaloyl-DL-glutamine; 4. preparing DL-glutamine; 5. culturing to prepare aminopeptidase; 6. aminopeptidase cleaves DL-glutamine. The method utilizes low-cost DL-glutamic acid as a raw material, prepares DL-glutamine through four simple chemical reactions, optimizes process parameters, and improves the yield of the DL-glutamine from 57 percent to 67 percent; the DL-glutamine is resolved by aminopeptidase to obtain L-glutamic acid and D-glutamine, wherein the yield of the D-glutamine reaches 95 percent of the theoretical yield. The invention has low cost of raw materials, simple process route, environmental protection and contribution to industrial implementation.)

一种化学酶法制备D-谷氨酰胺的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种化学酶法制备D-谷氨酰胺的方法。

背景技术

自然界中D-氨基酸的含量远低于L-氨基酸，D-氨基酸构成的蛋白质多肽通常不被或缓慢地被多肽酶水解, 因此D-氨基酸已被用于合成β-内酰胺类抗生素和生理活性肽，广泛应用于医药、化工、食品等领域。

D-谷氨酰胺分子式为C10H20N4O6，相对分子质量146.14，白色针状结晶，无臭、有微甜香味，熔点184-185℃（分解）。溶于甲醇、乙醇、醚、苯、丙酮、氯仿和乙酸乙酯。在中性溶液中稳定，在酸、碱或热水中易分解成谷氨酸，或内酯化为吡咯羧酸。D-谷氨酰胺是一种药用氨基酸，用于治疗胃和十二指肠溃疡以及幼儿智力低下等症，也是治疗白血病药物的中间体，具有十分重要的应用前景。

目前报道的工业化生产D-氨基酸的主要方法是以L-氨基酸为原料制备D-氨基酸。首先用化学法或生物法消旋L-氨基酸为DL-氨基酸，其次用化学法或生物法拆分DL-氨基酸得到D-氨基酸。常用化学拆分法有衍生物拆分法和环聚醚拆分法，常用生物拆分法有酰化酶法，羧肽酶法和酶不对称降解法。

（1）衍生物拆分法：该法是将消旋氨基酸与纯的手性酸或碱生成复盐，然后再用物理方法如重结晶或色谱法将两种对映异构体分离，再用水解方法重新得到纯的D型或L型氨基酸。常用的手性碱是马钱子碱及其盐类，常用的手性酸是酒石酸、樟脑、磺酸(CA)S及其盐类。利用该法进行消旋体的拆分，必须在拆分前先进行氨基酸的衍生，拆分后再水解去衍生，非目标对映体要多次循环消旋，产品需多次重结晶，工艺复杂，收率低。尤其是手性拆分剂价格昂贵，大大增加了生产成本。

（2）环聚醚拆分法：具有光学活性的环聚醚，对光学异构体具有独特的识别性，它可与对映体中的被识别异构体形成稳定的复合物，而与旋光性相反的另一异构体的结合稳定性差，利用这些对映体复合物在极性和非极性溶剂中的分配系数不同而达到光学拆分的目的。用冠醚拆分α-氨基酸，无须进行氨基保护，操作也比较方便，但是目前由于合成冠醚比较昂贵，因此其只能限于实验室的研究与应用。

（3）生物拆分法：酶本身就是一种手性分子，具有催化专一性和立体选择性。消旋化氨基酸的α-氨基乙酰化（或羧基酰胺化）后，用水解酶如酰化酶、羧肽酶或氨肽酶等水解，由于水解酶只能识别并水解L-氨基酸形成的酰胺键，因此，可以将L-氨基酸游离出来；酶不能水解的D-氨基酸形成的酰胺键，仍以乙酰氨基酸或羧基酰化氨基酸的形式存在，从而达到分离的目的。或者直接对DL-氨基酸进行酶法降解，消除其中的L型对映体，得到D-氨基酸。

钱绍松等（现代化工, 2005, (25)9: 44-46）以DL-谷氨酰胺为底物，利用L-谷氨酰胺脱羧酶选择性裂解L-谷氨酰胺生成4-氨基丁酰胺，保留D-谷氨酰胺，D-谷氨酰胺收率达到理论收率的92%。

目前市售谷氨酰胺主要是L-谷氨酰胺，而谷氨酰胺的γ位酰胺键使得其对酸、碱或高温等条件很不稳定，容易形成焦谷氨酸或者分解成谷氨酸，所以利用化学消旋L-谷氨酰胺制得DL-谷氨酰胺有困难。钱绍松等（有机化学, 2006, (26)4: 514-517）以DL-谷氨酸为原料，通过四步反应化学合成了DL-谷氨酰胺，收率57%。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供一种高效、低成本制备D-谷氨酰胺的方法。

本发明的设计思想是利用成本低廉的DL-谷氨酸为原料，使用廉价的邻苯二甲酰基为保护基，经四步简单的化学反应制备DL-谷氨酰胺，再利用氨肽酶拆分DL-谷氨酰胺，得到D-谷氨酰胺。化学合成DL-谷氨酰胺每步反应产物均易结晶分离，酶法拆分DL-谷氨酰胺无需对底物进行修饰，催化效率高，立体选择性强，反应条件温，产物分离方法简单，有利于工业化实施。本发明采用的工艺路线如下：

本发明对化学合成DL-谷氨酰胺的工艺路线进行了优化，DL-谷氨酰胺收率提高至67%，并利用氨肽酶拆分DL-谷氨酰胺，得到L-谷氨酸和D-谷氨酰胺，D-谷氨酰胺达到理论收率的95%。而另一产物L-谷氨酸可以通过消旋得到DL-谷氨酸，使得整个化学酶法制备D-谷氨酰胺的工艺路线循环起来。

为实现上述目的，本发明通过以下技术方案来达到：

一种化学酶法制备D-谷氨酰胺的方法，所述方法按以下步骤进行：

1、制备N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸：在圆底烧瓶中加入摩尔比为1:1~1:1.2的DL-谷氨酸和邻苯二甲酸酐，在150~200℃温度下，油浴10~40分钟，自然冷却，析出晶体，干燥获得到N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸；

2、制备N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸酐：将步骤1产生的N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸溶于醋酸酐中，回流20~60分钟，自然冷却，析出晶体，过滤，结晶用乙酸乙酯洗涤，干燥获得N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸酐；

3、制备N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酰胺：将步骤2产生的N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸酐溶于浓度为2~4 mol/L的氨水溶液中，室温条件下搅拌反应20~60分钟，随后加入浓度为6 mol/L的盐酸酸化至pH值为3，析出晶体，过滤，干燥获得N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酰胺；

4、制备DL-谷氨酰胺：将步骤3产生的N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酰胺溶于浓度为0.5-2mol/L的水合肼溶液中，室温放置12~40小时，反应液用浓度为6 mol/L的盐酸酸化至pH值为3，过滤除去析出的邻苯二甲酰肼，滤液减压浓缩，析出DL-谷氨酰胺，最后精制、干燥获得DL-谷氨酰胺；

5、培养制备氨肽酶：将具有氨肽酶活性的菌株在培养基中培养，产生高活性的氨肽酶，培养基中总碳源质量浓度为1~20 g/L；培养基中总氮源质量浓度为1~20 g/L；

6、氨肽酶拆分DL-谷氨酰胺：将步骤4得到的DL-谷氨酰胺配制成浓度为10~100 g/L的溶液，加入终浓度为5~40 g/L氨肽酶菌株或粗酶液、0.05~0.1 g/L Tween 80或Triton X-100，在20~45℃温度下，用浓度为2~3 mol/L的碳酸钠缓冲液控制pH值为7~10，酶促转化得到L-谷氨酸和D-谷氨酰胺，用等电点结晶和离子交换树脂相结合的方法分离得到高纯度D-谷氨酰胺。

所述方法步骤5培养基中的碳源为葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和/或乳糖中的一种或多种任意组成。

所述方法步骤5培养基中的氮源为牛肉膏、酵母膏、玉米浆、蛋白胨和/或豆饼水解液中的一种或多种任意组成。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

1、本发明利用成本低廉的DL-谷氨酸为原料，经四步简单的化学反应制备DL-谷氨酰胺，并对工艺参数进行优化，DL-谷氨酰胺收率由57%提高至67%；

2、本发明利用氨肽酶拆分DL-谷氨酰胺，具有底物浓度高、催化效率高、立体选择性强、反应条件温和等优点，产物D-谷氨酰胺收率可达理论收率的95%；

3、本发明利用酶法拆分DL-谷氨酰胺的产物之一L-谷氨酸，经消旋可以得到DL-谷氨酸，又可以作为制备DL-谷氨酰胺的原料，使得整个化学酶法拆分DL-谷氨酰胺的工艺循环起来；

4、本发明采用的氨肽酶可直接催化拆分底物DL-谷氨酰胺，无需对底物进行修饰，工艺路线简单、绿色环保，有利于工业化实施。

具体实施方式

下面结合实施例进一步对本发明的技术进行清楚、完整的描述。

实施例一

1、制备N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸：在圆底烧瓶内，分别加入14.6 g DL-谷氨酸和14.7g邻苯二甲酸酐，在150℃温度下，油浴10分钟，待反应液自然冷却，析出晶体，干燥获得24.76 g N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸，收率90%。

2、制备N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸酐：将所得N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸在50 mL醋酸酐中回流10分钟，自然冷却，析出晶体，过滤，结晶用乙酸乙酯洗涤，干燥获得22.23 g N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸酐，收率96%。

3、制备N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酰胺：将所得N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸酐与40 mL浓度为2 mol/L的氨水溶液在室温下搅拌反应20分钟，之后加入浓度为6 mol/L 的盐酸酸化至pH值为3，静置析出晶体，过滤，干燥获得19.89 g N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酰胺，收率84%。

4、制备DL-谷氨酰胺：将所得N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酰胺加到浓度为0.5 mol/L的水合肼溶液中，室温放置24小时，反应液用浓度为6 mol/L的盐酸酸化至pH值为3，过滤除去析出的邻苯二甲酰肼，滤液减压浓缩析出DL-谷氨酰胺，精制、干燥获得9.79 g白色针状晶体DL-谷氨酰胺，收率93%。DL-谷氨酰胺总收率为67.5%。

5、培养制备氨肽酶：将具有氨肽酶活性的菌株在培养基中培养，产生高活性的氨肽酶，培养基中碳源为葡萄糖和乳糖，总碳源质量浓度为1 g/L，培养基中氮源为酵母膏和蛋白胨，总氮源质量浓度为20 g/L。

6、氨肽酶拆分DL-谷氨酰胺：将步骤4获得的DL-谷氨酰胺9.0 g 溶于900 mL水中，用浓度为2 mol/L的碳酸钠缓冲液控制反应液的pH值为7.0，加入氨肽酶菌体细胞5 g、0.05g/L Triton X-100，在20℃温度下，反应12小时。

7、分离制备D-谷氨酰胺：4000-6000 r/min离心10-20分钟，去除氨肽酶菌体细胞，上清液升温至50-80℃活性炭脱色20-30分钟，抽滤，滤液浓缩后用浓度为6 mol/L的盐酸调pH值至3.2，析出固体，过滤，干燥获得3.85 g L-谷氨酸，收率85%。剩余母液稀释后pH 值调至7.5，经弱碱性阴离子交换树脂分离，收集洗脱液，减压浓缩结晶，过滤，干燥获得4.27 gD-谷氨酰胺，达到D-谷氨酰胺理论收率的95%。

实施例二

1、制备N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸：在圆底烧瓶内，分别加入29.2 g DL-谷氨酸和32.3g邻苯二甲酸酐，在160℃温度下，油浴15分钟，待反应液自然冷却，析出晶体，干燥获得50.7g N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸，收率91%。

2、制备N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸酐：将所得N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸在80 mL醋酸酐中回流30分钟，自然冷却，析出晶体，过滤，结晶用乙酸乙酯洗涤，干燥获得44.48 g N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸酐，收率95%。

3、制备N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酰胺：将所得N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸酐与80 mL浓度为 3mol/L的氨水溶液在室温下搅拌反应30分钟，之后加入浓度为6 mol/L的盐酸酸化至pH值为3，静置析出晶体，过滤，干燥获得40.28 g N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酰胺，收率85%。

4、制备DL-谷氨酰胺：将所得N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酰胺加到浓度为1 mol/L的水合肼溶液中，室温放置20小时，反应液用浓度为6 mol/L的盐酸酸化至pH值为3，过滤除去析出的邻苯二甲酰肼，滤液减压浓缩析出DL-谷氨酰胺，精制、干燥获得19.61 g白色针状晶体DL-谷氨酰胺，收率92%。DL-谷氨酰胺总收率67.6%。

5、培养制备氨肽酶：将具有氨肽酶活性的菌株在培养基中培养，产生高活性的氨肽酶，培养基中碳源为蔗糖和乳糖，总碳源质量浓度为10 g/L，培养基中氮源为酵母膏和玉米浆，总氮源质量浓度为10 g/L。

6、氨肽酶拆分DL-谷氨酰胺：将步骤4获得的DL-谷氨酰胺19.0 g溶于500 mL水中，用浓度为3 mol/L的碳酸钠缓冲液控制反应液的pH值为8，加入氨肽酶菌体细胞5 g、0.07g/L Triton X-100，在25℃温度下，反应16小时。

7、分离制备D-谷氨酰胺：4000-600 r/min 离心10-20分钟，去除氨肽酶菌体细胞，上清液升温至50-80℃活性炭脱色20-30分钟，抽滤，滤液用浓度为6 mol/L的盐酸将pH值调至3.2，析出固体，过滤，干燥获得8.03 g L-谷氨酸，收率84%。剩余母液稀释后将pH 值调至7.5，经弱碱性阴离子交换树脂分离，收集洗脱液，减压浓缩结晶，过滤，干燥获得9.03 g D-谷氨酰胺，达到D-谷氨酰胺理论收率的95%。

实施例三

1、制备N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸：在圆底烧瓶内，分别加入43.8g DL-谷氨酸和52.91g邻苯二甲酸酐，在200℃温度下，油浴10分钟，待反应液自然冷却，析出晶体，干燥获得74.28 g N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸，收率90%。

2、制备N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸酐：将所得N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸在100 mL醋酸酐中回流40分钟，自然冷却，析出晶体，过滤，结晶用乙酸乙酯洗涤，干燥65.98 g N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸酐，收率95%。

3、制备N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酰胺：将所得N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸酐与150 mL浓度为4 mol/L的氨水溶液在室温下搅拌反应20分钟，之后加入浓度为6 mol/L的盐酸酸化至pH值为3，静置析出晶体，过滤，干燥获得得59.76 g N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酰胺，收率为85%。

4、制备DL-谷氨酰胺：将所得N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酰胺加到浓度为2mol/L的水合肼溶液中，室温放置12小时，反应液用浓度为6 mol/L的盐酸酸化至pH值为3，过滤除去析出的邻苯二甲酰肼，滤液减压浓缩析出DL-谷氨酰胺，精制、干燥得29.41 g白色针状晶体DL-谷氨酰胺，产率93%。DL-谷氨酰胺总收率67.6%。

5、培养制备氨肽酶：将具有氨肽酶活性的菌株在培养基中培养，产生高活性的氨肽酶，培养基中碳源为麦芽糖和乳糖，总碳源质量浓度为8 g/L，培养基中氮源为牛肉膏和豆饼水解液，总氮源质量浓度为15 g/L。

6、氨肽酶拆分DL-谷氨酰胺：将步骤4产生的DL-谷氨酰胺29 g溶于500 mL水中，用浓度为3 mol/L的碳酸钠缓冲液控制反应液的pH为8，加入氨肽酶菌体细胞8g、0.1 g/LTriton X-100，在30℃的温度下，反应20小时。

7、分离制备D-谷氨酰胺：4000-6000 r/min 离心1-20分钟，去除氨肽酶菌体细胞，上清液升温至50-80℃活性炭脱色20-30分钟，抽滤，滤液浓缩后用浓度为6 mol/L的盐酸将pH值调节至3.2，析出固体，过滤，干燥得12.12 g L-谷氨酸，收率83%；剩余母液稀释后将pH值调节至7.5，经弱碱性阴离子交换树脂分离，收集洗脱液，减压浓缩结晶，过滤，干燥获得13.78 g D-谷氨酰胺，达到D-谷氨酰胺理论收率的95%。

实施例四

1、制备N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸：在圆底烧瓶内，分别加入58.4 g DL-谷氨酸和64.66g邻苯二甲酸酐，在150℃的温度下，油浴30分钟，待反应液自然冷却，析出晶体，干燥获得100.14 g N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸，收率91%。

2、制备N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸酐：将所得N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸在150 mL醋酸酐中回流50分钟，自然冷却，析出晶体，过滤，结晶用乙酸乙酯洗涤，干燥获得88.96 g N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸酐，收率95%。

3、制备N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酰胺：将所得N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸酐与200 mL浓度为3 mol/L的氨水溶液在室温下搅拌反应30分钟，之后加入浓度为6 mol/L 的盐酸酸化至pH值为3，静置析出晶体，过滤，干燥获得80.57 g N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酰胺，收率85%。

4、制备DL-谷氨酰胺：将所得N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酰胺加到浓度为1.5 mol/L的水合肼溶液中，室温放置22小时，反应液用浓度为6 mol/L的盐酸酸化至pH值为3，过滤除去析出的邻苯二甲酰肼，滤液减压浓缩析出DL-谷氨酰胺，精制、干燥得38.8 g白色针状晶体DL-谷氨酰胺，收率91%。DL-谷氨酰胺总收率66.8%。

5、培养制备氨肽酶：将具有氨肽酶活性的菌株在培养基中培养，产生高活性的氨肽酶，培养基中碳源为葡萄糖、麦芽糖和乳糖，总碳源质量浓度为20 g/L，培养基中氮源为酵母膏和蛋白胨，总氮源质量浓度为1 g/L。

6、氨肽酶拆分DL-谷氨酰胺：将步骤4产生的DL-谷氨酰胺38g溶于500 mL 水中，用浓度为3 mol/L的碳酸钠缓冲液控制反应液的pH为8，加入氨肽酶菌体细胞10g，0.1 g/LTween 80，在30℃的温度下，反应18小时。

7、分离制备D-谷氨酰胺：4000-6000 r/min 离心10-20分钟，去除氨肽酶菌体细胞，上清液升温至50-80℃活性炭脱色20-30分钟，抽滤，滤液用浓度为6 mol/L的盐酸将pH值调节至3.2，析出固体，过滤，干燥得16.07 g L-谷氨酸，收率84%。剩余母液稀释后调节pH至至7.5，经弱碱性阴离子交换树脂分离，收集洗脱液，减压浓缩结晶，过滤，干燥得17.86 gD-谷氨酰胺，达到D-谷氨酰胺理论收率的94%。

实施例五

1、制备N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸：在圆底烧瓶内，分别加入73 g DL-谷氨酸和74 g邻苯二甲酸酐，在165℃的温度下，油浴40分钟，待反应液自然冷却，析出晶体，干燥获得108.8g N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸，收率94%。

2、制备N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸酐：将所得N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸在160 mL醋酸酐中回流60分钟，自然冷却，析出晶体，过滤，结晶用乙酸乙酯洗涤，干燥获得108.8 g N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸酐，收率94%。

3、制备N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酰胺：将所得N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸酐与200 mL浓度为2 mol/L的氨水在室温下搅拌反应60分钟，之后加入浓度为6 mol/L的盐酸酸化至pH值为3，静置析出晶体，过滤，干燥得96.23 g N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酰胺，收率83%。

4、制备DL-谷氨酰胺：将所得N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酰胺加到浓度为2mol/L的水合肼溶液中，室温放置26小时，反应液用浓度为6 mol/L的盐酸酸化至pH值为3，过滤除去析出的邻苯二甲酰肼，滤液减压浓缩析出DL-谷氨酰胺，精制、干燥得47.86 g白色针状晶体DL-谷氨酰胺，收率94%。DL-谷氨酰胺总收率66%。

5、培养制备氨肽酶：将具有氨肽酶活性的菌株在培养基中培养，产生高活性的氨肽酶，培养基中碳源为麦芽糖、蔗糖和乳糖，总碳源质量浓度为15 g/L，培养基中氮源为玉米浆和豆饼水解液，总氮源质量浓度为10 g/L。

6、氨肽酶拆分DL-谷氨酰胺：将步骤4产生的DL-谷氨酰胺47g溶于500 mL水中，用浓度为3 mol/L的碳酸钠缓冲液控制反应液的pH为9，加入氨肽酶菌体细胞15g、0.1 g/LTriton X-100，在35℃的温度下，反应28小时。

7、分离制备D-谷氨酰胺：4000-6000 r/min 离心10-20分钟，去除氨肽酶菌体细胞，上清液升温至50-80℃，活性炭脱色20-30分钟，抽滤，滤液用浓度为6 mol/L的盐酸将pH值调节至3.2，析出固体，过滤，干燥得19.87 g L-谷氨酸，收率84%。剩余母液稀释后将pH值调节至7.5，经弱碱性阴离子交换树脂分离，收集洗脱液，减压浓缩结晶，过滤，干燥得22.32g D-谷氨酰胺，达到D-谷氨酰胺理论收率的95%。

实施例六

1、制备N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸：在圆底烧瓶内，分别加入87.6 g DL-谷氨酸和88.8g邻苯二甲酸酐，在190℃的温度下，油浴40分钟，待反应液自然冷却，析出晶体，干燥获得148.56 g N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸，收率90%。

2、制备N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸酐：将所得N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸在180 mL醋酸酐中回流60分钟，自然冷却，析出晶体，过滤，结晶用乙酸乙酯洗涤，干燥获得131.96 gN-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸酐，收率95%。

3、制备N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酰胺：将所得N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸酐与250 mL浓度为2.5 mol/L的氨水溶液在室温下搅拌反应50分钟，之后加入浓度为6 mol/L的盐酸酸化至pH值为3，静置析出晶体，过滤，干燥获得118.12 g N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酰胺，收率84%。

4、制备DL-谷氨酰胺：将所得N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酰胺加到浓度为1 mol/L的水合肼溶液中，室温放置40小时，反应液用浓度为6 mol/L的盐酸酸化至pH值为3，过滤除去析出的邻苯二甲酰肼，滤液减压浓缩析出DL-谷氨酰胺，精制、干燥获得58.75 g白色针状晶体DL-谷氨酰胺，收率94%。DL-谷氨酰胺总收率67.5%。

5、培养制备氨肽酶：将具有氨肽酶活性的菌株在培养基中培养，产生高活性的氨肽酶，培养基中碳源为葡萄糖和乳糖，总碳源质量浓度为16 g/L，培养基中氮源为牛肉膏和蛋白胨，总氮源质量浓度为8 g/L。

6、氨肽酶拆分DL-谷氨酰胺：将步骤4产生的DL-谷氨酰胺50 g溶于500 mL水中，用浓度为3 mol/L的碳酸钠缓冲液控制反应液的pH为9，加入氨肽酶菌体细胞20g、0.08 g/LTween 80，在40℃的温度下，反应24小时。

7、分离制备D-谷氨酰胺：4000-6000 r/min 离心10-20分钟，去除氨肽酶菌体细胞，上清液升温至50-80℃，活性炭脱色20-30分钟，抽滤，滤液浓缩后用浓度为6 mol/L的盐酸将pH值调节至3.2，析出固体，过滤，干燥得21.14 g L-谷氨酸，收率84%。剩余母液稀释后调节pH值至7.5，经弱碱性阴离子交换树脂分离，收集洗脱液，减压浓缩结晶，过滤，干燥获得23.5 g D-谷氨酰胺，达到D-谷氨酰胺理论收率的94%。

实施例七

1、制备N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸：在圆底烧瓶内，分别加入29.2 g DL-谷氨酸和29.4g邻苯二甲酸酐，在150℃的温度下，油浴20分钟，待反应液自然冷却，析出晶体，干燥获得48.97 g N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸，收率89%。

2、制备N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸酐：将所得N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸在80 mL醋酸酐中回流25分钟，自然冷却，析出晶体，过滤，结晶用乙酸乙酯洗涤，干燥获得43.96 g N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸酐，收率96%。

3、制备N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酰胺：将所得N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酸酐与80 mL浓度为2 mol/L的氨水溶液在室温下搅拌反应50分钟，之后加入浓度为6 mol/L的盐酸酸化至pH值为3，静置析出晶体，过滤，干燥获得38.91 g N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酰胺，收率83%。

4、制备DL-谷氨酰胺：将所得N-邻苯二甲酰-DL-谷氨酰胺加到浓度为1mol/L水合肼溶液中，室温放置20小时，反应液用浓度为6 mol/L盐酸酸化至pH值为3，过滤除去析出的邻苯二甲酰肼，滤液减压浓缩析出DL-谷氨酰胺，精制、干燥获得19.56 g白色针状晶体DL-谷氨酰胺，收率95%。DL-谷氨酰胺总收率67.3%。

5、培养制备氨肽酶：将具有氨肽酶活性的菌株在培养基中培养，产生高活性的氨肽酶，培养基中碳源为葡萄糖和乳糖，总碳源质量浓度为5 g/L，培养基中氮源为牛肉膏和酵母膏，总氮源质量浓度为10 g/L。

6、氨肽酶拆分DL-谷氨酰胺：将步骤4产生的DL-谷氨酰胺19g溶于500 mL水中，用浓度为3 mol/L的碳酸钠缓冲液控制反应液的pH值为10，加入由10 g氨肽酶菌体细胞制备的粗酶液50 mL、0.05 g/L Tween 80，在45℃的温度下，反应12小时。

7、分离制备D-谷氨酰胺：8000~12000 r/min离心10~20分钟，去除菌体蛋白，上清液升温至50-80℃，活性炭脱色20-30分钟，抽滤，滤液用浓度为6 mol/L的盐酸将pH值调节至3.2，析出固体，过滤，干燥得7.94 g L-谷氨酸，收率83%。剩余母液稀释后调节pH值至7.5，经弱碱性阴离子交换树脂分离，收集洗脱液，减压浓缩结晶，过滤，干燥获得8.93 g D-谷氨酰胺，达到D-谷氨酰胺理论收率的94%。

实例检测结果

D-谷氨酰胺产品检测：

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有组分、掺量及工艺步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。本说明书（包括权利要求、摘要）中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。

以上所述仅是本发明的非限定实施方式，还可以衍生出大量的实施例，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思和不作出创造性劳动的前提下，还可以做出若干变形和改进的实施例，这些都属于本发明的保护范围。