手性稠环四氢异喹啉类生物碱及其类似物的合成方法
阅读说明：本技术 手性稠环四氢异喹啉类生物碱及其类似物的合成方法 (Synthesis method of chiral fused ring tetrahydroisoquinoline alkaloid and analogue thereof ) 是由 姚培圆 杨林松 李键煚 徐泽菲 陈曦 冯进辉 吴洽庆 朱敦明 于 2021-04-15 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种亚胺还原酶及其在不对称还原制备光学纯手性稠环四氢异喹啉类化合物的应用,具体地,所述亚胺还原酶是来源于Myxococcus fulvus的氧化还原酶。所述的亚胺还原酶在温和的反应条件下实现10-500mM稠环二氢异喹啉类底物的手性还原。本发明提供的亚胺还原酶底物谱宽,且对稠环二氢异喹啉具有较高的活性。(The invention provides an imine reductase and application thereof in preparing an optical pure chiral fused ring tetrahydroisoquinoline compound through asymmetric reduction, and particularly relates to the imine reductase which is oxidoreductase derived from Myxococcus fulvus. The imine reductase realizes chiral reduction of 10-500mM condensed ring dihydroisoquinoline substrate under mild reaction condition. The imine reductase substrate provided by the invention has wide spectrum and has higher activity on condensed ring dihydroisoquinoline.)
技术领域
本发明涉及一类稠环四氢异喹啉类生物碱及其类似物合成的新方法，属于生物化工领域。具体涉及酶催化不对称还原制备光学纯手性稠环四氢异喹啉类化合物的新方法。
背景技术
四氢异喹啉类生物碱在自然界中分布广泛,是重要的手性胺类化合物，以四氢异喹啉为结构母核的生物碱具有抗肿瘤、抗病原微生物、抗炎症及中枢神经系统调节等生物活性(Le V H,Inai M,Williams R M,et al.Ecteinascidins.A review of thechemistry,biology and clinical utility of potent tetrahydroisoquinolineantitumor antibiotics[J].Natural Product Reports,2015,32(2):328-347；Johnson JL,Nair D S,Pillai S M,et al.Dissymmetry Factor Spectral Analysis Can ProvideUseful Diastereomer Discrimination:Chiral Molecular Structure of an Analogueof(-)-Crispine A[J].ACS Omega,2019,4(4):6154-6164；Liu C J,Liu D Y,XiangL.Bioactivity diversity and functional mechanism of tetrahydroisoquinolinealkaloids[J].Acta Pharmaceutica Sinica,2010,45(1):9-16)某些四氢异喹啉类生物碱如盐酸小檗碱、延胡索乙素等已经在临床上广泛应用(Li Y,Yu S,Wu X,et al.IronCatalyzed Asymmetric Hydrogenation of Ketones[J].Journal of the AmericanChemical Society,2014,136(10):4031-4039；Larson R T,Pemberton R P,Franke J M,et al.Total Synthesis of the Galbulimima Alkaloids Himandravine and GB17Using Biomimetic Diels-Alder Reactions of Double Diene Precursors[J].Journalof the American Chemical Society,2015,137(34):11197-11204；Lane J W,Chen Y,Williams R M.Asymmetric Total Syntheses of(-)-Jorumycin,(-)-Renieramycin G,3-epi-Jorumycin,and 3-epi-Renieramycin G[J].Journal of the American ChemicalSociety,2005,127(36):12684-12690)。因其特殊的结构和展现出的多种生物学活性，四氢异喹啉类生物碱及其类似物越来越受到人们的重视。
目前合成四氢异喹啉及其类似物的方法主要分为两大类-化学法和酶法合成。化学合成四氢异喹啉及其类似物的方法主要分为手性拆分法、手性诱导合成法、金属催化不对称合成法(Luk L Y P,Bunn S,Liscombe D K,et al.Mechanistic Studies onNorcoclaurine Synthase of Benzylisoquinoline Alkaloid Biosynthesis:AnEnzymatic Pictet-Spengler Reaction[J].Biochemistry,2007,46(35):10153-10161；Benedetti S,Bucciarelli S,Canestrari F,et al.Platelet's Fatty Acids andDifferential Diagnosis of Major Depression and Bipolar Disorder through theUse of an Unsupervised Competitive-Learning Network Algorithm(SOM)[J].OpenJournal of Depression,2014,03(2):52-73；Lee S C,Choi S Y,Chung Y K,etal.Preparation of pilot library with tetrahydro-β-carboline alkaloid coreskeleton using tandem intramolecular Pictet–Spengler cyclization[J].Tetrahedron Letters,2006,47(38):6843-6847)。但从大多数的文献报道来看，现有的化学合成四氢异喹啉类生物碱的方法存在反应步骤繁琐、反应条件苛刻、需要使用昂贵的过渡金属催化剂、产物立体选择性有待提升等问题，影响了其在工业规模上的应用(Rao R N,Maiti B,Chanda K.Application of Pictet–Spengler Reaction to Indole-BasedAlkaloids Containing Tetrahydro-β-carboline Scaffold in CombinatorialChemistry[J].Acs Combinatorial Science,2017,19(4):199-228；Marti C,CarreiraE.Construction of Spiro[pyrrolidine-3,3′-oxindoles]Recent Applications to theSynthesis of Oxindole Alkaloids[J].Ruropean Journal of Organic Chemistry,2003,2003(12):2209-2219；Chrzanowska M,Rozwadowska M D.Asymmetric Synthesis ofIsoquinoline Alkaloids[J].Chemical Reviews,2004,104(7):3341-3370；-Xavier Felpin,Lebreton J.Recent Advances in the Total Synthesis of Piperidineand Pyrrolidine Natural Alkaloids with Ring-Closing Metathesis as a Key Step(p 3693-3712)[J].European Journal of Organic Chemistry,2003,2003(19):3693-3712)。作为另一种选择，一些学者研究了酶法合成四氢异喹啉类生物碱及其类似物。目前报道的生物催化合成四氢异喹啉类生物碱的方法主要是利用NCS酶进行催化Pictee-Spengler反应，即催化β-芳基乙胺与醛或酮之间的分子间环化反应，但大多合成的是只具有两个环的四氢异喹啉母核。2018年Helen C.Hailes课题组利用NCS酶不对称合成三环的金莲花碱及其类似物，但是该种方法的选择性有待提升。Turner课题组利用单胺氧化酶实现了生物催化合成(R)-Harmicine，但该种方法需要使用大量的还原剂。Qu等人利用亚胺还原酶不对称合成了四氢异喹啉及类似物，但他们的工作同样只能合成具有两个环的四氢异喹啉母核。
发明内容
本发明提供了一种亚胺还原酶催化不对称合成手性稠环四氢异喹啉类化合物的新方法，该方法具有工艺路线简单、反应条件温和、得率高、污染少等显著特点。
本发明所述的亚胺还原酶的氨基酸序列为IRED1(SEQ ID NO：1)，且所述的亚胺还原酶具有将稠环二氢异喹啉类化合物转化为稠环四氢异喹啉类化合物的能力。所述亚胺还原酶来源于Myxococcus fulvus。
本发明所述的产亚胺还原酶的基因工程菌所用的载体为pET系列质粒。
用于制备光学纯四氢异喹啉类化合物的亚胺还原酶是通过将培养基离心之后得到的菌体细胞或其加工制品。其中加工制品指的是菌体得到的提取物、破碎液或者是对提取物亚胺还原酶进行的分离和/或纯化得到的分离产品。在本发明中使用最多的是将培养基离心之后得到的菌体细胞。
本发明还涉及用全细胞催化不同取代基的稠环二氢异喹啉类底物转化生成对应的手性稠环四氢异喹啉类化合物的方法，所述方法为：
将所述亚胺还原酶的基因工程菌分别培养一定时间后，加入诱导剂IPTG培养一段时间，离心收集菌体。用缓冲溶液重悬菌体，向其中加入10-500mM稠环二氢异喹啉类底物(溶于10％DMSO)，10-50g/L的湿菌体，并且加入4-50U/mL GDH，30-1000mM葡萄糖，0.5mg/mLNADP+，25℃，200rpm反应10-24h。反应之后，离心去除蛋白，乙酸乙酯萃取上清液，除去有机溶剂之后利用硅胶柱层析纯化产物。
附图说明
图1-12：产物核磁氢谱
具体实施方式
以下通过具体的实施例来进一步说明，其目的在于更好的理解发明内容，但是这些实施例不构成对本发明的限制。
实施例1：基因工程菌的构建和培养
产亚胺还原酶的基因工程菌的具体构建和培养方法是：将来源于Myxococcusfulvus的氨基酸序列SEQ ID NO：1进行基因合成，构建到pET系列载体中，在宿主菌大肠杆菌中进行异源表达。将-80℃保存的菌种解冻，在平板上划线，放在37℃恒温培养箱中过夜培养。挑选平板上单菌落接种到20mL含相应抗生素的LB培养基中，培养12h左右作为种子液，按照1％的接种量接种到700mL含相应抗生素的LB培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养至OD600＝0.6-0.8左右，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG于25℃进行诱导12h，以6000rpm离心收集菌体。
实施例2：IRED1催化8,9-二甲氧基-2,3,5,6-四氢-1H-吡咯并[2,1-a]异喹啉-4-氯化铵制备光学纯(R)-8,9-二甲氧基-1,2,3,5,6,10b-六氢吡咯并[2,1-a]异喹啉
将10mM 8,9-二甲氧基-2,3,5,6-四氢-1H-吡咯并[2,1-a]异喹啉-4-氯化铵(溶于10％DMSO)，30mM葡萄糖，4U/mL GDH，0.5mg/mL NADP+，2.50g IRED1基因工程菌，缓冲液为pH 7.5的磷酸盐缓冲液100mL，25℃、220rpm反应10h。反应结束后离心去除蛋白质，用乙酸乙酯萃取上清液，薄层层析色谱确认萃取完全。将有机溶剂旋蒸去除得到粗品，利用气相检测底物转化率和产物得率，液相HPLC检测产物的ee值为99％。转化率为87.5％，收率为68.1％，产物构型为(R)。
实施例3：IRED1催化9,10-二甲氧基-1,2,3,4,6,7-六氢吡啶并[2,1-a]异喹啉-5-氯化铵制备光学纯(R)-9,10-二甲氧基-2,3,4,6,7,11b-六氢-1H-吡啶并[2,1-a]异喹啉
将30mM 9,10-二甲氧基-1,2,3,4,6,7-六氢吡啶并[2,1-a]异喹啉-5-氯化铵(溶于10％DMSO)，90mM葡萄糖，12U/mL GDH，0.5mg/mL NADP+，2.50g IRED1基因工程菌，缓冲液为pH 7.5的磷酸盐缓冲液100mL，25℃、220rpm反应10h。反应结束后离心去除蛋白质，用乙酸乙酯萃取上清液，薄层层析色谱确认萃取完全。将有机溶剂旋蒸去除得到粗品，利用气相检测底物转化率和产物得率，液相HPLC检测产物的ee值为99％。转化率为83.3％，收率为74.1％，产物构型为(R)。
实施例4：IRED1催化2,3,5,6-四氢-1H-[1,3]二氧戊环[4,5-g]吡咯并[2,1-a]异喹啉-4-氯化铵制备光学纯(R)-1,2,3,5,6,11b-六氢-[1,3]二氧戊环[4,5-g]吡咯并[2,1-a]异喹啉
将100mM 2,3,5,6-四氢-1H-[1,3]二氧戊环[4,5-g]吡咯并[2,1-a]异喹啉-4-氯化铵(溶于10％DMF)，300mM葡萄糖，20U/mL GDH，0.5mg/mL NADP+，4.5g IRED1基因工程菌，缓冲液为pH 7.5的磷酸盐缓冲液100mL，25℃、220rpm反应10h。反应结束后离心去除蛋白质，用乙酸乙酯萃取上清液，薄层层析色谱确认萃取完全。将有机溶剂旋蒸去除得到粗品，利用气相检测底物转化率和产物得率，液相HPLC检测产物的ee值为99％。转化率为96.5％，收率为85.1％，产物构型为(R)。
实施例5：IRED1催化1,2,3,4,6,7-六氢-[1,3]二氧戊环[4,5-g]吡啶并[2,1-a]异喹啉-5-氯化铵制备光学纯(R)-2,3,4,6,7,12b-六氢-1H-[1,3]二氧戊环[4,5-g]吡咯并[2,1-a]异喹啉
将200mM 1,2,3,4,6,7-六氢-[1,3]二氧戊环[4,5-g]吡啶并[2,1-a]异喹啉-5-氯化铵(溶于10％DMF)，600mM葡萄糖，40U/mL GDH，0.5mg/mL NADP+，12g IRED1基因工程菌，缓冲液为pH 7.5的磷酸盐缓冲液100mL，25℃、220rpm反应18h。反应结束后离心去除蛋白质，用乙酸乙酯萃取上清液，薄层层析色谱确认萃取完全。将有机溶剂旋蒸去除得到粗品，利用气相检测底物转化率和产物得率，液相HPLC检测产物的ee值为99％。转化率为88.1％，收率为72.2％，产物构型为(R)。
实施例6：IRED1催化1,2,3,5,6,11-六氢吲哚嗪并[8,7-b]吲哚-4-氯化铵制备光学纯(R)-2,3,5,6,11,11b-六氢-1H-吲哚嗪并[8,7-b]吲哚
将500mM 1,2,3,5,6,11-六氢吲哚嗪并[8,7-b]吲哚-4-氯化铵(溶于10％DMSO)，1M葡萄糖，50U/mL GDH，0.5mg/mL NADP+，20g IRED2基因工程菌，缓冲液为pH7.5的磷酸盐缓冲液100mL，25℃、220rpm反应16h。反应结束后离心去除蛋白质，用乙酸乙酯萃取上清液，薄层层析色谱确认萃取完全。将有机溶剂旋蒸去除得到粗品，利用气相检测底物转化率和产物得率，液相HPLC检测产物的ee值为99％。转化率为81.7％，收率为67.5％，产物构型为(R)。
实施例7：IRED1催化2,3,4,6,7,12-六氢-1H-吲哚并[2,3-a]喹嗪-5-氯化铵制备光学纯(R)-1,2,3,4,6,7,12,12b-八氢吲哚并[2,3-a]喹嗪
将200mM 2,3,4,6,7,12-六氢-1H-吲哚并[2,3-a]喹嗪-5-氯化铵(溶于10％DMSO)，600mM葡萄糖，30U/mL GDH，0.5mg/mL NADP+，10g IRED1基因工程菌，缓冲液为pH7.5的磷酸盐缓冲液100mL，25℃、220rpm反应10h。反应结束后离心去除蛋白质，用乙酸乙酯萃取上清液，薄层层析色谱确认萃取完全。将有机溶剂旋蒸去除得到粗品，利用气相检测底物转化率和产物得率，液相HPLC检测产物的ee值为99％。转化率为97.1％，收率为59.3％，产物构型为(R)。
实施例8：IRED1催化8-甲氧基-1,2,3,5,6,11-六氢吲哚嗪并[8,7-b]吲哚-4-氯化铵制备光学纯(R)-8-甲氧基-2,3,5,6,11,11b-六氢-1H-吲哚嗪并[8,7-b]吲哚
将200mM 8-甲氧基-1,2,3,5,6,11-六氢吲哚嗪并[8,7-b]吲哚-4-氯化铵(溶于10％DMSO)，600mM葡萄糖，20U/mL GDH，0.5mg/mL NADP+，11g IRED1基因工程菌，缓冲液为pH 7.5的磷酸盐缓冲液100mL，25℃、220rpm反应10h。反应结束后离心去除蛋白质，用乙酸乙酯萃取上清液，薄层层析色谱确认萃取完全。将有机溶剂旋蒸去除得到粗品，利用气相检测底物转化率和产物得率，液相HPLC检测产物的ee值为99％。转化率为79.7％，收率为56.1％，产物构型为(R)。
实施例9：IRED1催化9-甲氧基-2,3,4,6,7,12-六氢-1H-吲哚并[2,3-a]喹嗪-5-氯化铵制备光学纯(R)-9-甲氧基-1,2,3,4,6,7,12,12b-八氢吲哚并[2,3-a]喹嗪
将300mM 9-甲氧基-2,3,4,6,7,12-六氢-1H-吲哚并[2,3-a]喹嗪-5-氯化铵(溶于10％DMSO)，700mM葡萄糖，4U/mL GDH，0.5mg/mL NADP+，12g IRED1基因工程菌，缓冲液为pH7.5的磷酸盐缓冲液IRED1，25℃、220rpm反应16h。反应结束后离心去除蛋白质，用乙酸乙酯萃取上清液，薄层层析色谱确认萃取完全。将有机溶剂旋蒸去除得到粗品，利用气相检测底物转化率和产物得率，液相HPLC检测产物的ee值为99％。转化率为75.2％，收率为46.9％，产物构型为(R)。
实施例10：IRED1催化8-氯-1,2,3,5,6,11-六氢吲哚嗪并[8,7-b]吲哚-4-氯化铵制备光学纯(R)-8-氯-2,3,5,6,11,11b-六氢-1H-吲哚嗪并[8,7-b]吲哚
将150mM 8-氯-1,2,3,5,6,11-六氢吲哚嗪并[8,7-b]吲哚-4-氯化铵(溶于10％DMSO)，350mM葡萄糖，10U/mL GDH，0.5mg/mL NADP+，7.50g IRED1基因工程菌，缓冲液为pH7.5的磷酸盐缓冲液，25℃、220rpm反应10h。反应结束后离心去除蛋白质，用乙酸乙酯萃取上清液，薄层层析色谱确认萃取完全。将有机溶剂旋蒸去除得到粗品，利用气相检测底物转化率和产物得率，液相HPLC检测产物的ee值为99％。转化率为88.5％，得率为66.3％，收物构型为(R)。
实施例11：IRED1催化9-氯-2,3,4,6,7,12-六氢-1H-吲哚并[2,3-a]喹嗪-5-氯化铵制备光学纯(R)-9-氯-1,2,3,4,6,7,12,12b-八氢吲哚并[2,3-a]喹嗪
将100mM 9-氯-2,3,4,6,7,12-六氢-1H-吲哚并[2,3-a]喹嗪-5-氯化铵(溶于10％DMSO)，300mM葡萄糖，20U/mL GDH，0.5mg/mL NADP+，7.5g IRED1基因工程菌，缓冲液为pH7.5的磷酸盐缓冲液，25℃、220rpm反应10h。反应结束后离心去除蛋白质，用乙酸乙酯萃取上清液，薄层层析色谱确认萃取完全。将有机溶剂旋蒸去除得到粗品，利用气相检测底物转化率和产物得率，液相HPLC检测产物的ee值为99％。转化率为81.6％，得率为55.7％，收物构型为(R)。
实施例12：IRED2催化8-甲基1,2,3,5,6,11-六氢吲哚嗪并[8,7-b]吲哚-4-氯化铵制备光学纯(R)-8-甲基-2,3,5,6,11,11b-六氢-1H-吲哚嗪并[8,7-b]吲哚
将250mM 8-甲基1,2,3,5,6,11-六氢吲哚嗪并[8,7-b]吲哚-4-氯化铵(溶于10％DMSO)，750mM葡萄糖，30U/mL GDH，0.5mg/mL NADP+，10g IRED2基因工程菌，缓冲液为pH7.5的磷酸盐缓冲液，25℃、220rpm反应20h。反应结束后离心去除蛋白质，用乙酸乙酯萃取上清液，薄层层析色谱确认萃取完全。将有机溶剂旋蒸去除得到粗品，利用气相检测底物转化率和产物得率，液相HPLC检测产物的ee值为99％。转化率为78.4％，收率为63.1％，产物构型为(R)。
实施例13：IRED1催化9-甲基-2,3,4,6,7,12-六氢-1H-吲哚并[2,3-a]喹嗪-5-氯化铵制备光学纯(R)-9-甲基-1,2,3,4,6,7,12,12b-八氢吲哚并[2,3-a]喹嗪
将10mM 9-甲基-2,3,4,6,7,12-六氢-1H-吲哚并[2,3-a]喹嗪-5-氯化铵(溶于10％DMSO)，30mM葡萄糖，4U/mL GDH，0.5mg/mL NADP+，2.5g IRED1基因工程菌，缓冲液为pH7.5的磷酸盐缓冲液，25℃、220rpm反应10h。反应结束后离心去除蛋白质，用乙酸乙酯萃取上清液，薄层层析色谱确认萃取完全。将有机溶剂旋蒸去除得到粗品，利用气相检测底物转化率和产物得率，液相HPLC检测产物的ee值为99％。转化率为86.1％，收率为68.5％，产物构型为(R)。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 手性稠环四氢异喹啉类生物碱及其类似物的合成方法
<130> 氨基酸序列
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 291
<212> PRT
<213> Myxococcus fulvus
<400> 1
Met Lys Pro His Ile Ser Ile Leu Gly Ala Gly Arg Met Gly Ser Ala
1 5 10 15
Leu Val Lys Ala Phe Leu Gln Asn Glu Tyr Thr Thr Thr Val Trp Asn
20 25 30
Arg Thr Arg Ala Arg Cys Glu Pro Leu Ala Ala Ala Gly Ala Arg Ile
35 40 45
Ala Asp Ser Val Arg Asp Ala Val Gln Thr Ala Ser Val Val Ile Val
50 55 60
Asn Val Asn Asp Tyr Asp Thr Ser Asp Ala Leu Leu Arg Gln Asp Glu
65 70 75 80
Val Thr Gln Glu Leu Arg Gly Lys Val Leu Val Gln Leu Thr Ser Gly
85 90 95
Ser Pro Lys Leu Ala Arg Glu Gln Ala Thr Trp Ala Arg Arg His Gly
100 105 110
Ile Asp Tyr Leu Asp Gly Ala Ile Met Ala Thr Pro Asp Leu Ile Gly
115 120 125
Arg Pro Asp Cys Thr Leu Leu Tyr Ala Gly Pro Lys Ala Leu Tyr Asp
130 135 140
Lys His Gln Ala Val Leu Ala Ala Leu Gly Gly Asn Thr Gln His Val
145 150 155 160
Ser Glu Asp Glu Gly His Ala Ser Ala Leu Asp Ser Ala Ile Leu Phe
165 170 175
Gln Leu Trp Gly Ser Leu Phe Ser Gly Leu Gln Ala Ala Ala Ile Cys
180 185 190
Arg Ala Glu Gly Ile Ala Leu Asp Ala Leu Gly Pro His Leu Glu Ala
195 200 205
Val Ala Ala Met Ile Gln Phe Ser Met Lys Asp Leu Leu Gln Arg Ile
210 215 220
Gln Lys Glu Gln Phe Gly Ala Asp Thr Glu Ser Pro Ala Thr Leu Asp
225 230 235 240
Thr His Asn Val Ala Phe Gln His Leu Leu His Leu Cys Glu Glu Arg
245 250 255
Asn Ile His Arg Ala Leu Pro Glu Ala Met Asp Ala Leu Ile Gln Thr
260 265 270
Ala Arg Lys Ala Gly His Gly Gln Asp Asp Phe Ser Val Leu Ala Arg
275 280 285
Phe Leu Arg
290