阅读说明：本技术 一种d-泛解酸的制备方法 (Preparation method of D-pantoic acid ) 是由 陈本顺 江涛 何伟 杨涛 于 2020-06-19 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种D-泛解酸的制备方法,具体涉及药物化学技术领域,以化合物II(3-羟基-4,4-二甲基二氢呋喃-2-酮)为原料,在臭氧的作用下发生氧化反应得到化合物III(4,4-二甲基二氢呋喃-2,3-二酮),随后发生水解反应,并在酮还原酶的作用下发生不对称还原得到含有化合物I((R)-2,4-二羟基-3,3-二甲基丁酸)的混旋粗品,含有化合物I的混旋粗品重结晶步骤后得到高纯度的D-泛解酸。本方法合成步骤少,反应条件温和,工艺稳定性高,产物对映体过量值达99%以上,具有广阔的市场前景,更易于化合物I的工业化生产。(The invention provides a preparation method of D-pantoic acid, and particularly relates to the technical field of pharmaceutical chemistry, wherein a compound II (3-hydroxy-4, 4-dimethyldihydrofuran-2-ketone) is used as a raw material, an oxidation reaction is carried out under the action of ozone to obtain a compound III (4, 4-dimethyldihydrofuran-2, 3-dione), a hydrolysis reaction is carried out subsequently, asymmetric reduction is carried out under the action of ketoreductase to obtain a racemic crude product containing a compound I ((R) -2, 4-dihydroxy-3, 3-dimethylbutyric acid), and the racemic crude product containing the compound I is recrystallized to obtain high-purity D-pantoic acid. The method has the advantages of few synthesis steps, mild reaction conditions, high process stability, over 99 percent of enantiomeric excess value of the product, wide market prospect and easy industrial production of the compound I.)

一种D-泛解酸的制备方法

技术领域

本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种D-泛解酸的制备方法。

背景技术

泛酸是一种B族维生素(维生素B5)，是辅酶A(CoA)和酰基载体蛋白(ACP)生物合成的关键前体。CoA和ACP都是细胞生长必不可少的辅助因子，并且在关键的生物合成途径中参与许多代谢反应。微生物和植物都可合成泛酸，而哺乳动物则必须从饮食中获取泛酸。因此，通过简便有效方法合成D-泛解酸是很有必要的。

有相关文献(Si D,Urano N,Nozaki S,et al.l-Pantoyl lactonedehydrogenase fromRhodococcus erythropolis:genetic analyses and applicationto the stereospecific oxidation ofl-pantoyl lactone[J].Applied Microbiologyand Biotechnology,2012,95(2):431-440.)报道了以3-羟基-4,4-二甲基二氢呋喃-2-酮为原料合成D-泛解酸，具体路线如下：

该路线涉及LPLDH脱氢酶生成4,4-二甲基二氢呋喃-2,3-二酮，随后发生水解反应，最后在KPA还原酶的作用下生成D-泛解酸。该路线的水解步骤不能实现从化合物III(4,4-二甲基二氢呋喃-2,3-二酮)到化合物I((R)-2,4-二羟基-3,3-二甲基丁酸)的直接合成，且反应的底物消耗量大，成本高，极大的限制了化合物I工业化生产。

另外，通过查阅文献，发现目前并无相关报道实现化合物III(4,4-二甲基二氢呋喃-2,3-二酮)到化合物I((R)-2,4-二羟基-3,3-二甲基丁酸)一步合成即直接由化合物III合成化合物I。鉴于D-泛解酸是一种重要的维生素，以及在生物合成应用中的必要性，因此开发一种更为经济，且更利于工业化生产的新型方案路线是十分必要的，所以我们发展了一类从4,4-二甲基二氢呋喃-2,3-二酮通过一步反应制备目标产物D-泛解酸的路线。

从上述文献可知化合物III(4,4-二甲基二氢呋喃-2,3-二酮)是制备D-泛解酸的重要中间体。日本专利JP05306276提供了一种化合物III制备路线，方法如下：

上述路线以3-羟基-4,4-二甲基二氢呋喃-2(3H)为原料，DMSO为溶剂，Cl(O＝)CC(＝O)Cl为氧化剂合成4,4-二甲基二氢呋喃-2,3-二酮化合物，该反应涉及有毒试剂的使用，且反应条件在零下60℃进行，显然该方案不是理想的氧化方法。同样的，chang等人(Chang H S,Woo J C,Lee K M,et al.FACILE SYNTHESIS OFα-KETOCARBONYL COMPOUNDSFROMα-HYDROXYCARBONYL COMPOUNDS[1][J].Synthetic Communications,2002,32(1):31-35)报道了以次溴酸钠与盐酸的作用下发生氧化反应得到目标产物(4,4-二甲基二氢呋喃-2,3-二酮)。该反应操作繁琐，后处理复杂。此外，该类反应的相关文献报道较早，随着有机合成的快速进展，一种新型的研究方法对于4,4-二甲基二氢呋喃-2,3-二酮化合物的合成很有必要，也就是说一种反应条件温和的合成4,4-二甲基二氢呋喃-2,3-二酮的方法是很有必要的，这有利于D-泛解酸的制备。

发明内容

为了解决现有技术中D-泛解酸制备条件不适当，合成路线操作复杂，成本较高等困难，本发明提供一种更为经济的D-泛解酸制备方法，通过实现化合物III(4,4-二甲基二氢呋喃-2,3-二酮)到化合物I((R)-2,4-二羟基-3,3-二甲基丁酸)一步合成的方案，不仅提高了底物的利用率，而且产物的对映体过量值能达到99％以上，大大降低了生产成本。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种D-泛解酸的制备方法，以化合物III(4,4-二甲基二氢呋喃-2,3-二酮)为原料，先水解反应，然后在酮还原酶的作用下，发生不对称还原反应，得到含有化合物I((R)-2,4-二羟基-3,3-二甲基丁酸)的混旋粗品，含有化合物I的混旋粗品重结晶步骤后得到高纯度的D-泛解酸((R)-2,4-二羟基-3,3-二甲基丁酸)，该反应的合成路线如下：

优选的，化合物III的合成方法是以化合物II(3-羟基-4,4-二甲基二氢呋喃-2-酮)为原料，在臭氧的作用下，发生氧化反应制得，具体的合成路线如下：

该路线反应条件温和，避免了污染性重金属以及有毒试剂的使用。

优选的，化合物III的合成的具体方法是以化合物II为原料，并加入溶剂A和碱，低温通入臭氧进行反应，GC(气相色谱)检测原料反应完全后，加入酸调节pH＝7，经萃取、抽滤、减压浓缩得到化合物III。

优选的，所用的碱为甲醇钠、叔丁醇钾、叔丁醇钠、氢氧化钾或氢氧化钠中的任意一种，优选氢氧化钠。所用的溶剂A包括乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醇、异丙醇或者四氢呋喃中的一种或者两种以上任意比例的混和物。

优选的，控温-10℃以下，随后通入O₃，溶剂A、碱和O₃的反应温度为-20℃～20℃。

优选的，化合物II、碱和O₃的摩尔比1：(1～5)：(1～5)。更优的是，化合物II与碱、臭氧的摩尔比为1：(1～3)：(1～3)。

优选的，具体步骤如下：

1)加入水解溶剂、化合物III和酮还原酶、NADP⁺、甲酸、葡萄糖脱氢酶进行反应，反应一段时间后，抽滤，滤液浓缩得到含有化合物I的混旋粗品；

2)在步骤1)获得的含有化合物I的混旋粗品中加入二氯甲烷溶解，并加入适量NaOH溶液调至pH＝5，干燥、减压除去二氯甲烷，在溶剂B下重结晶，得到高纯度的D-泛解酸。

优选的，在步骤1)中，反应温度10～30℃，反应时间为24h；化合物III与酮还原酶质量比为(10：1)～(20：1)。

优选的，在步骤1)中，化合物III与葡萄糖脱氢酶质量比为(10:1)～(50:1)。

优选的，在步骤1)中，化合物III与NADP+质量比为(50:1)～(200:1)

优选的，在步骤1)中，化合物III与甲酸摩尔比为(10:1)～(1:1)。

优选的，酮还原酶的DNA序列如SEQ ID No.1，氨基酸序列如SEQ ID No.2；葡萄糖脱氢酶的DNA序列如SEQ ID No.3。

优选的，步骤1)中的水解溶剂包括水解溶剂A和水解溶剂B，水解溶剂A包括硫酸、盐酸或者氢氧化钠中的一种；水解溶剂B包括乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醇、异丙醇或者四氢呋喃中的一种。

优选的，步骤2)中重结晶所用的溶剂为异丙醇和丙酮的混合物，异丙醇和丙酮的质量比为2：1。

本发明的有益效果：

1、本发明中，以4,4-二甲基二氢呋喃-2,3-二酮(化合物III)为原料，随后在酮还原酶的作用下进一步水解并不对称还原得到(R)-2,4-二羟基-3,3-二甲基丁酸(化合物I，即D-泛解酸)一步合成的方案，收率及纯度均较高，其中产品纯度达到99％以上，结构与文献报道相符。本发明合成步骤少，工艺稳定性更高，更合适大规模生产，该合成路线操作简单，成本低，适合工业化生产，具有广阔的市场前景。

2、以3-羟基-4,4-二甲基二氢呋喃-2-酮(化合物II)为原料，经O₃氧化得到4,4-二甲基二氢呋喃-2,3-二酮(化合物III)，该路线反应条件温和，避免了污染性重金属以及有毒试剂的使用。

具体实施方式

所有的实施例中均使用这两种酶，这两种酶信息如下：

葡萄糖脱氢酶：3.6U/g，DNA序列如SEQ ID No.3，由于DNA序列为已知，且葡萄糖脱氢酶的制备方法为公知，故不详细写出制备方法，写出序列以更好的区别使用的葡萄糖脱氢酶种类。

酮还原酶：5.6U/g，DNA序列如SEQ ID No.1，氨基酸序列如SEQ ID No.2；由于DNA序列和氨基酸序列均为已知，且制备酮还原酶的方法为公知，故不详细写出制备方法，写出序列以更好的区别使用的酮还原酶的种类。

实施例1：

向250mL的反应瓶中加入80mL四氢呋喃、原料3-羟基-4,4-二甲基二氢呋喃-2-酮13.01g(0.1mol)，然后加入4.0g NaOH(0.1mol)，控温-10℃以下，随后通入O₃ 15分钟(20g/h)，控制温度在-20℃～20℃反应12h，GC(气相色谱)检测原料反应完全。向体系中加入浓HCl(2M)，调至pH为7左右，继续加入50mL水分液。水相用50mLEA(乙酸乙酯)萃取两次(每次萃取使用50ml)，合并有机相，加入10.0g无水硫酸钠干燥，抽滤，减压浓缩，得到化合物III(12.16g)，收率95％，HPLC测定纯度98.12％。化合物III进行核磁氢谱和核磁碳谱分析，数据如下：

¹H NMR(400H_Z,DMSO-d6)：δ4.37(s,2H),1.21(m,6H).

¹³C NMR(400H_Z,DMSO-d6)：δ198.66,160.01,70.32,750.28,19.75.

向500mL圆底烧瓶中加入已溶解酮还原酶1.22g，甲酸1.2ml,NADP⁺243mg,葡萄糖脱氢酶1g，稀盐酸5ml(0.2M)配成的水解溶剂A(水解溶剂A为30mL的0.1M PB buffer)和水解溶剂B为60mL的异丙醇，然后加入化合物III 12.16g、于30℃条件下恒温摇床，200rpm反应24h。抽滤，滤液浓缩，得到含有化合物I的混旋粗品。然后加入50mL二氯甲烷溶解，并加入适量NaOH溶液调至pH＝5左右，最后干燥、减压除去二氯甲烷，加入150g左右的异丙醇/丙酮(质量比为2：1)重结晶，得到高纯度的D-泛解酸13.50g，收率96％，HPLC测定纯度99.0％，对映体过量值达99.1％。D-泛解酸进行核磁氢谱和核磁碳谱分析，数据如下：

¹H NMR(400H_Z,DMSO-d6)：δ12.86(s,1H),5.48(s,1H),4.24(s,1H),4.17(s,1H),3.54(s,1H),3.45(s,1H),0.89(m,6H).

¹³C NMR(400H_Z,DMSO-d6)：δ173.21,89.63,70.90,38.48,16.82.

实施例2：

向250mL的反应瓶中加入80mL四氢呋喃、原料3-羟基-4,4-二甲基二氢呋喃-2-酮13.01g(0.1mol)，然后加入20.0g NaOH(0.5mol)，控温-10℃以下，随后通入O₃ 15分钟(20g/h)，控制温度在-20℃～20℃反应12h，GC检测原料反应完全。向体系中加入浓HCl(2M)，调至pH为7左右，继续50mL水分液。水相用EA(50ml*2，即每次萃取使用50ml)萃取两次，合并有机相，加入10.0g左右无水硫酸钠干燥，抽滤，减压浓缩，得到化合物III(12.33g)，收率97％，HPLC测定纯度98.5％。化合物III进行核磁氢谱和核磁碳谱分析，数据如下：

¹H NMR(400H_Z,DMSO-d6)：δ4.37(s,2H),1.21(m,6H).

¹³C NMR(400H_Z,DMSO-d6)：δ198.66,160.01,70.32,750.28,19.75.

向500mL圆底烧瓶中加入已溶解酮还原酶1.23g，甲酸1.5ml,NADP⁺61.6mg,葡萄糖脱氢酶1.23g、稀盐酸5ml(0.2M)配成的水解溶剂A(水解溶剂A为30mL的0.5MPB buffer)和水解溶剂B为150mL异丙醇，然后加入化合物III 12.33g、于30℃条件下恒温摇床，200rpm反应24h。抽滤，滤液浓缩，得到含有化合物I的混旋粗品。然后加入50mL二氯甲烷溶解，并加入适量NaOH溶液调至pH＝5左右，最后干燥、减压除去二氯甲烷，加入150g左右的异丙醇/丙酮(质量比为2：1)重结晶，得到高纯度的D-泛解酸13.77g，收率97％，HPLC测定纯度99.0％，对映体过量值达99.1％。D-泛解酸进行核磁氢谱和核磁碳谱分析，数据如下：

¹H NMR(400H_Z,DMSO-d6)：δ12.86(s,1H),5.48(s,1H),4.24(s,1H),4.17(s,1H),3.54(s,1H),3.45(s,1H),0.89(m,6H).

¹³C NMR(400H_Z,DMSO-d6)：δ173.21,89.63,70.90,38.48,16.82.

实施例3：

向250mL的反应瓶中加入80mL四氢呋喃、原料3-羟基-4,4-二甲基二氢呋喃-2-酮6.5g(0.05mol)，然后加入10.0g NaOH(0.25mol)，控温-10℃以下，随后通入O₃ 36分钟(20g/h)，控制温度在-20℃～20℃反应12h，GC检测原料反应完全。向体系中加入浓HCl(2M)，调至pH为7左右，继续加入50mL水分液。水相用EA(50ml*2，即每次萃取使用50ml)萃取两次，合并有机相，加入6.0g左右无水硫酸钠干燥，抽滤，减压浓缩，得到化合物III(6.15g)，收率97％，HPLC测定纯度99.2％。化合物III进行核磁氢谱和核磁碳谱分析，数据如下：

¹H NMR(400H_Z,DMSO-d6)：δ4.37(s,2H),1.21(m,6H).

¹³C NMR(400H_Z,DMSO-d6)：δ198.66,160.01,70.32,750.28,19.75.

向500mL圆底烧瓶中加入已溶解酮还原酶0.31g，甲酸6.15ml,NADP⁺61.5mg,葡萄糖脱氢酶0.12g，稀硫酸(0.2M)配成的水解溶剂A(水解溶剂A为20mL的0.1M PB buffer)和水解溶剂B为100mL异丙醇，然后加入化合物III 6.15g、于30℃条件下恒温摇床，200rpm反应24h。抽滤，滤液浓缩，得到含有化合物I的混旋粗品。然后加入30mL二氯甲烷溶解，并加入适量NaOH溶液调至pH＝5左右，最后干燥、减压除去二氯甲烷，加入120g左右的异丙醇/丙酮(质量比为2：1)重结晶，得到高纯度的D-泛解酸6.91g，收率97％，HPLC测定纯度99.5％，对映体过量值达99.1％。D-泛解酸进行核磁氢谱和核磁碳谱分析，数据如下：

¹H NMR(400H_Z,DMSO-d6)：δ12.86(s,1H),5.48(s,1H),4.24(s,1H),4.17(s,1H),3.54(s,1H),3.45(s,1H),0.89(m,6H).

¹³C NMR(400H_Z,DMSO-d6)：δ173.21,89.63,70.90,38.48,16.82.

实施例4：

向250mL的反应瓶中加入80mL四氢呋喃、原料3-羟基-4,4-二甲基二氢呋喃-2-酮13.01g(0.1mol)，然后加入20.0g NaOH(0.5mol)，控温-10℃以下，随后通入O₃ 15分钟(20g/h)，控制温度在-20℃～20℃反应12h，GC检测原料反应完全。向体系中加入浓HCl(2M)，调至pH为7左右，继续加入50mL水分液。水相用EA(50ml*2，即每次萃取使用50ml)萃取两次，合并有机相，加入10.0g左右无水硫酸钠干燥，抽滤，减压浓缩，得到化合物III(12.41g)，收率98％，HPLC测定纯度98.0％。化合物III进行核磁氢谱和核磁碳谱分析，数据如下：

¹H NMR(400H_Z,DMSO-d6)：δ4.37(s,2H),1.21(m,6H).

¹³C NMR(400H_Z,DMSO-d6)：δ198.66,160.01,70.32,750.28,19.75.

向500mL圆底烧瓶中加入已溶解酮还原酶1.24g，甲酸1.2ml,NADP⁺83mg,葡萄糖脱氢酶1.24g，氢氧化钠溶液5ml(0.2M)配成的水解溶剂A(水解溶剂A为30mL的0.1M PBbuffer)和水解溶剂B为150mL异丙醇，然后加入化合物III 12.41g、于30℃条件下恒温摇床，200rpm反应24h。抽滤，滤液浓缩，得到含有化合物I的混旋粗品。然后加入50mL二氯甲烷溶解，并加入适量NaOH溶液调至pH＝5左右，最后干燥、减压除去二氯甲烷，加入150g左右的异丙醇/丙酮(质量比为2：1)重结晶，得到高纯度的D-泛解酸13.69g，收率96％，HPLC测定纯度99.1％，对映体过量值达99.0％。D-泛解酸进行核磁氢谱和核磁碳谱分析，数据如下：

¹H NMR(400H_Z,DMSO-d6)：δ12.86(s,1H),5.48(s,1H),4.24(s,1H),4.17(s,1H),3.54(s,1H),3.45(s,1H),0.89(m,6H).

¹³C NMR(400H_Z,DMSO-d6)：δ173.21,89.63,70.90,38.48,16.82.

实施例5：

向250mL的反应瓶中加入四氢呋喃和乙酸乙酯混和溶剂80mL(体积比1：1)、原料3-羟基-4,4-二甲基二氢呋喃-2-酮13.01g(0.1mol)，然后加入4.0g NaOH(0.1mol)，控温-10℃以下，随后通入O₃ 15分钟(20g/h)，控制温度在-20℃～20℃反应12h，GC(气相色谱)检测原料反应完全。向体系中加入浓HCl(2M)，调至pH为7左右，继续加入50mL水分液。水相用50mLEA(乙酸乙酯)萃取两次(每次萃取使用50ml)，合并有机相，加入10.0g无水硫酸钠干燥，抽滤，减压浓缩，得到化合物III(12.31g)，收率97％，HPLC测定纯度98.5％。化合物III进行核磁氢谱和核磁碳谱分析，数据如下：

¹H NMR(400H_Z,DMSO-d6)：δ4.37(s,2H),1.21(m,6H).

¹³C NMR(400H_Z,DMSO-d6)：δ198.66,160.01,70.32,750.28,19.75.

向500mL圆底烧瓶中加入已溶解酮还原酶0.82g，甲酸12.3ml,NADP⁺246mg,葡萄糖脱氢酶0.25g，稀盐酸(0.2M)5ml配成的水解溶剂A(水解溶剂A为30mL的0.1MPB buffer)和水解溶剂B为150mL异丙醇，然后加入化合物III 12.31g、于30℃条件下恒温摇床，200rpm反应24h。抽滤，滤液浓缩，得到含有化合物I的混旋粗品。然后加入50mL二氯甲烷溶解，并加入适量NaOH溶液调至pH＝5左右，最后干燥、减压除去二氯甲烷，加入150g左右的异丙醇/丙酮(质量比为2：1)重结晶，得到高纯度的D-泛解酸13.64g，收率97％，HPLC测定纯度99.1％，对映体过量值达99.2％。D-泛解酸进行核磁氢谱和核磁碳谱分析，数据如下：

¹H NMR(400H_Z,DMSO-d6)：δ12.86(s,1H),5.48(s,1H),4.24(s,1H),4.17(s,1H),3.54(s,1H),3.45(s,1H),0.89(m,6H).

¹³C NMR(400H_Z,DMSO-d6)：δ173.21,89.63,70.90,38.48,16.82.

实施例6：

向250mL的反应瓶中加入四氢呋喃和乙酸乙酯混和溶剂80mL(体积比1：1)、原料3-羟基-4,4-二甲基二氢呋喃-2-酮13.01g(0.1mol)，然后加入11.22g叔丁纯钾(0.1mol)，控温-10℃以下，随后通入O₃ 15分钟(20g/h)，控制温度在-20℃～20℃反应12h，GC(气相色谱)检测原料反应完全。向体系中加入浓HCl(2M)，调至pH为7左右，继续加入5mL水分液。水相用50mLEA(乙酸乙酯)萃取两次(每次萃取使用50ml)，合并有机相，加入10.0g无水硫酸钠干燥，抽滤，减压浓缩，得到化合物III(12.26g)，收率97％，HPLC测定纯度98.7％。化合物III进行核磁氢谱和核磁碳谱分析，数据如下：

¹H NMR(400H_Z,DMSO-d6)：δ4.37(s,2H),1.21(m,6H).

¹³C NMR(400H_Z,DMSO-d6)：δ198.66,160.01,70.32,750.28,19.75.

向500mL圆底烧瓶中加入已溶解酮还原酶0.61g，甲酸1.5ml,NADP⁺122.6mg,葡萄糖脱氢酶1.02g，稀硫酸(0.2M)5ml的水解溶剂A(水解溶剂A为30mL的0.1M PB buffer)和水解溶剂B为150mL异丙醇，然后加入化合物III 12.26g、于30℃条件下恒温摇床，200rpm反应24h。抽滤，滤液浓缩，得到含有化合物I的混旋粗品。然后加入50mL二氯甲烷溶解，并加入适量NaOH溶液调至pH＝5左右，最后干燥、减压除去二氯甲烷，加入150g左右的异丙醇/丙酮(质量比为2：1)重结晶，得到高纯度的D-泛解酸13.60g，收率97％，HPLC测定纯度99.1％，对映体过量值达99.5％。D-泛解酸进行核磁氢谱和核磁碳谱分析，数据如下：

¹H NMR(400H_Z,DMSO-d6)：δ12.86(s,1H),5.48(s,1H),4.24(s,1H),4.17(s,1H),3.54(s,1H),3.45(s,1H),0.89(m,6H).

¹³C NMR(400H_Z,DMSO-d6)：δ173.21,89.63,70.90,38.48,16.82.

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京欧信医药技术有限公司

<120> 一种D-泛解酸的制备方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 777

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgacccagc aacggtggcg cctggacggg cagaccgccc tgatcaccgg tgccagcgcc 60

ggtatcggcc tggccatcgc gcacgaactg gccggcttcg gcgcggacct gatgatcgtc 120

gggcgcgata tcgacatgct ggagaccgcg cgcgacgagc tgctggatgt gtatccgcag 180

atgcaggtgc acgcgctggc cgccgatgtc tccgacgacg aggaccgccg gcagatcctg 240

gactgggtgg aagaccacag tgatggcctg cacatcctgg tcaacaatgc tggcggcaac 300

gtcaccaagg cggccacgga gtattcagag gacgaatggc ggaagatctt cgagaccaac 360

ctgttctcgg cgttcgagct gtcgcgctac gcgcatccgc tgctggctcg ccacgcatcg 420

tcgtcgatcg tcaacgtcgg cagcgtgtcc ggcctgaccc atgtgcgcag cggcgtggtc 480

tacggcatga gcaaggccgc gatgcaccag atgacccgca acctggccgt cgagtgggcc 540

gaggatggca tccgggtcaa tgcagtggcg ccgtggtaca tccgcacgcg gcggacctcc 600

ggtccgttgt cggacccgga ttactacgag gaagtgatca accgcacgcc gatgcgtcgt 660

atcggcgagc cggaggaagt ggccgccgcg gtgggcttcc tctgcctgcc ggcagccagc 720

tatgtcaccg gtgagtgcat cgcggtggat ggcggcttcc tgcgctacgg gttctga 777

<210> 2

<211> 258

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Thr Gln Gln Arg Trp Arg Leu Asp Gly Gln Thr Ala Leu Ile Thr

1 5 10 15

Gly Ala Ser Ala Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala His Glu Leu Ala Gly

20 25 30

Phe Gly Ala Asp Leu Met Ile Val Gly Arg Asp Ile Asp Met Leu Glu

35 40 45

Thr Ala Arg Asp Glu Leu Leu Asp Val Tyr Pro Gln Met Gln Val His

50 55 60

Ala Leu Ala Ala Asp Val Ser Asp Asp Glu Asp Arg Arg Gln Ile Leu

65 70 75 80

Asp Trp Val Glu Asp His Ser Asp Gly Leu His Ile Leu Val Asn Asn

85 90 95

Ala Gly Gly Asn Val Thr Lys Ala Ala Thr Glu Tyr Ser Glu Asp Glu

100 105 110

Trp Arg Lys Ile Phe Glu Thr Asn Leu Phe Ser Ala Phe Glu Leu Ser

115 120 125

Arg Tyr Ala His Pro Leu Leu Ala Arg His Ala Ser Ser Ser Ile Val

130 135 140

Asn Val Gly Ser Val Ser Gly Leu Thr His Val Arg Ser Gly Val Val

145 150 155 160

Tyr Gly Met Ser Lys Ala Ala Met His Gln Met Thr Arg Asn Leu Ala

165 170 175

Val Glu Trp Ala Glu Asp Gly Ile Arg Val Asn Ala Val Ala Pro Trp

180 185 190

Tyr Ile Arg Thr Arg Arg Thr Ser Gly Pro Leu Ser Asp Pro Asp Tyr

195 200 205

Tyr Glu Glu Val Ile Asn Arg Thr Pro Met Arg Arg Ile Gly Glu Pro

210 215 220

Glu Glu Val Ala Ala Ala Val Gly Phe Leu Cys Leu Pro Ala Ala Ser

225 230 235 240

Tyr Val Thr Gly Glu Cys Ile Ala Val Asp Gly Gly Phe Leu Arg Tyr

245 250 255

Gly Phe

<210> 3

<211> 480

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggacatgt atccggattt atataaagga aaagtcgtcg ctattacagg agctgctaca 60

gggctcggaa aggcgatggc cattcgcttc ggcaaggagc aggcaaaagt ggttatcaac 120

tattatagta ataaacaaga tccgaacgag gtaaaagaag aggtcatcaa ggcgggcggt 180

gaagctgttg tcgtccaagg agatgtcacg aaagaggaag atgtaaaaaa tatcgtgcaa 240

acggcaatta aggagttcgg cacactcgat attatgatta ataatgccgg tcttgaaaat 300

cctgtgccat ctcacgaaat gccgctcaag gattgggata aagtcatcgg cacgaactta 360

acgggtgcct ttttaggaag ccgtgaagcg attaaatatt tcgtagaaaa cgatatcaag 420

ggaaatgtca ttaacatgtc cagtgtgcac gaagtgattc cttggccgtt atttgtccac 480