一种制备(s)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的方法
阅读说明：本技术 一种制备(s)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的方法 (Method for preparing (S) -2-chloro-1- (3, 4-difluorophenyl) ethanol ) 是由 陶荣盛 潘震华 朱傅赟 原犇犇 沈正权 孙梁栋 沈青 郑云 胡海亮 于 2020-06-03 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种制备(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的方法,包括如下步骤：使用固定化载体LX-1000ODS或者LXES-J420将酮基还原酶KRED固定化,得到固定化酶；用固定化酶催化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮进行还原反应,得到目标化合物。本发明方法的能够高效、稳定地催化式底物反应生成高光学纯度的产物,适合于工业化应用。(The invention provides a method for preparing (S) -2-chloro-1- (3, 4-difluorophenyl) ethanol, which comprises the following steps: immobilizing keto reductase KRED by using an immobilized carrier LX-1000ODS or LXES-J420 to obtain an immobilized enzyme; catalyzing 2-chloro-1- (3, 4-difluorophenyl) ethanone by using immobilized enzyme to perform reduction reaction to obtain a target compound. The method can efficiently and stably catalyze the substrate reaction to generate a product with high optical purity, and is suitable for industrial application.)
技术领域
本发明属于生物催化技术领域，具体地说，涉及一种制备(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的方法。
背景技术
替格瑞洛，曾用名替卡格雷，是英国阿斯利康(AstraZeneca)公司开发的一种新型具有选择性抗凝血药，是首个可逆的结合型P2Y12腺苷二磷酸受体(ADP)拮抗剂。替格瑞洛与氯吡格雷相比，具有明显降低患者心肌梗塞、卒中或者心血管死亡症状的优点。2011年美国FDA批准上市，在全球85个国家得到批准，被列入29个国家的医疗保险目录，进入31个国家病人自付目录，具有广阔的市场前景。
目前通常采用化学方法合成替格瑞洛，已有专利公开了多种替格瑞洛的合成工艺路线。在美国专利US7250419公开的替格瑞洛合成路线中，式II所示化合物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇是关键中间体之一，具有较高的经济价值。
EP2589587A1报道了另一条路线是采用CBS催化剂，BH3还原得到手性氯醇II，但ee值仅在90-93％，产品需要精制来提高ee值且成本较高。专利文献CN109112166A报道了一种具有高效催化活性的酮还原酶(KRED)以及使用该游离酶催化式II所示化合物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮制备化合物II的方法，ee值可＞99％。
酮还原酶价格昂贵，游离酶只能一次性使用，无法回收再利用，这就导致化合物I经酮不对称还原反应制备化合物II的原料成本较高，成为工业化应用的障碍。
发明内容
为了克服现有技术的酶法制备化合物II经济性差的缺陷，发明人对于酮还原酶KRED的固定化技术进行了研究。发现特定的固定化酶能够高效且稳定地催化化合物I的不对称还原反应，降低化合物II的生产成本。具体而言，本发明包括如下技术方案。
一种制备(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的方法，包括如下步骤：
A.使用固定化载体LX-1000ODS或者LXES-J420将酮基还原酶KRED固定化，得到固定化酶；
B.使用步骤A中得到的固定化酶催化式I所示化合物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮进行还原反应，得到作为替格瑞洛中间体之一的式II所示化合物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇：
优选地，上述固定化载体是LX-1000ODS。
在一种优选的实施方式中，上述酮基还原酶来源于开菲尔乳杆菌(Lactobacilluskefiri)，氨基酸序列为SEQ ID NO:1：
MTDRLKGKVAIVTGGTLGIGLAIADKFVEEGAKVVITGRRADVGERAAKSIGGTDVIRFVQHDASDEAGWTKLFDTTEEAFGPVTTVVNNAGIGVVKSVEDTTTEEWRKLLSVNLDGVFFGTRLGIQRMKNKGLGASIINMSSIFGMVGDPTVGAYNASKGAVRIMSKSAALDCALKDYDVRVNTVHPGPIKTPMLDDVEGAEEMWSQRTKTPMGHIGEPNDIAWVCVYLASGESKFATGAEFVIDGGWTAQ(SEQ ID NO:1)。
上述酮基还原酶SEQ ID NO:1可以通过微生物表达得到。
上述酮基还原酶SEQ ID NO:1的表达基因优选是SEQ ID NO:2：
ATGACTGATCGTTTAAAAGGCAAAGTAGCAATTGTAACTGGCGGTACCTTGGGAATTGGCTTGGCAATCGCTGATAAGTTTGTTGAAGAAGGCGCAAAGGTTGTTATTACCGGCCGTCGGGCTGATGTAGGTGAACGGGCTGCCAAATCAATCGGCGGCACAGACGTTATCCGTTTTGTCCAACACGATGCTTCTGATGAAGCCGGCTGGACTAAGTTGTTTGATACGACTGAAGAAGCATTTGGCCCAGTTACCACGGTTGTCAACAATGCCGGAATTGGGGTCGTAAAGAGTGTTGAAGATACCACAACTGAAGAATGGCGCAAGCTGCTCTCAGTTAACTTGGATGGTGTCTTCTTCGGTACCCGTCTTGGAATCCAACGTATGAAGAATAAAGGACTCGGAGCATCAATCATCAATATGTCATCTATCTTCGGTATGGTTGGTGATCCAACTGTGGGTGCATACAACGCTTCAAAAGGTGCTGTCAGAATTATGTCTAAATCAGCTGCCTTGGATTGCGCTTTGAAGGACTACGATGTTCGGGTTAACACTGTTCATCCAGGTCCTATCAAGACACCAATGCTTGACGATGTTGAAGGGGCAGAAGAAATGTGGTCACAGCGGACCAAGACACCAATGGGTCATATCGGTGAACCTAACGATATCGCTTGGGTCTGTGTTTACCTGGCATCTGGCGAATCTAAATTTGCCACTGGTGCAGAATTCGTTATCGATGGTGGATGGACTGCTCAATAA(SEQ ID NO:2)。
优选地，上述微生物是大肠杆菌。
一种实施方式中，上述步骤A为：将发酵后的微生物菌体离心，破壁，离心，取上清得粗酶液，在磷酸盐缓冲液中与固定化载体混合、吸附，得到固定化酶。
上述步骤B的反应体系为pH7.5-8.5的磷酸盐缓冲液，优选pH7.8-8.2，更优选pH8.0左右。
上述步骤B的反应温度为30-45℃。优选35-42℃，更优选37-40℃。
优选地，上述反应体系中可以添加有异丙醇和辅酶NADP+。NADP+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，辅酶II)的作用是，作为氧化剂掠夺电子，酮基还原酶利用异丙醇将NADP+还原为NADPH，产生充足的NADPH作为生物合成的还原剂，从而促进还原反应。
本发明提供的固定化酮基还原酶能够高活性催化式底物I发生不对称还原反应，产生高光学纯度的替格瑞洛中间体II，具有稳定性好、成本低的优点，有利于实现工业化生产。
具体实施方式
酶的固定化是用物理或化学手段，将游离酶封锁在固体材料上、或限制在一定区域内，酶仍然可以发挥催化作用，并可循环使用。经固定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护、能源开发以及基础研究等方面发挥了重要作用。
生物催化领域公知，与游离酶法相比，应用固定化酶技术具有生产过程简化、生产效率提高等优点。同时，由于酶可多次使用，且酶的稳定性提高，从而有效提高了单位酶的生产力；其次，固定化酶极易与底物、产物分开，简化了提纯工艺，产率较高，产品质量较好。但是，酶的固定化也有不少缺点，固定化时酶活力通常会有损失，而且催化反应产物的手性纯度有时也会发生变化，往往难于保证高的手性纯度。
发明人在研究酮还原酶KRED的固定化时，尝试了多种类型的固定化方法，包括吸附法、交联法、包埋法、载体偶联法(又称共价结合法)等。在吸附法/载体偶联法的载体选择中，重点考察了离子交换树脂，包括商品化的氨基固定化载体比如EC系列的EC-HA、EC-EA；西安蓝晓科技有限公司的Seplite LX-1000HA、Seplite LX-1000NH；RelizymeTM系列的HA403、EA403；商品化的环氧基固定化载体比如EC系列的EC-EP、EC-HFA；西安蓝晓科技有限公司的Seplite LX-1000EP、Seplite LX-1000HFA、LX-1000ODS、LXES-J420、LX-Q650C、LX-T300、LX-G20；RelizymeTM系列的EP403、HFA403等。参见下述表1。
通过实验发现，酮还原酶KRED、尤其是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的酮基还原酶能够与两种固定化载体LX-1000ODS和LXES-J420、尤其是LX-1000ODS进行理想的匹配，通过吸附法进行固定化后，能够高效且稳定地催化式I所示化合物进行手性还原，得到高光学活性的式II所示化合物，解决了目前酶法生产工艺中所存在的瓶颈，从而降低生产成本，为实现酶法生产式II所示化合物的规模化奠定基础。
令人惊讶的是，载体LX-1000ODS固定化KRED(为SEQ ID NO:1)催化反应的产物的光学纯度(ee值)竟然超过了游离酶催化的反应产物的光学纯度，提示LX-1000ODS固定化KRED酶的立体选择性提高，其原因有待于进一步研究。有可能是因为酮还原酶SEQ ID NO:1被载体LX-1000ODS吸附后，发生了立体构象变化、或者酶活性位点的空间改变，促进了酶蛋白正确折叠，增强了酶活，改善底物的选择性。
在本文中，术语“式II所示化合物”、“化合物II”和“产物化合物II”表示相同的意义，都是指目的化合物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇。类似地，术语“式I所示化合物”、“底物I”和“化合物I”表示相同的意义，都是指作为酶促反应底物的2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮。
为了进一步降低反应原料成本，酮还原酶SEQ ID NO:1可以自行生产，比如通过微生物发酵表达来获得。这种情况下，待固定的酮还原酶SEQ ID NO:1可以是粗酶液，比如发酵菌体破壁(破胞)后的液体，这样可以省去酶的提取、纯化等繁琐步骤，实现固定化酶的从头制备，大大降低使用的商品酶价格。
上述微生物可以使任何适合表达酮还原酶SEQ ID NO:1的微生物，包括细菌和真菌。优选生长快速的大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明中使用的酮还原酶SEQ ID NO:1结构明确，因此本领域技术人员能够容易地获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。
根据转化体即表达微生物不同，可以对酮还原酶SEQ ID NO:1的表达基因进行密码子优化。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在快速生长的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成。为了在大肠杆菌中表达酮还原酶SEQ ID NO:1，设计并合成出其表达基因SEQ ID NO:2。
通过将酮还原酶的基因例如SEQ ID NO:2克隆至表达载体，导入到大肠杆菌中，实现该酶的表达。然后将粗酶液与固定化载体按一定比例进行固定。得到的固定化酶可有效实现底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮的生物转化。
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
实施例
材料和方法
实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
酮还原酶SEQ ID NO:1表达菌株的构建、大肠杆菌发酵、菌体收集保藏、蛋白质鉴定委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备、转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。可按照试剂盒说明书操作，必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
LB培养基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠，pH7.2，121℃高温高压灭菌20min。
TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K2HPO4.3H2O、2.31g/LKH2PO4、5g/L甘油，pH 7.0-7.5，121℃高温高压灭菌20min；
斜面培养基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠、20g/L琼脂粉，混匀后按30-40mL装液量分装到茄子瓶，竖立放置于121℃高温高压灭菌20min，降温后加入100μg/mL硫酸卡那霉素，摆放成斜面，待冷凝成固体即可。
发酵培养
种子活化：取种子甘油保藏管，取100μl种子保藏液，用接种环均匀涂抹于茄子瓶斜面，然后置于37℃培养箱培养过夜(18h)；
种子培养：取100ml无菌水导入茄子瓶做成菌悬液，取菌悬液50μl接入装有50mlTB培养基的250ml摇瓶，30℃，220rpm培养16h；
发酵：将一级种子培养液接入装有1l TB培养基的5L摇瓶，37℃，220rpm培养4-6h后，加入0.3mM IPTG并降温至28℃，220rpm诱导培养12h。
菌体收集：收集发酵液，置于离心机4000rpm离心30min，弃上清后收集菌泥，放置于-20℃冷冻收藏。
实施例1酮还原酶SEQ ID NO:1表达菌株的构建
委托南京金斯瑞生物科技有限公司构建表达酮还原酶SEQ ID NO:1的大肠杆菌基因工程菌并培养发酵。包括：
1.1全基因序列合成序列SEQ ID NO:2，构建到pET24a质粒(浙江华睿生物技术有限公司)中，形成用于表达酮还原酶SEQ ID NO:1的载体pET24a-kreD。
正向引物kreD-F：5’-GGAATTCCATATGACTGATCGTTTAAAAG-3’，
反向引物kreD-R：5’-CGGGATCCTTATTGAGCAGTCCATCCAC-3’。
PCR扩增约777bp片段，PCR反应体系包括：正向引物、反向引物各0.3μM，模板50ng，1xKOD Neo plus buffer，0.2mM dNTPs,1.5mM MgSO4，KOD neo plus 1U，补双蒸水至总体系50μl。PCR条件：94℃，2min；98℃10s，55℃30s，68℃30s，重复30循环；68℃10min。
PCR反应结束后，琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收试剂盒回收片段。质粒载体pET24a或kreD片段分别用NdeI和BamHI进行双酶切处理，酶切体系：质粒37μl(或片段37μl)，10xTango buffer 10μl，NdeI 1.5μl，BamHI 1.5μl。酶切结束同样使用胶回收试剂盒回收片段。其中PCR用酶KOD Neo plus购自东洋纺(上海)生物科技有限公司，胶回收试剂盒OMEGAGel Extraction Kit D2500购自广州飞扬生物工程有限公司。限制性内切酶均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
1.2通过电转化将重组质粒pET24a-kreD转化入宿主大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen公司)，得到表达酮还原酶SEQ ID NO:1(kreD)的重组大肠杆菌，简称为菌株kreD。
实施例2菌株发酵
从培养kreD工程菌的LB平板上挑选单克隆，接种到5ml LB培养基中，37℃培养过夜；按1％v/v比例接种到含有100ml TB培养基的1000ml摇瓶中，37℃、220rpm培养4-6小时，OD600值达到1.2-1.5，加入0.2mM的IPTG诱导，降温到25℃，继续培养10-16小时，离心获得菌体，可在-80℃冻存24小时备用。
实施例3酶的固定化
3.1将发酵好的菌体离心后称重，以1：4(g/ml质量体积比)的0.02M磷酸钾缓冲液(pH 8.0±0.2)混悬后压榨破胞，离心后即得粗酶液，采用考马斯亮蓝试剂盒，测定上清蛋白浓度为22.5g/L，备用。
3.2分别采用如下表1所示离子交换树脂作为固定化载体进行酶的固定化
表1、部分离子交换树脂分类
氨基类固定化载体在使用前需要进行活化，方法为：将10g载体浸没于40ml 0.1M磷酸钾缓冲液(pH4.2-4.5)150rpm，20-25℃下振摇15min；维持pH在8.0±0.2的范围内，必要时应调节；静置，除去上清；将载体重新浸没于40ml 0.02M磷酸钾缓冲液(pH 8.0±0.2)，150rpm，20-25℃下振摇5min；除去上清，用40ml含2％戊二醛的0.02M磷酸钾缓冲液(pH 8.0±0.2)浸没载体，150rpm，20-25℃下振摇60min；静置，除去上清；用0.02M磷酸钾缓冲液(pH8.0±0.2)清洗载体两次抽干即可。
环氧类和吸附类固定化载体无需活化，可直接用于酶的固定。
氨基类固定化载体与酮还原酶的固定，以LX-1000NH为例，固定化酶的制备方法如下：按蛋白载体比1：15的比例，在20-25℃条件下，150rpm振摇。1min后停止振摇，检测并调整pH为8.0±0.1，继续振摇18h，除去上清，用40ml 0.02M磷酸钾缓冲液(pH8.0±0.2)在25℃条件下振摇1-2min；除去上清，以0.02M含0.5M NaCl的磷酸钾缓冲液(pH 8.0±0.2)于20-25℃，150rpm振摇45min；除去上清，再次用0.02M磷酸钾缓冲液(pH 8.0±0.2)清洗，用真空泵抽干，即得固定化酶，用于转化测试。
其他氨基类固定化载体与酮还原酶的固定同LX-1000NH的制备。
环氧类和吸附类固定化载体与酮还原酶的固定，以吸附类载体LX-1000ODS为例，固定化酶的制备方法如下：按蛋白载体比1：15的比例，置于0.1M磷酸钾缓冲液(pH 8.0±0.2)，在20-25℃条件下，150rpm振摇；1min后停止振摇，检测并调整pH为8.0±0.1，继续振摇18h；停止振摇，在相同温度下静置20-24h；除去上清，用40ml 0.02M磷酸钾缓冲液(pH8.0±0.2)在20-25℃条件下振摇1-2min；除去上清，再次以相同缓冲液振摇洗涤45min；除去上清，再次用40ml 0.02M磷酸钾缓冲液(pH 8.0±0.2)清洗，用真空泵抽干，即得固定化酶，用于转化测试。
其他环氧类和吸附类固定化载体与酮还原酶的固定同LX-1000ODS的制备。
实施例4各种固定化酶的催化活性和稳定性比较
4.1酶催化方法(以100ml体系为例)：准确称取底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮15g，量取异丙醇20ml，水75g加入到250ml三角瓶中，用10％NaOH溶液调pH8.0左右，升温至37℃，加入固定化酶4g，辅酶NADP+0.004g，开始反应，反应2h取样，HPLC检测反应体系中产物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的生成量。
4.2HPLC检测条件为：
流动相：乙腈550ml+水450ml用磷酸调节PH＝4.0，色谱条件为：流速：1.0ml/min，色谱柱：SB-C18(250*4.6，5um)，柱温：25℃，检测波长：225nm，样品用流动相稀释。
HPLC手性检测方法如下：
流动相：正己烷：乙醇：三氟乙酸＝950:50:1，色谱条件为：流速：1.0ml/min，色谱柱：大赛璐AD-H(ODH)(250*4.6，5um)，柱温：25℃，检测波长：225nm，采集时间25min，样品稀释用正己烷:异丙醇＝9:1。
4.3催化反应2h时转化产物百分比参见如下表2。
表2、部分固定化酶催化反应2h时的产物收率和ee值比较
载体
产物％
ee值
EC-HA
5.35％
98.83％
EC-EA
3.73％
99.25％
EC-EP
2.15％
98.79％
EC-HFA
2.23％
99.10％
HA403
3.37％
98.57％
EA403
2.96％
98.52％
EP403
1.87％
98.55％
HFA403
3.02％
98.58％
LX-1000HA
5.08％
98.65％
LX-1000NH
5.89％
98.53％
LX-1000EP
3.43％
98.78％
LX-1000HFA
2.99％
99.21％
LX-1000ODS
13.82％
99.91％
LXES-J420
10.26％
98.56％
LX-Q650C
3.93％
98.66％
LX-T300
4.14％
98.72％
LX-G20
6.07％
98.82％
由表2可见，载体LX-1000ODS和LXES-J420固定化酮基还原酶KRED的酶活性比较突出，产物收率分别达到13.82％和10.26％。尤其是载体LX-1000ODS，其在转化率为13.82％时的产物ee值为99.91％，光学纯度接近100％，是纯手性化合物。
另外，通过与粗酶液催化底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮反应进行比较，虽然相同酶量的粗酶液催化活性明显较高，甚至高出一个数量级，但在产物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇转化率达到14％左右时的光学纯度为99.2％，低于LX-1000ODS固定化酶的立体专一性。
以下实验重点研究该LX-1000ODS固定化酶。
实施例5载体LX-1000ODS固定化酶的稳定性考察
按照实施例4中的方法，考察不同批次LX-1000ODS固定化酶催化反应的稳定性，分别在反应2h和20h时测定产物收率和ee值。结果见表3。
表3、不同批次LX-1000ODS固定化酶催化反应的20h时的产物收率和ee值
由表2可见，载体LX-1000ODS固定化酮基还原酶KRED经过20小时的催化，几乎将全部底物转化为产物，而且产物的ee值保持在99.9％以上，表明该固定化酶具有很高的稳定性。
以上实验表明，两种固定化载体LX-1000ODS和LXES-J420、尤其是LX-1000ODS能够与酮还原酶KRED、尤其是氨基酸序列为SEQ ID NO:1形成完美匹配，尤其是LX-1000ODS与SEQ ID NO:1的组合能够保持酮基还原酶的高催化活性和稳定性，提高酮基还原酶的立体专一性，解决了酶法生产(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇中的瓶颈问题，有利于降低生产成本，具有工业化应用前景。
序列表
<110> 湖州颐盛生物科技有限公司
<120> 一种制备(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的方法
<130> SHPI2010234
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 252
<212> PRT
<213> Lactobacillus kefiri
<400> 1
Met Thr Asp Arg Leu Lys Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr
1 5 10 15
Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala
20 25 30
Lys Val Val Ile Thr Gly Arg Arg Ala Asp Val Gly Glu Arg Ala Ala
35 40 45
Lys Ser Ile Gly Gly Thr Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Ala
50 55 60
Ser Asp Glu Ala Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Ala
65 70 75 80
Phe Gly Pro Val Thr Thr Val Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Val Val
85 90 95
Lys Ser Val Glu Asp Thr Thr Thr Glu Glu Trp Arg Lys Leu Leu Ser
100 105 110
Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg
115 120 125
Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile
130 135 140
Phe Gly Met Val Gly Asp Pro Thr Val Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys
145 150 155 160
Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu
165 170 175
Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Pro Ile Lys
180 185 190
Thr Pro Met Leu Asp Asp Val Glu Gly Ala Glu Glu Met Trp Ser Gln
195 200 205
Arg Thr Lys Thr Pro Met Gly His Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala
210 215 220
Trp Val Cys Val Tyr Leu Ala Ser Gly Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly
225 230 235 240
Ala Glu Phe Val Ile Asp Gly Gly Trp Thr Ala Gln
245 250
<210> 2
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
atgactgatc gtttaaaagg caaagtagca attgtaactg gcggtacctt gggaattggc 60
ttggcaatcg ctgataagtt tgttgaagaa ggcgcaaagg ttgttattac cggccgtcgg 120
gctgatgtag gtgaacgggc tgccaaatca atcggcggca cagacgttat ccgttttgtc 180
caacacgatg cttctgatga agccggctgg actaagttgt ttgatacgac tgaagaagca 240
tttggcccag ttaccacggt tgtcaacaat gccggaattg gggtcgtaaa gagtgttgaa 300
gataccacaa ctgaagaatg gcgcaagctg ctctcagtta acttggatgg tgtcttcttc 360
ggtacccgtc ttggaatcca acgtatgaag aataaaggac tcggagcatc aatcatcaat 420
atgtcatcta tcttcggtat ggttggtgat ccaactgtgg gtgcatacaa cgcttcaaaa 480
ggtgctgtca gaattatgtc taaatcagct gccttggatt gcgctttgaa ggactacgat 540
gttcgggtta acactgttca tccaggtcct atcaagacac caatgcttga cgatgttgaa 600
ggggcagaag aaatgtggtc acagcggacc aagacaccaa tgggtcatat cggtgaacct 660
aacgatatcg cttgggtctg tgtttacctg gcatctggcg aatctaaatt tgccactggt 720
gcagaattcg ttatcgatgg tggatggact gctcaataa 759