一种基于透明质酸的双亲性接枝共聚物及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种基于透明质酸的双亲性接枝共聚物及其制备方法和应用 (Amphiphilic graft copolymer based on hyaluronic acid and preparation method and application thereof ) 是由 孙少平 梁娜 李树鹏 于 2020-04-10 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种基于透明质酸的双亲性接枝共聚物及其制备方法和应用。本发明共聚物包括：作为母体骨架的透明质酸(HA)、接枝在骨架上的去氧胆酸(DCA)、甲氧基聚乙二醇(mPEG)单元和N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)基团。本发明还提供了所述共聚物的制备方法,其中采用mPEG、DCA和NAC对HA进行修饰来制得所述共聚物。本发明还提供了由所述共聚物制得的止血海绵、药物载体和药物组合物。本发明共聚物生物相容性好,吸水速度快,主动被动双重靶向和氧化还原转化,因此可以用于制备快速吸水止血海绵和抗癌药物释放载体,实现药物的延长血液循环、高摄取和快速释药,有效提高肿瘤细胞内药物浓度,具有广阔的应用前景。(the invention provides an amphiphilic graft copolymer based on hyaluronic acid, a preparation method and application thereof.)
技术领域
本发明属于高分子材料及药物制剂技术领域，尤其是一种基于透明质酸的双亲性接枝共聚物及其制备方法和在制备止血海绵以及抗癌药物释放载体中的应用。
背景技术
癌症是威胁人类健康的一类重大疾病，其治疗与诊断一直是许多生物学家、化学家和医学家的工作重点和难点。目前癌症的治疗手段主要为手术治疗、放射治疗和化疗，其中化疗是目前临床上治疗癌症的有效措施，所用的大多数抗癌药物为脂溶性，同时还有毒副作用和耐药性等问题。因此，非常迫切需要能够提供一种能够解决上述问题的抗癌药物释放载体或包含该载体和抗癌药物的释放组合物。
另外，止血在医疗救治中起着至关重要的作用，无论是日常生活中的小创伤，还是手术中的大切口，都需要进行快速、有效的处理。常见的止血材料有纤维蛋白胶，粉末状胶原蛋白，明胶海绵，但这些材料都因自身存在的缺点而被限制应用。比如，纤维蛋白胶来源于人或者哺乳动物的血浆中，可能会传染人或者动物的血源性疾病，在使用中存在着极大的隐患。壳聚糖止血材料虽然具有无毒、无抗原性、抗菌性和生物相容性且可在体内降解、吸收等特性的壳聚糖在开发快速止血材料方面有着更大的优势。但是，现有的壳聚糖止血材料还存在吸水能力不足、伤口愈合慢以及与组织的粘附力不足等问题。透明质酸(HA)是由重复的β-(1→4)-D-葡糖醛酸和β-(1→3)-N-乙酰基-D-葡糖胺二糖单元形成的天然线性多糖。本发明人研究发现，经过化学修饰的透明质酸衍生物制成的止血海绵能够很好地解决上述问题。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明在第一方面提供了一种基于透明质酸的双亲性接枝共聚物，所述双亲性接枝共聚物包括：
(1)作为母体骨架的透明质酸；
(2)接枝在透明质酸的第一伯醇基上的去氧胆酸基团；
(3)接枝在透明质酸的羧基上的甲氧基聚乙二醇单元；
(4)接枝在透明质酸的第二伯醇基上的N-乙酰-L-半胱氨酸基团。
本发明在第二方面提供了一种用于制备本发明第一方面所述的双亲性接枝共聚物的方法，所述双亲性接枝共聚物采用透明质酸、去氧胆酸、N-乙酰-L-半胱氨酸和甲氧基聚乙二醇作为原料进行反应制得。
本发明在第三方面提供了一种止血海绵，所述止血海绵由本发明第一方面所述的双亲性接枝共聚物或本发明第二方面所述的方法制得的双亲性接枝共聚物制得。
本发明在第四方面提供了一种抗癌药物释放载体，所述抗癌药物释放载体由本发明第一方面所述的双亲性接枝共聚物或本发明第二方面所述的方法制得的双亲性接枝共聚物制得。优选的是，所述抗癌药物选自由多西紫杉醇、紫杉醇、表柔比星和喜树碱组成的组。
本发明在第五方面提供了本发明第一方面所述的双亲性接枝共聚物或本发明第二方面所述的方法制得的双亲性接枝共聚物在制备止血海绵或抗癌药物释放载体中的应用；优选的是，所述抗癌药物选自由多西紫杉醇、紫杉醇、表柔比星和喜树碱组成的组。
与现有技术相比，本发明具有如下更加突出的有益效果：
(1)本发明透明质酸衍生物的双亲性接枝共聚物作为药物载体，药物载药量高，包封率高，体内长循环稳定，增加药物利用率，生物相容性良好，毒副作用小，体内可降解。
(2)本发明基于高浓度的生物还原性谷胱甘肽提供了肿瘤组织微环境，选择含有巯基的双亲性透明质酸衍生物，该材料在氧化环境下易形成二硫键，在肿瘤组织微环境中利用氧化还原机制使二硫键打开，可实现抗癌药物在生物体内快速、靶向释放抗癌药物。
(3)本发明以聚乙二醇及透明质酸为两亲性聚合物药物载体的主要亲水端，以透明质酸为靶头，可以主动靶向到肿瘤细胞表面，与肿瘤细胞表面的CD44受体结合并通过细胞的胞吞作用进入肿瘤细胞内，克服了普通载体胶束载体细胞摄取能力低的问题。
(4)本发明公开的药物载体制备简单方便，具有良好的生物相容性，并且原料来源广泛，重复单元中有多种官能团，易于进行结构修饰，并且在肿瘤细胞内可以快速发生氧化还原作用释放药物，从而产生高效的治疗效果，在药物的控制释放上有巨大的应用潜能。
(5)本发明公开的透明质酸衍生物制备成止血海绵后，吸水量大，吸水速度快。
附图说明
图1为实施例1中mPEG-透明质酸-N-乙酰-L-半胱氨酸-去氧胆酸的合成路线图。
图2为实施例1中最终产物的红外图谱。
图3为实施例1中最终产物的核磁图谱。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
如上所述，本发明在第一方面提供了一种基于透明质酸的双亲性接枝共聚物，所述双亲性接枝共聚物包括：
(1)作为母体骨架的透明质酸；
(2)接枝在透明质酸的第一伯醇基上的去氧胆酸基团；
(3)接枝在透明质酸的羧基的甲氧基聚乙二醇单元；
(4)接枝在透明质酸的第二伯醇基上的N-乙酰-L-半胱氨酸基团。
在本发明中，接枝有去氧胆酸基团的第一伯醇基、接枝有甲氧基聚乙二醇单元的羧基和接枝有N-乙酰-L-半胱氨酸基团的第二伯醇基在骨架上的位置没有特别的限定，第一伯醇基和第二伯醇基仅用于区别彼此，对其在骨架上的先后位置和重要性没有限制。
在一些优选的实施方式中，所述双亲性接枝共聚物具有如下所示的分子结构：
其中，n为8～453(例如为50，65，80)，m为7～659(例如为100，150，200)。
在另一些优选的实施方式中，n值使得所述甲氧基聚乙二醇单元的平均分子量为350～20000Da，例如为500、1000、2000、5000、10000或15000Da。
在另一些优选的实施方式中，m值使得所述透明质酸的平均分子量为5000-500000Da，例如为10000、15000、20000或25000Da。
透明质酸(HA)是由重复的β-(1→4)-D-葡糖醛酸和β-(1→3)-N-乙酰基-D-葡糖胺二糖单元形成的天然线性多糖。用于化学修饰的HA包括羧基、羟基和N-乙酰基脱乙酰产生的氨基等主要官能团，可以用于化学修饰，例如可以采用酯化、交联、接枝等修饰手段进行化学修饰。尤其是针对一定分子量的HA，其具有足够多的官能团，从而更易于进行化学修饰。
有利的是，HA可特异性地结合CD44受体，而CD44受体在各种肿瘤细胞的表面上过表达，并在癌细胞增殖，迁移和侵袭中起重要作用。而且，还可以利用EPR效应(实体瘤的高通透性和滞留效应)介导受体进行被动靶向。因此，本发明制得的透明质酸衍生物中的HA可以与肿瘤细胞特异性结合。此外，本发明人发现，对HA进行修饰可以提高其稳定性并获得具有优异性能的衍生物。其中，甲氧基聚乙二醇(mPEG)具有良好的亲水性、生物相容性、无毒性和无免疫原性。而且，它还是纳米载体的三维保护体，可以延长纳米载体在体内的循环时间。具有与人体组织的相容性好、毒副作用小、刺激性低等优点。另外，N-乙酰-L-半胱氨酸上的巯基可以在特定的氧化条件下形成二硫键，可以增加载药量与包封率；而且，该二硫键可以在谷胱甘肽存在的条件下发生断裂，从而将负载在胶束里的抗癌药物释放出来；与正常细胞相比，肿瘤细胞中谷胱甘肽的含量是正常细胞的数百倍，这就为载药体系在肿瘤部位定向精准释放提供了可行性。另外，将所制备的透明质酸衍生物制成止血海绵，具有很强的吸水性，其中具有巯基的高分子易与细胞组织结合。因此，本发明的透明质酸衍生物可以用于制备止血海绵。去胆氧酸可以与PEG相互协调，调节吸水速度与吸水量。
本发明在第二方面提供了一种用于制备本发明第一方面所述的双亲性接枝共聚物的方法，所述双亲性接枝共聚物采用透明质酸、去氧胆酸、N-乙酰-L-半胱氨酸和甲氧基聚乙二醇作为原料进行反应制得。
在一些优选的实施方式中，所述方法包括如下步骤：(1)使用透明质酸和甲氧基聚乙二醇合成HA-mPEG；(2)使用去氧胆酸和所述HA-mPEG合成DCA-HA-mPEG；(3)使用N-乙酰-L-半胱氨酸和所述DCA-HA-mPEG合成作为所述双亲性接枝共聚物的NAC-HA-mPEG-DCA；其中，HA表示作为母体骨架的透明质酸，DCA表示去氧胆酸基团，mPEG表示甲氧基聚乙二醇单元，NAC表示N-乙酰-L-半胱氨酸基团。
在另一些优选的实施方式中，在步骤(1)中，将透明质酸溶于第一反应溶剂中，加入第一催化剂，在0-60℃(例如10、20、30、40或50℃)催化0.5-24小时(例如1、3、6、9、12、15、18或21小时)，然后加入甲氧基聚乙二醇，在0-60℃(例如10、20、30、40或50℃)下搅拌反应2-96小时(例如2、6、12、24、48、60、72或84小时)后，分离制得HA-mPEG。
在另一些优选的实施方式中，在步骤(2)中，将N-乙酰-L-半胱氨酸溶于第二反应溶剂中，加入第二催化剂，在0-60℃(例如10、20、30、40或50℃)催化0.5-24小时(1、3、6、9、12、15、18或21小时)，再加入所述HA-mPEG，在0-60℃(例如10、20、30、40或50℃)下搅拌反应2-96小时(例如2、6、12、24、48、60、72或84小时)后，分离制得NAC-HA-mPEG。
在另一些优选的实施方式中，在步骤(3)中，将去氧胆酸溶于第三反应溶剂中，加入第三催化剂，在0-60℃(例如10、20、30、40或50℃)催化0.5-24小时，再加入所述NAC-HA-mPEG，在20～80℃(例如20、30、40、50、60或70℃)条件下搅拌2～96小时(例如2、6、12、24、48、60、72或84小时)后，分离制得NAC-HA-mPEG-DCA。
在另一些优选的实施方式中，n值使得所述甲氧基聚乙二醇单元的平均分子量为350～20000Da，例如为500、1000、2000、5000、10000或15000Da。
在另一些优选的实施方式中，m值使得所述透明质酸的平均分子量为5000-500000Da，例如为10000、15000、20000或25000Da。
在另一些优选的实施方式中，所述第一反应溶剂选自由水、甲酰胺、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、N,N-二甲基乙酰胺组成的组，优选的是，所述第一反应溶剂选自由甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃和N,N-二甲基乙酰胺组成的组。
在另一些优选的实施方式中，所述第二反应溶剂选自由水、甲酰胺、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、N,N-二甲基乙酰胺组成的组，优选的是，所述第二反应溶剂选自由甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃和N,N-二甲基乙酰胺组成的组。
在另一些优选的实施方式中，所述第三反应溶剂选自由水、甲酰胺、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、N,N-二甲基乙酰胺组成的组，优选的是，所述第三反应溶剂选自由甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃和N,N-二甲基乙酰胺组成的组。
所述第一催化剂、第二催化剂和第三催化剂独立地选自由EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)、DMAP(4-二甲氨基吡啶)、DCC(二环己基碳二亚胺)组成的组。所述第一催化剂、第二催化剂和第三催化剂可以相同也可以不同。例如，所述第一催化剂可以选自由EDC、NHS、DCC和DMAP组成的组；所述第二催化剂可以选自由EDC、NHS、DCC、DMAP组成的组；所述第三催化剂可以为EDC、NHS和DCC组成的组。
在另一些优选的实施方式中，在步骤(1)中，透明质酸的羧基与甲氧基聚乙二醇的羟基的摩尔比为(1:10)～(100:1)，例如为100:1、50:1、10:1、1:1、1:5或1:10。另外地或进一步有选的是，所述第一催化剂的用量与透明质酸的羧基的摩尔比为(1:10)～(10:1)，例如为1:0.1、1:0.5、1:1、1:5或1:10。
在另一些优选的实施方式中，在步骤(2)中，N-乙酰-L-半胱氨酸与所述HA-mPEG的羟基的摩尔比为(1:100)～(10:1)，例如为1:1、10:1、1:50或1:100。另外地或进一步有选的是，所述第二催化剂与N-乙酰-L-半胱氨酸的摩尔比为(1:10)～(10:1)，例如为1:0.1、1:0.5、1:1、1:5或1:10。
在另一些优选的实施方式中，在步骤(3)中，去氧胆酸与所述NAC-HA-mPEG的羟基的摩尔比为(1:100)～(10:1)，例如为1:0.1、1:0.5、1:1、1:5或1:10。另外地或进一步有选的是，所述第三催化剂的用量与去氧胆酸的摩尔比为(1:10)～(10:1)，例如为1:0.1、1:0.5、1:1、1:5或1:10。
在一些更具体的实施方式中，所述方法包括如下步骤：
(1)HA-mPEG的合成：将透明质酸溶于第一反应溶剂中，加入第一催化剂，在0-60℃催化0.5-24小时。然后加入mPEG，在0-60℃下搅拌反应2-96小时后，透析，干燥，得到HA-mPEG。
(2)NAC-HA-mPEG的合成：N-乙酰-L-半胱氨酸溶于第二反应溶剂中，加入第二催化剂，在0-60℃催化0.5-24小时；再加入所述HA-mPEG衍生物，在0-60℃下搅拌反应2-96小时后，透析，干燥，得到NAC-HA-mPEG。
(3)NAC-HA-mPEG-DCA的合成：将去氧胆酸溶于第三反应溶剂中，加入第三催化剂，在0-60℃催化0.5-24小时，再加入所述NAC-HA-mPEG，在20～80℃条件下搅拌12～96小时，反应产物经透析纯化、冷冻干燥处理后，制得作为所述双亲性接枝共聚物的NAC-HA-mPEG-DCA。
本发明的基于透明质酸的双亲性接枝共聚物(有时称为透明质酸衍生物)可用作止血海绵的材料。于是，本发明在第三方面提供了一种止血海绵，所述止血海绵由本发明第一方面所述的双亲性接枝共聚物或本发明第二方面所述的方法制得的双亲性接枝共聚物制得。在制备止血海绵时，可以将双亲性接枝共聚物混悬于水中制成水悬液，然后加入氯化钙进行交联，然后冻干即得止血海绵。例如，可以将双亲性接枝共聚物制成200mg/ml的溶液，加入30mg/ml氯化钙交联2h后，冻干即得NAC-HA-mPEG-DCA止血海绵。
本发明在第四方面提供了一种抗癌药物释放载体，所述抗癌药物释放载体由本发明第一方面所述的双亲性接枝共聚物或本发明第二方面所述的方法制得的双亲性接枝共聚物制得。其中，本发明的双亲性接枝共聚物可以用于包载抗癌药物，从而制得在肿瘤细胞内由氧化还原作用触发释放抗癌药物的多级靶向聚合物。于是，本发明还可以提供一种抗癌药物释放组合物，所述抗癌药物释放组合物包含：(a)本发明第一方面所述的或者本发明第二方面制得的双亲性接枝共聚物；和(b)抗癌药物，该抗癌药物包载在所述双亲性接枝共聚物中。所述抗癌药物可以实现多级靶向的氧化还原触发释药。因此，本发明的抗癌药物释放载体或者包含该载体的抗癌药物具有多级肿瘤靶向、增强体内长循环、肿瘤细胞内氧化还原触发释药(对氧化还原敏感)的特征。
在制备抗癌药物制剂时，可以将抗癌药物例如紫杉醇溶解在溶剂例如二氯甲烷中，制得紫杉醇溶液。另外，制备双亲性接枝共聚物水溶液。然后，在搅拌的同时，将紫杉醇溶液滴加至双亲性接枝共聚物水溶液。滴加结束后，继续搅拌以使抗癌药物充分包载在双亲性接枝共聚物。接着，对所得物质进行过滤，除去没有被包载的游离抗癌药物和作为载体的双亲性接枝共聚物的聚集体，从而制得抗癌药物释放组合物。
本发明在第五方面提供了本发明第一方面所述的双亲性接枝共聚物或本发明第二方面所述的方法制得的双亲性接枝共聚物在制备止血海绵或抗癌药物释放载体中的应用。优选的是，
在本提及抗癌药物的各个实施方案中，所述抗癌药物可以选自由多西紫杉醇、紫杉醇、表柔比星和喜树碱组成的组。
本发明提供了一种透明质酸衍生物及其制备方法与应用，其中以透明质酸为母体骨架，用去氧胆酸对透明质酸进行修饰，制得具有两亲性的透明质酸衍生物。在此基础上，对其进行N-乙酰-L-半胱氨酸与mPEG的修饰，形成一种新型材料。该材料生物相容性好，不但可以载药，还可以用于制备止血海绵。本发明在用于抗癌药物的递送过程中，利用CD44受体主动靶向、EPR介导受体被动靶向和分子中巯基的氧化还原转化，达到延长血液循环、提高药物在肿瘤组织的摄取和细胞内快速释药，有效提高肿瘤细胞内药物浓度，为提高抗癌药物的抗肿瘤疗效提供一种新型载体和制剂策略。另外，本发明的新型材料也可作为止血海绵，用于创面的止血，具有良好的生物相容性与快速吸水能力。因此本发明的新型材料具有广阔的应用前景。
实施例
下文将通过实施例对本发明进行进一步的说明，但是本发明请求保护的范围不限制于这些实施例。
实施例1
本实施例制备基于透明质酸的双亲性接枝共聚物，制备方法包括如下步骤：
(1)透明质酸连接mPEG(简称为HA-mPEG)的合成：将透明质酸溶于第一反应溶剂中，加入EDC和NHS作为第一催化剂，在25℃催化2小时，再加入mPEG，在30℃下搅拌反应10小时，透析，离心，收集产物，干燥，得到透明质酸连接的mPEG，即HA-mPEG。
(2)NAC-DCA-mPEG的合成：将N-乙酰-L-半胱氨酸溶于第二反应溶剂中，EDC和NHS为第二催化剂，在10℃下催化2小时；再加入所述HA-mPEG，在35℃下搅拌反应15小时，收集产物；产物经过透析、冷冻干燥，得到NAC-HA-mPEG。
(3)NAC-HA-mPEG-DCA的合成：将去氧胆酸溶于第三反应溶剂中，加入EDC和NHS作为第三催化剂，在15℃下催化2小时，再加入所述NAC-HA-mPEG，在80℃条件下搅拌96小时，反应产物经透析13小时，冷冻干燥处理后，制得NAC-HA-mPEG-DCA。
在本实施例中，所述HA的平均分子量为9kDa；所述mPEG的平均分子量为2000Da。步骤(1)中的第一反应溶剂为水；步骤(2)中的第二反应溶剂为DMSO；步骤(3)中的第三反应溶剂为甲酰胺。
在本实施例的步骤(1)中，所述透明质酸的羧基与mPEG的羟基的摩尔比为1：10；EDC和NHS的总用量与透明质酸的羧基的摩尔比为1:10；EDC与NHS的摩尔比为1:1.5。
在本实施例的步骤(2)中，N-乙酰-L-半胱氨酸与HA-mPEG的羟基的摩尔比为1:4；N-乙酰-L-半胱氨酸与EDC和NHS的合计量的摩尔比为3:5；EDC与NHS的摩尔比为2:1。
在本实施例的步骤(3)中，去氧胆酸与NAC-HA-mPEG的羟基的摩尔比3:5；去氧胆酸与EDC和NHS的合计量的摩尔比为1:5；EDC与NHS的摩尔比为4:1。
本发明人最后还对最终得到的产物NAC-HA-mPEG-DCA进行红外检测和核磁检测，结果参见图2和3。
在图2所示的红外图谱中，位于3341cm-1处的吸收峰归属于透明质酸(HA)上的-OH的吸收峰，2865cm-1属于mPEG上-CH3的吸收峰，而在1656cm-1处的吸收峰为NAC上C-O的吸收峰，在2935cm-1处-CH3伸缩振动吸收峰则属于DCA的特征吸收峰，由此证明NAC-HA-mPEG-DCA已被成功合成。
在图3所示的核磁图谱中，2.13ppm属于HA上-CH3的特征吸收峰，2.83为mPEG上-CH3的特征吸收峰，而2.66ppm属于NAC上-CH2的特征吸收峰，0.86ppm属于DCA上-CH2的特征吸收峰，由此再次证明NAC-HA-mPEG-DCA已被成功合成。
实施例2
本实施例制备基于透明质酸的双亲性接枝共聚物，制备方法包括如下步骤：
(1)HA-mPEG的合成：将透明质酸溶于第一反应溶剂中，以DCC为第一催化剂，在10℃催化10小时，再加入mPEG，在60℃下搅拌反应3小时，透析1小时，离心，收集产物，干燥，制得透明质酸连接的mPEG，即HA-mPEG。
(2)NAC-HA-mPEG的合成：将N-乙酰-L-半胱氨酸溶于第二反应溶剂中，以DCC为第二催化剂，在10℃下催化2小时；再加入HA-mPEG，在15℃下搅拌反应24小时，收集产物；产物经过透析4小时、冷冻干燥，得到NAC-HA-mPEG。
(3)NAC-HA-mPEG-DCA的合成：将去氧胆酸溶于第三反应溶剂中，以DCC为第三催化剂，在5℃下下催化1小时，再加入NAC-HA-mPEG，在60℃条件下搅拌60小时，反应产物经透析48小时，冷冻干燥处理后，制得NAC-HA-mPEG-DCA。
在本实施例中，所述HA的平均分子量为50kDa；所述mPEG的平均分子量为20000Da。步骤(1)中的第一反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；步骤(2)中的第二反应溶剂为N,N-二甲基乙酰胺；步骤(3)中的第三反应溶剂为四氢呋喃。
在本实施例的步骤(1)中，所述透明质酸的羧基与mPEG的羟基的摩尔比为1:10；DCC与透明质酸的羧基的摩尔比为1:10。
在本实施例的步骤(2)中，N-乙酰-L-半胱氨酸与HA-mPEG的羟基的摩尔比为1:4；N-乙酰-L-半胱氨酸与DCC的摩尔比为2:1。
在本实施例的步骤(3)中，去氧胆酸与NAC-HA-mPEG的羟基的摩尔比为1:5；去氧胆酸与DCC的摩尔比为1:3。
实施例3
本实施例制备基于透明质酸的双亲性接枝共聚物，制备方法包括如下步骤：
(1)HA-mPEG的合成：将透明质酸溶于第一反应溶剂中，加入DMAP作为第一催化剂，在55℃催化1小时，再加入mPEG，在45℃下搅拌反应10小时，透析，离心，收集产物，干燥，得到HA-mPEG。
(2)NAC-HA-mPEG的合成：将N-乙酰-L-半胱氨酸溶于第二反应溶剂中，以DMAP为第二催化剂，在25℃下催化2小时；再加入HA-mPEG，在35℃下搅拌反应15小时，收集产物；产物经过透析、冷冻干燥，得到NAC-HA-mPEG。
(3)NAC-HA-mPEG-DCA的合成：将去氧胆酸溶于第三反应溶剂中，加入EDC和NHS为第三催化剂，在35℃下下催化2小时，再加入NAC-HA-mPEG，在30℃条件下搅拌96小时，反应产物经透析13小时，冷冻干燥处理后，得NAC-HA-mPEG-DCA。
在本实施例中，所述HA的平均分子量为200000Da；所述mPEG的平均分子量为4000Da。步骤(1)中的第一反应溶剂为DMSO；步骤(2)中的第二反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；步骤(3)中的第三反应溶剂为DMSO和水的混合溶剂(体积比为1:1，v/v)。
在本实施例的步骤(1)中，所述透明质酸的羧基与mPEG的羟基的摩尔比为10:1；DMAP与mPEG的羟基摩尔比为1:10。
在本实施例的步骤(2)中，N-乙酰-L-半胱氨酸与HA-mPEG的羟基的摩尔比为1:4；N-乙酰-L-半胱氨酸与DMAP的摩尔比为3:5。
在本实施例的步骤(3)中，去氧胆酸与NAC-HA-mPEG的羟基的摩尔比为1:5；去氧胆酸与DMAP的摩尔比为1:5。
对比实施例1
采用与实施例1相同的方法进行至步骤(1)，制得HA-mPEG。
对比实施例2
采用与实施例1相同的方法进行至步骤(2)，制得NAC-HA-mPEG。
制备例1至3
在制备例1～3中分别将实施例1至3所制得的双亲性接枝共聚物混悬于水中，制成200mg/ml的溶液，加入30mg/ml氯化钙交联2h后，冻干即得NAC-HA-mPEG-DCA止血海绵(即透明质酸衍生物止血海绵)。
对比制备例1
将与实施例1中使用的相同透明质酸混悬于水中，制成200mg/ml的溶液，加入30mg/ml氯化钙交联2h后，冻干即得透明质酸止血海绵。
对比制备例2
采用与制备例1相同的方法，不同之处在于，采用对比实施例1所制得的HA-mPEG代替NAC-HA-mPEG-DCA制备止血海绵。
对比制备例3
采用与制备例1相同的方法，不同之处在于，采用对比实施例1所制得的NAC-HA-mPEG代替NAC-HA-mPEG-DCA制备止血海绵。
止血海绵吸水力试验：将制备1至3以及对比制备例1至3制得的止血海绵在生理盐水中浸泡10分钟后，测定其吸水率。为了检测这些止血海绵快速吸水能力，还测试它们在5s内吸水能力。结果如下表1所示。
表1.止血海绵的吸水性能
实例
NAC-HA-mPEG-DCA
吸水倍数(10min)
吸水倍数(5s)
制备例1
实施例1
28
7
制备例2
实施例2
30
6
制备例3
实施例3
30
9
对比制备例1
透明质酸
21
4
对比制备例2
对比实施例1
27
13
对比制备例3
对比实施例2
33
12
由上表数据可以看出，10分钟内，采用制备例1至3所制备的止血海绵可以吸收超过其自身质量的25倍水量。在5s内，采用实施例1至3所制备的共聚物制得的止血海绵5s内可以吸收其自身质量的6倍以上水分，远远超过对比制备例1至3中制得的透明质酸止血海绵在同一时间内所吸收的水量，推测是因为所制备止血海绵表面具有PEG结构，其亲水性更强，吸水速度更快。以上结果表明，由本发明实施例1至3制得的材料所制备的止血海绵具有较快的吸水效果。
制备例4～12
这些制备例涉及本发明的基于透明质酸的双亲性接枝共聚物作为抗癌药物释放载体的应用，其中制得包含所述双亲性接枝共聚物和由所述双亲性接枝共聚物包载的抗癌药物的抗癌药物释放组合物。所述抗癌药物释放组合物为含N-乙酰-L-半胱氨酸-透明质酸-mPEG-去氧胆酸(即NAC-HA-mPEG-DCA)包载紫杉醇(PTX)的纳米粒。首先，取不同浓度的PTX溶解于0.5ml二氯甲烷中，制成PTX溶液；另取实施例1至3制得的NAC-HA-mPEG-DCA(各10mg)，溶解于10ml蒸馏水中，在搅拌条件(搅拌速度为100rpm)下，逐滴加入PTX溶液，以100rpm的速度继续搅拌12小时，使PTX充分进入所述NAC-HA-mPEG-DCA中。之后，于35℃下，旋转蒸发，除去二氯甲烷，得到载药紫杉醇的纳米粒水溶液，并用0.45μm微孔滤膜过滤，以除去游离药物与载体聚集体，从而制得抗癌药物释放组合物。然后对抗癌药物释放组合物中的载药纳米粒的粒径、包封率和载药量(抗癌药物在抗癌药物释放组合物中的重量百分比)进行测定，结果参加下表。
对比制备例4和5
采用与制备例4基本相同的方法制备抗癌药物释放组合物，不同之处在于，对比制备例4和5分别采用对比实施例1和2所制得的HA-mPEG和NAC-HA-mPEG代替NAC-HA-mPEG-DCA。
安全性试验
为评价所制得的抗癌药物释放组合物用于静脉注射给药是否安全，对所制备的抗癌药物释放组合物进行体外溶血性实验。取新西兰大白兔耳缘静脉血，除去纤维蛋白原，加入生理盐水洗涤、离心，制成2％(v/v)的混悬液；取2.5ml红细胞混悬液，以及2.5ml抗癌药物释放组合物，混合均匀；将混合液于37℃下孵育4小时后，在3000r/min的转速下离心10min，收集上清液，于540nm下测定样品的吸光度；另取生理盐水和蒸馏水，同法操作，分别作为阴性和阳性对照，计算溶血百分数；溶血百分数＝(样品吸光度-阴性对照吸光度)/(阳性对照吸光度-阴性对照吸光度)×100％。结果参见下表2。
表2.抗癌药物包载效果和所制得的抗癌药物释放组合物的安全性
实例
载体
PTX/mg
粒径/nm
包封率/％
载药量/％
溶血百分数/％
制备例4
实施例1
3
161.9
86.9
16.2
3.5
制备例5
实施例1
2
152.3
88.2
11.4
3.0
制备例6
实施例1
4
170.6
81.3
20.5
4.0
制备例7
实施例2
3
199.5
87.1
16.3
3.4
制备例8
实施例2
2
191.9
89.7
11.6
2.9
制备例9
实施例2
4
201.8
83.9
19.9
3.8
制备例10
实施例3
3
221.8
92.3
15.6
3.4
制备例11
实施例3
2
202.5
94.1
11.3
3.2
制备例12
实施例3
4
231.2
90.1
20.7
4.0
对比制备例4
对比实施例1
3
81.6
38.6
5.8
3.6
对比制备例5
对比实施例2
3
103.8
42.2
7.5
3.5
结果显示，实施例4至12中所有的制剂均有较高的包封率与载药量，并且粒径均小于250nm，随着初始载药量增高，包封率减小，而粒径有所增加。
另外，当紫杉醇浓度在0-200μg/ml的范围内，抗癌药物释放组合物的溶血活性几乎是可以忽略的，其溶血百分数不超过4.0％，说明该制剂在具有良好的溶血安全性。
抗肿瘤效果试验：
构建宫颈癌U14荷瘤小鼠模型，将荷瘤小鼠随机分为4组，每组6只，对每组动物分别进行标记编号并开始给药，分别给予生理盐水、制备例4和对比制备例4和5制得的抗癌药物释放组合物(剂量15mg/kg)(治疗组)，将该天记为给药第1天。制剂每3天尾静脉注射给药一次，连续给药4次。经4个给药周期，将动物处死，剥离瘤块，称重，计算抑瘤率。抑瘤率＝(生理盐水组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/生理盐水组平均瘤重×100％。结果显示，抗癌药物释放组合物的抑瘤率为69.8％，因此对宫颈癌具有明显的抑制肿瘤生长效果。
另外，本发明人使用H22肝癌小鼠进行实验。首先，将小鼠随机分为4组，每组6只，对每组动物分别进行标记编号。然后，开始给药，其中分别给予生理盐水(对照组)、制备例4和对比制备例4和5制得的抗癌药物释放组合物(剂量15mg/kg)(治疗组)，将该天记为给药第1天。每3天尾静脉注射给药一次，连续给药4次。经4个给药周期，将动物处死，剥离瘤块，称重，计算抑瘤率。结果发现，制备例4制得的抗癌药物释放组合物的平均抑瘤率为64.2％，因此对肝癌具有明显的抑制肿瘤生长效果。
另外，还使用Lewis肺癌荷瘤小鼠进行试验。其中将小鼠随机分为4组，每组6只，对每组动物分别进行标记编号。给药时，分别给予生理盐水、制备例4和对比制备例4和5制得的抗癌药物释放组合物(剂量15mg/kg)(治疗组)，将该天记为给药第1天。每3天尾静脉注射给药一次，连续给药4次。经4个给药周期，将动物处死，剥离瘤块，称重，计算抑瘤率。结果发现，制备例4制得的抗癌药物释放组合物的平均抑瘤率为71.4％，因此对肺癌具有明显的抑制肿瘤生长效果。
表3.抗癌药物释放组合物的抑瘤率
小鼠模型
制备例4抑瘤率/％
对比制备例4抑瘤率/％
对比制备例5抑瘤率/％
U14荷瘤小鼠
69.8％
16.7％
23.1％
H22肝癌小鼠
64.2％
14.5％
17.6％
Lewis肺癌荷瘤
71.4％
18.2％
19.9％
从上表3所示数据结果可以看出，本发明制得的抗癌药物释放组合物除了对U14小鼠肿瘤细胞具有显著的抑制效果(抑瘤率为69.8％)，对其他癌症细胞例如肝癌和肺癌也有显著的抑制作用，抑瘤率分别为64.2％和71.4％。
在此有必要指出的是，以上实施例和试验例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和理解，不能理解为对本发明的技术方案做进一步的限定，本领域技术人员作出的非突出实质性特征和显著进步的发明创造，仍然属于本发明的保护范畴。