阅读说明：本技术 Nt-3基因疗法的方法和材料 (Methods and materials for NT-3 gene therapy ) 是由 Z.撒亨克 于 2018-10-19 设计创作，主要内容包括：本披露内容涉及神经营养因子3(NT-3)多核苷酸的重组腺相关病毒(rAAV)递送。本披露内容提供了rAAV和使用该rAAV进行NT-3基因疗法以改善肌肉强度、刺激肌肉生长以及治疗肌肉消耗障碍如肌营养不良和腓骨肌萎缩神经病变的方法。(The present disclosure relates to recombinant adeno-associated virus (rAAV) delivery of neurotrophic factor 3(NT-3) polynucleotides. The present disclosure provides rAAV and methods of using the rAAV for NT-3 gene therapy to improve muscle strength, stimulate muscle growth, and treat muscle wasting disorders such as muscular dystrophy and peroneal atrophy neuropathy.)

NT-3基因疗法的方法和材料

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年10月20日提交的美国临时专利申请号62/574,828、于2018年5月25日提交的美国临时专利申请号62/676687和于2018年10月4日提交的美国临时专利申请号62/741,335的优先权，将这些申请的披露内容通过引用以其整体特此并入。

美国政府利益声明

本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)资助的授权号NS105986和U01-NS066914下由政府支持完成的。政府拥有本发明的某些权利。

通过引用并入序列表

本申请含有作为披露内容的单独部分的计算机可读形式的序列表(文件名：53122A_Seqlisting.txt；17,133字节-ASCII文本文件；创建于2018年10月18日)，将其通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本披露内容涉及神经营养因子3(NT-3)多核苷酸的重组腺相关病毒(rAAV)递送。本披露内容提供了rAAV和使用rAAV进行NT-3基因疗法以改善肌肉强度、刺激肌肉生长以及治疗神经病变和肌肉消耗障碍(如腓骨肌萎缩(Charcot-Marie-Tooth)神经病变)的方法。

背景技术

最近的研究已经证明，神经营养因子3(NT-3)是具有先前未知或未充分认识的特征的多能分子。除了对周围神经再生和许旺细胞(SC)的公认作用外，NT-3还具有抗炎和免疫调节作用。Yang等人,Mel Titer[Mel滴度],22(2):440-450(2014)。最近已经证明，NT-3能够减轻在人类中发生的慢性炎性脱髓鞘性周围神经障碍的啮齿动物模型中的自发性自身免疫性周围多发性神经病变。Yalvac等人,Gene therapy[基因疗法],23(1):95-102(2015)。

腓骨肌萎缩(CMT)神经病变是最常见的遗传性神经病变。CMT1包括五种类型的CMT，它们是由四种基因突变时引起的。此组包括大多数患有CMT的人。这些基因与SC和轴突周围的髓鞘相关，但它们以不同的方式相互作用，因此在表型上是异质的。CMT 1A型是在包含PMP22基因的染色体17p11上DNA重复的结果，这导致经典CMT1表型的发展。患者在生命的前二十年出现临床体征，导致需要行动辅助装置的严重残疾。在这些患者中，由于长期的轴索断裂和去神经支配作为慢性神经病变的一部分发生，周围神经再生不完全。NT-3是许旺细胞(SC)分泌的营养因子，其支持神经再生。去神经支配的SC存活的能力对于神经再生至关重要，因为SC既提供生长因子又提供基膜(即促进轴突生长的支架)。长期的去神经支配导致降低的再生能力，这与再生相关SC分子(神经营养因子(NTF)及其受体)的表达降低有关，从而导致去神经支配的SC萎缩、宾格内氏带(band of Bungner)断裂以及SC基膜支架的丧失。

先前的研究已经表明，在腓骨肌萎缩(CMT)神经病变的TremblerJ(TrJ)小鼠模型中，NT-3基因疗法不仅改善了神经再生，并伴有SC数量、有髓纤维密度和髓鞘厚度的增加，而且还增加了肌肉纤维直径，这展示在后肢的前室和后室肌肉中。Sahenk等人,Mol Ther[分子疗法],22(3):511-521(2014)。先前的研究已经表明，已知神经病变性表型会在骨骼肌中产生多种变化，包括从快速II型纤维转变为缓慢I型纤维。与野生型(WT)相比，在TrJ小鼠中，主要由快速型纤维构成的趾长伸肌(extensor digitalis longus)具有显著更高的慢纤维百分比，并且比目鱼肌中I型纤维的百分比随着年龄的增长而明显增加。Nicks等人,J Neuropathol Exp Neurol[神经病理学与实验神经学杂志],72(10):942-954(2013)。有趣的是，在人类和其他哺乳动物中，衰老还伴随着慢纤维比例的类似变化。Larsson L,MossR,J Physiol.[生理学杂志],472:595–614(1993)；Larsson等人,Am J Physiol.[美国生理学杂志],272:C638–C649(1997)。

CMT1A是作为常染色体显性病症遗传的，是最常见的CMT类型。通常，它是由包括周围髓鞘蛋白22(PMP22)基因的17p11.2处1.5Mb重复引起的，该重复是由同源染色体的不等交换产生的(1)。这是一种缓慢进展性疾病，没有已知的治疗方法。症状最常开始于前二十年。存在高弓足和锤状趾。需要行动辅助装置，如踝足矫形器。较少见的严重儿童病例可能依赖轮椅或呼吸机。通常，90％的患者在尺神经中具有16与35m/s之间或更小的运动神经传导速度(NCV)(2)。即使遗传缺陷主要涉及许旺细胞(SC)，但临床电生理学表现是一种长度依赖性的感觉运动性脱髓鞘性神经病变。该临床表现受由许旺细胞(SC)-轴突相互作用受损导致的轴突变性的显著影响(3)。

目前尚无针对这种病症的治疗。强烈推荐抗坏血酸补充剂提供帮助，但多项研究均未显示出益处。低剂量(1-2g/天)(4-6)和高剂量疗法(3-4g/天)都未被证明是有益的(6,7)。最初，NT-3的人体试验显示了治疗24周后的临床功效，其伴随治疗后的腓肠神经活检中有髓神经纤维数量的增加(8)。在Tr^J小鼠中，皮下NT-3治疗改善了轴突再生并增强了髓鞘形成。然而，NT-3的短血清半衰期被证明是持续皮下给予的主要障碍，并且该产品已停止使用。

许多肌肉骨骼疾病已显示导致肌肉强度下降。这些包括但不限于遗传性或隐性肌病(如肌营养不良)、肌肉消耗疾病(如可能由基础疾病(如获得性免疫缺陷疾病(AIDS)、类风湿性关节炎、癌症、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和肝硬化)导致的恶病质)、肌肉萎缩或衰弱的病症(如可能由衰老导致的少肌症)、长期废用(如瘫痪、昏迷、长期卧床休息和ICU停留)、手术(如关节置换手术)引起的无力、药源性肌病和横纹肌溶解。这些疾病和病症的肌肉病理是部分或全部由免疫、炎性和纤维化反应的组合介导的。能够阻断这些反应和/或刺激受损组织再生的药剂将能够减缓或逆转这些障碍的疾病进展。

腺相关病毒(AAV)是复制缺陷型细小病毒，其单链DNA基因组的长度为约4.7kb，包括145个核苷酸反向末端重复序列(ITR)。存在多种AAV血清型。AAV血清型的基因组的核苷酸序列是已知的。例如，AAV-1的完整基因组在GenBank登录号NC_002077中提供；AAV-2的完整基因组在GenBank登录号NC_001401和Srivastava等人,J.Virol.[病毒学杂志],45:555-564{1983)中提供；AAV-3的完整基因组在GenBank登录号NC_1829中提供；AAV-4的完整基因组在GenBank登录号NC_001829中提供；AAV-5基因组在GenBank登录号AF085716中提供；AAV-6的完整基因组在GenBank登录号NC_001862中提供；AAV-7和AAV-8基因组的至少一部分分别在GenBank登录号AX753246和AX753249中提供；AAV-9基因组在Gao等人,J.Virol.[病毒学杂志],78:6381-6388(2004)中提供；AAV-10基因组在Mol.Ther.[分子疗法],13(1):67-76(2006)中提供；并且AAV-11基因组在Virology[病毒学],330(2):375-383(2004)中提供。指导病毒DNA复制(rep)、衣壳化/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列被包含在AAV ITR中。三个AAV启动子(因其相对图谱位置命名为p5、p19和p40)驱动编码rep和cap基因的两个AAV内部开放阅读框的表达。这两个rep启动子(p5和p19)加上单个AAV内含子的差异剪接(在核苷酸2107和2227处)，导致从rep基因产生四种rep蛋白(rep78、rep68、rep52和rep40)。Rep蛋白具有最终负责复制病毒基因组的多种酶促特性。cap基因是由p40启动子表达的，并且它编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。替代性的剪接和非共有的翻译起始位点负责产生三种相关的衣壳蛋白。单个共有聚腺苷酸化位点位于AAV基因组的图谱位置95。AAV的生命周期和遗传学综述于Muzyczka,Current Topics in Microbiology andImmunology[微生物学和免疫学的最新论题],158:97-129(1992)。

AAV具有独特的特征，使其可作为载体，以用于例如在基因疗法中将外来DNA递送至细胞。培养中细胞的AAV感染是非致细胞病变的，并且人类和其他动物的自然感染是沉默且无症状的。此外，AAV感染许多哺乳动物细胞，从而有可能在体内靶向许多不同的组织。此外，AAV转导缓慢分裂和非分裂的细胞，并且可以作为转录活性核附加体(染色体外元件)在这些细胞的生命周期中基本上持续存在。AAV前病毒基因组作为质粒中的克隆DNA具有感染性，这使得重组基因组的构建是可行的。此外，由于指导AAV复制、基因组衣壳化和整合的信号被包含在AAV基因组的ITR中，因此可以用外来DNA替代基因组的内部大约4.3kb(编码复制和结构衣壳蛋白，rep-cap)的部分或全部。rep和cap蛋白可以以反式的形式提供。AAV的另一个显著特征是它是一种非常稳定且强大的病毒。它轻松承受用于灭活腺病毒的条件(56℃至65℃持续数小时)，从而使AAV的冷藏变得不那么重要。AAV甚至可以冻干。最后，AAV感染的细胞对重复感染没有抵抗力。

需要开发针对CMT神经病变和其他肌肉消耗障碍的疗法。本发明提供了递送NT-3以治疗CMT神经病变和其他肌肉消耗障碍的基因治疗方法。

发明内容

本披露内容提供了在受试者中刺激肌肉生长的方法。该方法包括向有需要的受试者给予治疗有效量的神经营养因子-3(NT-3)、前NT-3或其有效片段，或者编码NT-3、前NT-3或其有效片段的核酸。本披露内容描述了NT-3的新颖作用，即其直接影响神经源性肌肉中蛋白质合成和代谢重构的能力。

在本披露内容的各个实施例中，肌内给予NT-3、前NT-3或其有效片段，或者编码本披露内容的NT-3或其有效片段的核酸。

在本披露内容的任何方法中，使用病毒载体给予编码NT-3或其有效片段的核酸。在某些实施例中，该病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。在相关的实施例中，编码本披露内容的NT-3或其有效片段的核酸与肌肉特异性启动子(如三重肌肉特异性肌酸激酶启动子)可操作地连接。在各个实施例中，编码本披露内容的NT-3或其有效片段的核酸包含SEQ IDNO:1。

本披露内容提供了核酸，其以从5'至3'的顺序包含：(i)第一AAV2反向末端重复序列(ITR)；(ii)SEQ ID NO:11的核苷酸147-860所列出的肌肉肌酸激酶启动子/增强子序列；(iii)编码人NT-3多肽的核苷酸序列；和(iv)第二AAV2 ITR序列；其中该人NT-3多肽具有氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:2至少90％相同或与SEQ ID NO:2为100％相同，或者由与SEQ ID NO:11的核苷酸1077-1850为90％相同或与SEQ ID NO:11的核苷酸1077-1850为100％相同的核苷酸序列编码。

在一些实施例中，本披露内容的核酸进一步包含在该启动子/增强子的3’端处，SEQ ID NO:11的核苷酸892-1024所列出的嵌合内含子。另外，本披露内容的核酸可进一步包含在所述编码人NT-3多肽的核苷酸序列的3'端处，SEQ ID NO:11的核苷酸1860-2059所列出的SV40聚腺苷酸化信号。

本披露内容的任何核酸可以包含一个或多个反向末端重复(ITR)序列。例如，该核酸可以包含SEQ ID NO:11的核苷酸7-112所列出的第一ITR和/或SEQ ID NO:11的核苷酸2121-2248所列出的第二ITR。

在一些实施例中，这些核酸包含scAAV1.tMCK.NTF3基因组，其与SEQ ID NO:11所列出的核苷酸序列至少90％相同。

本披露内容还提供了包含本披露内容的任何核酸的重组腺相关病毒颗粒(rAAV)，其中该rAAV具有感染性。这些rAAV颗粒可以是任何rAAV血清型，如AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、或AAVrh.74。另外，在本发明的任何rAAV颗粒中，rAAV基因组中的AAVDNA来自AAV-1。

本披露内容还提供了包含本披露内容的rAAV和药学上可接受的载体的组合物。例如，配制这些组合物以在有需要的受试者中治疗肌肉消耗障碍或神经病变，或者配制这些组合物以在有需要的受试者中刺激肌肉生长。

在一个实施例中，本披露内容提供了在有需要的人类受试者中治疗肌肉消耗障碍或神经病变的方法，该方法包括向该人类受试者给予编码该NT-3多肽的核酸；其中a)该核酸包含与SEQ ID NO:1的核苷酸序列90％相同的核苷酸序列；b)该核酸包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列；c)该核酸包含编码与SEQ ID NO:2至少90％相同或与SEQ ID NO:2为100％相同的氨基酸序列的核酸序列，d)编码该NT-3多肽的核酸是本披露内容的任何核酸，e)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，并且将该rAAV以导致持续表达低浓度NT-3多肽的剂量来给予，f)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，给予途径是肌内途径，并且给予的rAAV的剂量为约1.5x1012vg/kg至约6.5x1012vg/kg，g)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，给予途径是肌内途径，并且给予的rAAV的剂量为约2x1012vg/kg至约6x1012vg/kg，h)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，给予途径是肌内途径，并且给予的rAAV的剂量为约2x1012vg/kg，i)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，给予途径是肌内途径，并且给予的rAAV的剂量为约4x1012vg/kg，j)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，给予途径是肌内途径，并且给予的rAAV的剂量为约6x1012vg/kg，k)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，给予途径是肌内注射，浓度为约2x1013vg/ml，使用约0.5至1ml的3至6次注射/块肌肉来给予，或l)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，给予途径是肌内注射，浓度为约2x10¹³vg/ml，使用多次注射以总体积约5至14ml来给予。

在另一个实施例中，本披露内容提供了在有需要的人类受试者中改善肌肉强度或刺激肌肉生长的方法，其包括向该人类受试者给予编码该NT-3多肽的核酸的步骤；其中a)该核酸包含与SEQ ID NO:1的核苷酸序列90％相同的核苷酸序列；b)该核酸包含SEQ IDNO:1的核苷酸序列；c)该核酸包含编码与SEQ ID NO:2至少90％相同或与SEQ ID NO:2为100％相同的氨基酸序列的核酸序列，d)编码该NT-3多肽的核酸是本披露内容的任何核酸，e)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，并且将该rAAV以导致持续表达低浓度NT-3多肽的剂量来给予，f)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，给予途径是肌内途径，并且给予的rAAV的剂量为约1.5x1012vg/kg至约6.5x1012vg/kg，g)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，给予途径是肌内途径，并且给予的rAAV的剂量为约2x1012vg/kg至约6x1012vg/kg，h)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，给予途径是肌内途径，并且给予的rAAV的剂量为约2x1012vg/kg，i)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，给予途径是肌内途径，并且给予的rAAV的剂量为约4x1012vg/kg，j)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，给予途径是肌内途径，并且给予的rAAV的剂量为约6x1012vg/kg，k)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，给予途径是肌内注射，浓度为约2x1013vg/ml，使用约0.5至1ml的3至6次注射/块肌肉来给予，或l)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，给予途径是肌内注射，浓度为约2x10¹³vg/ml，使用多次注射以总体积约5至14ml来给予。

在本披露内容的任何方法中，将该核酸使用病毒载体如腺相关病毒载体来给予。本披露内容的任何方法都可以用与肌肉特异性启动子如肌肉特异性肌酸激酶(MCK)启动子可操作地连接的核酸来执行。另外，本披露内容的任何方法都可以用包含SEQ ID NO:11所列出的NT-3基因盒的scAAV1.tMCK.NTF3来执行。

在一些实施例中，本披露内容提供了使用人神经营养因子-3基因(NTF3)的基因治疗方法，该基因使用scAAV1载体(自身互补的AAV1血清型)，处于肌肉特异性启动子tMCK的控制下。具体地，本披露内容提供了治疗被诊断患有肌肉消耗障碍或神经病变的受试者的方法，该方法包括给予表达NT-3的AAV载体。具体地，这些方法包括经由在腓肠肌和胫骨前肌中的肌内(IM)注射给予构建体scAAV1.tMCK.NTF3。例如，表达NT-3的AAV载体，例如scAAV1.tMCK.NTF3的肌内递送启动NT-3的局部产生并将其分泌到循环中，从而促进神经髓鞘形成和纤维再生，导致CMT疾病表型的稳定。更具体地，本披露内容提供了以约2x10¹²vg/kg的剂量或以约6x10¹²vg/kg的剂量给予scAAV1.tMCK.NTF3的方法。该scAAV1.tMCK.NTF3包含SEQ ID NO:11所列出的NT-3基因盒。

本披露内容还提供了作为替代基因疗法给予表达NT-3的AAV载体以治疗肌肉消耗障碍或神经病变的方法。NT-3具有短半衰期，并且本披露内容的方法包括给予AAV载体以用于持续释放NT-3蛋白，即使受试者表达内源性NT-3蛋白。作为替代基因疗法，该AAV载体的给予通过肌肉细胞的持续分泌提供NT-3蛋白的持续递送。这种连续的持续低循环NT-3蛋白水平提供具有最低毒性风险的治疗效果。当与重复的纯化NT-3肽注射相比时，通过基因疗法全身性产生NT-3也是一种更方便且更具成本效益的治疗选择。

本披露内容提供了在有需要的人类受试者中治疗肌肉消耗障碍或神经病变的方法，这些方法包括向该人类受试者给予一定剂量的重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3的步骤，该剂量导致低浓度的NT-3蛋白的持续表达。

本披露内容还提供了在有需要的人类受试者中刺激肌肉生长的方法，这些方法包括向该人类受试者给予一定剂量的重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3的步骤，该剂量导致低浓度的NT-3蛋白的持续表达。

在一个实施例中，本披露内容提供了在有需要的人类受试者中治疗肌肉消耗障碍或神经病变的方法，这些方法包括向该人类受试者给予重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3的步骤，其中该给予途径是肌内途径，并且给予的rAAV的剂量为约1.0x10¹²vg/kg至约7x10¹²vg/kg、或约1.5x10¹²vg/kg至约6.5x10¹²vg/kg、或约2x10¹²vg/kg至约6x10¹²vg/kg。

在另一个实施例中，

本披露内容提供了在有需要的人类受试者中治疗肌肉消耗障碍或神经病变的方法，其包括向该人类受试者给予重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3的步骤，其中该给予途径是肌内途径，并且给予的rAAV的剂量为约1.0x10¹²vg/kg、或约1.5x10¹²vg/kg、或约2x10¹²vg/kg、或约3x10¹²vg/kg、或约4x10¹²vg/kg、或约5x10¹²vg/kg、或约6x10¹²vg/kg、或约7x10¹²vg/kg、或约8x10¹²vg/kg、或约9x10¹²vg/kg、或约1x10¹³vg/kg。

在另一个实施例中，本披露内容提供了在有需要的人类受试者中治疗肌肉消耗障碍或神经病变的方法，其包括向该人类受试者给予重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3的步骤，其中该给予途径是以约1x10¹³vg/ml的浓度肌内注射。例如，将rAAV分别使用3至6次注射/块肌肉来给予，例如每次注射体积将为0.5至1ml，其中将总计5mL至14mL的载体给予至每条腿中腓肠肌和胫骨前肌的内侧头和外侧头。

在示例性的实施例中，本披露内容提供了在有需要的人类受试者中治疗肌肉消耗障碍或神经病变的方法，其包括向该人类受试者给予重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3的步骤，其中该给予途径是肌内注射，浓度为约2x10¹³vg/ml，分别使用3至6次注射/块肌肉来给予(每次注射体积将为0.5至1ml)。将总计5mL至14mL的载体给予至每条腿中腓肠肌和胫骨前肌的内侧头和外侧头。

在一个实施例中，本披露内容提供了在有需要的人类受试者中改善肌肉强度或刺激肌肉生长的方法，该方法包括向该人类受试者给予重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3的步骤，其中该给予途径是肌内途径，并且给予的rAAV的剂量为约1.0x10¹²vg/kg至约7x10¹²vg/kg、或约1.5x10¹²vg/kg至约6.5x10¹²vg/kg、或约2x10¹²vg/kg至约6x10¹²vg/kg。

在另一个实施例中，本披露内容提供了在有需要的人类受试者中改善肌肉强度或刺激肌肉生长的方法，该方法包括向该人类受试者给予重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3的步骤，其中该给予途径是肌内途径，并且给予的rAAV的剂量为约1.0x10¹²vg/kg、或约1.5x10¹²vg/kg、或约2x10¹²vg/kg、或约3x10¹²vg/kg、或约4x10¹²vg/kg、或约5x10¹²vg/kg、或约6x10¹²vg/kg、或约7x10¹²vg/kg、或约8x10¹²vg/kg、或约9x10¹²vg/kg、或约1x10¹³vg/kg。

在示例性的实施例中，本披露内容提供了在有需要的人类受试者中改善肌肉强度或刺激肌肉生长的方法，该方法包括向该人类受试者给予重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3的步骤，其中该给予途径是以约1x10¹³vg/ml的浓度肌内注射。例如，将rAAV分别使用3至6次注射/块肌肉来给予，例如每次注射体积将为0.5至1ml，其中将总计5mL至14mL的载体给予至每条腿中腓肠肌和胫骨前肌的内侧头和外侧头。

在示例性的实施例中，本披露内容提供了在有需要的人类受试者中改善肌肉强度或刺激肌肉生长的方法，该方法包括向该人类受试者给予重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3的步骤，其中该给予途径是肌内注射，浓度为约1x10¹³vg/ml，分别使用3至6次注射/块肌肉以低剂量(每名患者2x10¹²vg/kg)和高剂量(每名患者6x10¹²vg/kg)来给予(每次注射体积将为0.5至1ml)。将总计5mL至14mL的载体给予至每条腿中腓肠肌和胫骨前肌的内侧头和外侧头。

在本披露内容的任何方法中，其中scAAV1.tMCK.NTF3的给予途径是向腓肠肌和胫骨前肌的内侧头和外侧头的肌内双侧注射。另外，在本发明的任何方法中，scAAV1.tMCK.NTF3的给予导致受试者中的上肢或下肢的肌肉强度得到改善，并且例如肌肉强度的改善被测量为在CMT儿科量表(CMTPeds)上的综合得分的降低。另外，在本发明的任何方法中，scAAV1.tMCK.NTF3的给予导致在两年时间段内疾病进展的减少或停止。疾病进展是由CMTPedS来测量的。

还使用如下方式来测量肌肉强度：肌电图、手持肌测仪、固定系统肌测仪、手动肌肉测试、和/或功能/活动测试如Jebsen测试，以及\评价受试者完成特定任务所需时间的定时测试，如6分钟步行测试、从地面定时上升、10米步行/跑步、定时爬升4个台阶和定时下降4个台阶。

在本披露内容的一方面，在任何方法中，该受试者患有遗传性神经病变(如腓骨肌萎缩(CMT)神经病变，例如CMT1A、CMT2K、CMT4A、CMTRIA)，以及由常染色体隐性基因变体或常染色体显性基因变体或X连锁基因变体引起的轴突和脱髓鞘神经病变。该遗传性神经病变可能是由表1中提供的任何基因变体引起的。此外，该遗传性神经病变可以是由转甲状腺素蛋白(TTR)基因突变，如以下基因变体：Val30Met、Ile107Val和Ser77Tyr引起的转甲状腺素蛋白淀粉样神经病变。

在本披露内容的另一方面，在任何方法中，该受试者患有具有轴突丧失和/或神经再生受损的获得性神经病变。该获得性神经病变是由已知引起神经病变的任何障碍或疾病引起的周围神经病变。例如，该受试者患有由以下引起的周围神经病变：糖尿病、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、甲状腺障碍(如甲状腺功能减退)、低血糖症、尿毒症、肾功能不全、肝功能障碍、肝衰竭、红细胞增多症、结缔组织障碍、癌症、莱姆病、乳糜泻、麻风病、卟啉症、舍格伦综合征、脊髓灰质炎、肢端肥大症、脂质/糖脂代谢障碍、西尼罗河综合征、淀粉样变性、线粒体障碍、异常蛋白血症障碍(dysproteinemic disorders)如意义未明的单克隆丙种球蛋白病(monoclonal gammapathy of undetermined significance，MGUS)或POEMS综合征。该受试者患有营养/维生素缺乏症，如维生素B₁₂缺乏症、维生素E缺乏症或铜缺乏症。

在本披露内容的另一方面，在本文所述的任何方法中，该受试者患有自身免疫性周围多发性神经病变、急性炎性脱髓鞘性多神经根神经病变(AIDP)、慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经病变(CIDP)、血管炎性多发性单神经炎、神经旁病变(paraneuropathy)、特发性神经节炎、肌萎缩侧索硬化、多灶性运动传导阻滞神经病变或下运动神经元综合征。

该获得性神经病变可以是中毒性神经病变。例如，中毒性神经病变是以下的毒性作用的结果：处方药如氯霉素、胆碱喹啉、秋水仙碱、双硫仑、依那西普、乙胺丁醇、金(gold)、羟氯喹、硝基呋喃妥因、甲硝唑、司他夫定、扎西他滨、英利昔单抗、来氟米特、沙利度胺，或化疗剂如顺铂、阿糖胞苷、硼替佐米、多西他赛、来那度胺、Misondiazole、奥沙利铂、紫杉醇、丙卡巴肼、苏拉明、沙利度胺、长春碱或长春新碱，或抗酒精药如双硫仑，或抗惊厥剂如苯妥英或狄兰汀，或心脏或血压药物如他汀类、胺碘酮、肼屈嗪、普鲁卡因胺、哌克昔林，或抗生素如氟喹诺酮、异烟肼、西普罗、左氧氟沙星、灭滴灵或甲硝唑，或皮肤病治疗如达普松。该中毒性神经病变也可能是由长期酗酒或维生素B₆毒性引起的。

在本披露内容的另一方面，在本文所述的任何方法中，该受试者是患有获得性神经病变的癌症患者。例如，该癌症患者发展出与营养缺乏、化疗副作用和/或副肿瘤综合征有关的神经病变。

在本披露内容的又另一方面，在任何方法中，该受试者是患有获得性神经病变的外科患者。例如，该外科患者在进行减肥手术、多次整形外科手术或多次“卡压神经”手术后发展出神经病变。

在本披露内容的另一方面，在任何方法中，该受试者患有遗传性肌病、神经肌肉疾病、肌肉萎缩、药源性肌病、少肌症、恶病质、II型肌纤维萎缩、遗传决定的肌营养不良、年龄相关性肌肉萎缩或获得性自身免疫性原发性肌肉障碍。

在本披露内容的另一方面，在任何方法中，受试者患有杜氏肌营养不良，贝克肌营养不良，强直性肌营养不良，肌聚糖病(sarcoglycanopathy)，肌强直性营养不良，埃-德二氏肌营养不良(Emery-Dreifuss muscular dystrophy)，先天性肌营养不良，分区蛋白缺陷性先天性肌营养不良，贝特莱姆肌病，乌尔里奇先天性肌营养不良(Ullrich congenitalmuscular dystrophy)，面肩肱型肌营养不良，脊柱肌营养不良，刚性脊柱肌营养不良，远端肌营养不良，眼咽肌营养不良，先天性肌营养不良(MDC)1A、1B、1C和1D；肢带型肌营养不良(LGMD)1A、1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2H、2I、2J、2K、2L、2M、2N、2O和2Q；肌肉眼脑疾病；福山沃克瓦堡综合征(Fukuyama Walker Warburg Syndrome)；肌无力综合征；先天性肌肉衰弱；包涵体肌病；包涵体肌炎；皮肌炎；中央核肌病；Myoshi肌病；线粒体肌病；杆状体肌病；Nonaka肌病；重症肌无力；或多肌炎。

在一个实施例中，本披露内容提供了治疗有效量的神经营养因子-3(NT-3)、前NT-3或其有效片段或者编码NT-3、前NT-3或其有效片段的核酸用于制造在受试者中刺激肌肉生长的药物的用途。例如，该药物被配制用于肌内给予。

在示例性的实施例中，该药物包含编码NT-3、前NT-3或其有效片段的核酸，其中该核酸在病毒载体中。在相关的实施例中，该病毒载体是腺相关病毒载体。在各个实施例中，该核酸与肌肉特异性启动子如三重肌肉特异性肌酸激酶启动子可操作地连接。在各个实施例中，该核酸包含SEQ ID NO:1。

本发明还提供了编码该NT-3多肽的核酸用于制造在人类受试者中治疗肌肉消耗障碍或神经病变的药物的用途，其中：a)该核酸包含与SEQ ID NO:1的核苷酸序列90％相同的核苷酸序列；b)该核酸包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列；c)该核酸包含编码与SEQ ID NO:2至少90％相同或与SEQ ID NO:2为100％相同的氨基酸序列的核酸序列，d)编码该NT-3多肽的核酸是本披露内容的任何核酸，e)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，并且该rAAV处于导致持续表达低浓度NT-3多肽的剂量，f)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，该药物被配制用于肌内给予途径，并且该rAAV的剂量为约1.5x1012vg/kg至约6.5x1012vg/kg，g)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，该药物被配制用于肌内给予途径，并且该rAAV的剂量为约2x1012vg/kg至约6x1012vg/kg，h)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，该药物被配制用于肌内给予途径，并且该rAAV的剂量为约2x1012vg/kg，i)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，该药物被配制用于肌内给予途径，并且该rAAV的剂量为约4x1012vg/kg，j)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，该药物被配制用于肌内给予途径，并且给予的rAAV的剂量为约6x1012vg/kg，k)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，该药物被配制用于肌内注射，浓度为约2x1013vg/ml，使用约0.5至1ml的3至6次注射/块肌肉来给予，或l)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，该药物被配制用于肌内注射，浓度为约2x10¹³vg/ml，使用多次注射以总体积约5至14ml来给予。

本披露内容还提供了一定剂量的编码该NT-3多肽的核酸用于制造在人类受试者中改善肌肉强度或刺激肌肉生长的药物的用途，其中：a)该核酸包含与SEQ ID NO:1的核苷酸序列90％相同的核苷酸序列；b)该核酸包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列；c)该核酸包含编码与SEQ ID NO:2至少90％相同或与SEQ ID NO:2为100％相同的氨基酸序列的核酸序列，d)编码该NT-3多肽的核酸是本披露内容的任何核酸，e)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，并且该rAAV处于导致持续表达低浓度NT-3多肽的剂量，f)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，该组合物被配制用于肌内给予途径，并且该rAAV的剂量为约1.5x1012vg/kg至约6.5x1012vg/kg，g)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，该药物被配制用于肌内给予途径，并且该rAAV的剂量为约2x1012vg/kg至约6x1012vg/kg，h)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，该药物被配制用于肌内给予途径，并且该rAAV的剂量为约2x1012vg/kg，i)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，该药物被配制用于肌内给予途径，并且该rAAV的剂量为约4x1012vg/kg，j)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，该药物被配制用于肌内给予途径，并且给予的rAAV的剂量为约6x1012vg/kg，k)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，该药物被配制用于肌内注射，浓度为约2x1013vg/ml，使用约0.5至1ml的3至6次注射/块肌肉来给予，或l)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，该药物被配制用于肌内注射，浓度为约2x10¹³vg/ml，使用多次注射以总体积约5至14ml来给予。

例如，本披露内容的任何药物可以包含使用病毒载体如腺相关病毒载体进行配制以用于给予的核酸。另外，本披露内容的任何药物可以包含与肌肉特异性启动子可操作地连接的核酸，例如该肌肉特异性启动子是肌肉特异性肌酸激酶启动子(MCK)。在另一个实施例中，在任何药物或本披露内容中，scAAV1.tMCK.NTF3包含SEQ ID NO:11所列出的NT-3基因盒。在一个实施例中，本披露内容提供了重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3用于制备在有需要的人类受试者中治疗肌肉消耗障碍或神经病变的药物的用途，其中该药物导致低浓度的NT-3蛋白的持续表达。

在另一个实施例中，本披露内容提供了重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3用于制备在有需要的人类受试者中刺激肌肉生长的药物的用途，其中该剂量导致低浓度的NT-3蛋白的持续表达。

在一个实施例中，本披露内容提供了重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3用于制备在有需要的人类受试者中治疗肌肉消耗障碍或神经病变的药物的用途，其中该药物被配制用于肌内给予途径，并且其中该药物包含约1.0x10¹²vg/kg至约7x10¹²vg/kg、或约1.5x10¹²vg/kg至约6.5x10¹²vg/kg、或约2x10¹²vg/kg至约6x10¹²vg/kg的rAAV剂量。

在另一个实施例中，本披露内容提供了重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3用于制备在有需要的人类受试者中治疗肌肉消耗障碍或神经病变的药物的用途，其中该药物被配制用于肌内给予途径，并且其中该药物包含约1.0x10¹²vg/kg、或约1.5x10¹²vg/kg、或约2x10¹²vg/kg、或约3x10¹²vg/kg、或约4x10¹²vg/kg、或约5x10¹²vg/kg、或约6x10¹²vg/kg、或约7x10¹²vg/kg、或约8x10¹²vg/kg、或约9x10¹²vg/kg、或约1x10¹³vg/kg的rAAV剂量。

在另一个实施例中，本披露内容提供了重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3用于制备在有需要的人类受试者中治疗肌肉消耗障碍或神经病变的药物的用途，其中该药物被配制用于肌内给予途径，并且其中该药物包含约2x10¹³vg/ml的rAAV浓度。例如，将该药物分别使用3至6次注射/块肌肉来给予至每条腿中腓肠肌和胫骨前肌的内侧头和外侧头，例如每次注射体积将为0.5至1ml，其中将总计5mL至14mL的载体给予至每条腿中腓肠肌和胫骨前肌的内侧头和外侧头。

在示例性的实施例中，本披露内容提供了重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3用于制备在有需要的人类受试者中治疗肌肉消耗障碍或神经病变的药物的用途，其中该药物被配制用于肌内给予途径，并且其中该药物包含约1x10¹³vg/ml的rAAV剂量，分别使用3至6次注射/块肌肉来给予(每次注射体积将为0.5至1ml)。将总计5mL至14mL的载体给予至每条腿中腓肠肌和胫骨前肌的内侧头和外侧头。

在一个实施例中，本披露内容提供了重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3用于制备在有需要的人类受试者中改善肌肉强度或刺激肌肉生长的药物的用途，其中该药物被配制用于肌内给予途径，并且其中该药物包含约1.0x10¹²vg/kg至约7x10¹²vg/kg、或约1.5x10¹²vg/kg至约6.5x10¹²vg/kg、或约2x10¹²vg/kg至约6x10¹²vg/kg的rAAV剂量。

在另一个实施例中，本披露内容提供了重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3用于制备在有需要的人类受试者中改善肌肉强度或刺激肌肉生长的药物的用途，其中该药物被配制用于肌内给予途径，并且其中该药物包含约1.0x10¹²vg/kg、或约1.5x10¹²vg/kg、或约2x10¹²vg/kg、或约3x10¹²vg/kg、或约4x10¹²vg/kg、或约5x10¹²vg/kg、或约6x10¹²vg/kg、或约7x10¹²vg/kg、或约8x10¹²vg/kg、或约9x10¹²vg/kg、或约1x10¹³vg/kg的rAAV剂量。

在另一个实施例中，本披露内容提供了重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3用于制备在有需要的人类受试者中改善肌肉强度或刺激肌肉生长的药物的用途，其中该药物被配制用于肌内给予途径，并且其中该药物包含约2x10¹³vg/ml的rAAV浓度，以低剂量(每名患者2x10¹²vg/kg)和高剂量(每名患者6x10¹²vg/kg)来给予。在一些实施例中，将该药物分别使用3至6次注射/块肌肉来给予至每条腿中腓肠肌和胫骨前肌的内侧头和外侧头，例如每次注射体积为0.5至1ml。总计5mL至14mL的载体将被给予至每条腿中腓肠肌和胫骨前肌的内侧头和外侧头。

在示例性的实施例中，本披露内容提供了重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3用于制备在有需要的人类受试者中改善肌肉强度或刺激肌肉生长的药物的用途，其中该药物被配制用于肌内给予途径，并且其中该药物包含约2x10¹³vg/ml的rAAV浓度，分别使用3至6次注射/块肌肉以低剂量(每名患者2x10¹²vg/kg)和高剂量(每名患者6x10¹²vg/kg)来给予(每次注射体积将为0.5至1ml)。总计5mL至14mL的载体将被给予至每条腿中腓肠肌和胫骨前肌的内侧头和外侧头。

在本披露内容的任何用途中，该药物被配制用于肌内双侧注射至腓肠肌和胫骨前肌的内侧头和外侧头。另外，在本发明的任何用途中，该药物导致该受试者中的上肢或下肢的肌肉强度得到改善，并且例如肌肉强度的改善被测量为在CMT儿科量表(CMTPedS)上的综合得分的降低。另外，在本发明的任何用途中，该药物导致在两年时间段内疾病进展的减少或停止。疾病进展是由CMTPedS来测量的。

在本披露内容的一方面，在本披露内容的任何用途中，该受试者患有遗传性神经病变(如腓骨肌萎缩(CMT)神经病变，例如CMT1A、CMT2K、CMT4A、CMTRIA)，以及由常染色体隐性基因变体或常染色体显性基因变体或X连锁基因变体引起的轴突和脱髓鞘神经病变。该遗传性神经病变可能是由表1中提供的任何基因变体引起的。此外，该遗传性神经病变可以是由转甲状腺素蛋白(TTR)基因突变，如以下基因变体：Val30Met、Ile107Val和Ser77Tyr引起的转甲状腺素蛋白淀粉样神经病变。

在本披露内容的另一方面，在本发明的任何方法中，该受试者患有具有轴突丧失和/或神经再生受损的获得性神经病变。该获得性神经病变是由引起神经病变的任何障碍或疾病引起的周围神经病变。例如，该受试者患有由以下引起的周围神经病变：糖尿病、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、甲状腺障碍(如甲状腺功能减退)、低血糖症、尿毒症、肾功能不全、肝功能障碍、肝衰竭、红细胞增多症、结缔组织障碍、癌症、莱姆病、乳糜泻、麻风病、卟啉症、舍格伦综合征、脊髓灰质炎、肢端肥大症、脂质/糖脂代谢障碍、西尼罗河综合征、淀粉样变性、线粒体障碍、异常蛋白血症障碍如意义未明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)或POEMS综合征。该受试者可以患有营养/维生素缺乏症，如维生素B₁₂缺乏症、维生素E缺乏症或铜缺乏症。

另外，在本披露内容的任何用途中，该受试者患有自身免疫性周围多发性神经病变、急性炎性脱髓鞘性多神经根神经病变(AIDP)、慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经病变(CIDP)、血管炎性多发性单神经炎、神经旁病变、特发性神经节炎、肌萎缩侧索硬化、多灶性运动传导阻滞神经病变或下运动神经元综合征。

该获得性神经病变是中毒性神经病变。例如中毒性神经病变是以下的毒性作用的结果：处方药如氯霉素、胆碱喹啉、秋水仙碱、双硫仑、依那西普、乙胺丁醇、金(gold)、羟氯喹、硝基呋喃妥因、甲硝唑、司他夫定、扎西他滨、英利昔单抗、来氟米特、沙利度胺，或化疗剂如顺铂、阿糖胞苷、硼替佐米、多西他赛、来那度胺、Misondiazole、奥沙利铂、紫杉醇、丙卡巴肼、苏拉明、沙利度胺、长春碱或长春新碱，或抗酒精药如双硫仑，或抗惊厥剂如苯妥英或狄兰汀，或心脏或血压药物如他汀类、胺碘酮、肼屈嗪、普鲁卡因胺、哌克昔林，或抗生素如氟喹诺酮、异烟肼、西普罗、左氧氟沙星、灭滴灵或甲硝唑，或皮肤病治疗如达普松。该中毒性神经病变可能是由长期酗酒或维生素B₆毒性引起的。

在另一方面，在本披露内容的任何用途中，该受试者是患有获得性神经病变的癌症患者。例如，该癌症患者发展出与营养缺乏、化疗副作用和/或副肿瘤综合征有关的神经病变。

在又另一方面，在本披露内容的任何用途中，该受试者是患有获得性神经病变的外科患者。例如，该外科患者在进行减肥手术、多次整形外科手术或多次“卡压神经”手术后发展出神经病变。

在另一方面，在本披露内容的任何用途中，该受试者患有遗传性肌病、神经肌肉疾病、肌肉萎缩、药源性肌病、少肌症、恶病质、II型肌纤维萎缩、遗传决定的肌营养不良、年龄相关性肌肉萎缩或获得性自身免疫性原发性肌肉障碍。

在另一方面，在本披露内容的任何用途中，受试者患有杜氏肌营养不良，贝克肌营养不良，强直性肌营养不良，肌聚糖病(sarcoglycanopathy)，肌强直性营养不良，埃-德二氏肌营养不良(Emery-Dreifuss muscular dystrophy)，先天性肌营养不良，分区蛋白缺陷性先天性肌营养不良，贝特莱姆肌病，乌尔里奇先天性肌营养不良(Ullrich congenitalmuscular dystrophy)，面肩肱型肌营养不良，脊柱肌营养不良，刚性脊柱肌营养不良，远端肌营养不良，眼咽肌营养不良，先天性肌营养不良(MDC)1A、1B、1C和1D；肢带型肌营养不良(LGMD)1A、1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2H、2I、2J、2K、2L、2M、2N、2O和2Q；肌肉眼脑疾病；福山沃克瓦堡综合征(Fukuyama Walker Warburg Syndrome)；肌无力综合征；先天性肌肉衰弱；包涵体肌病；包涵体肌炎；皮肌炎；中央核肌病；Myoshi肌病；线粒体肌病；杆状体肌病；Nonaka肌病；重症肌无力；或多肌炎。

在一个实施例中，本披露内容提供了包含治疗有效量的神经营养因子-3(NT-3)、前NT-3或其有效片段或者编码NT-3、前NT-3或其有效片段的核酸的组合物，该组合物用于在受试者中刺激肌肉生长。例如，本披露内容的组合物被配制用于肌内给予。

在示例性的实施例中，该组合物包含编码NT-3、前NT-3或其有效片段的核酸。在相关的实施例中，该核酸在病毒载体如腺相关病毒载体中。在各个实施例中，该核酸与肌肉特异性启动子如三重肌肉特异性肌酸激酶启动子可操作地连接。在各个实施例中，该组合物包含含有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的核酸。

本披露内容还提供了包含编码NT-3多肽的核酸的组合物，该组合物用于在人类受试者中治疗肌肉消耗障碍或神经病变，其中：a)该核酸包含与SEQ ID NO:1的核苷酸序列90％相同的核苷酸序列；b)该核酸包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列；c)该核酸包含编码与SEQ ID NO:2至少90％相同或与SEQ ID NO:2为100％相同的氨基酸序列的核酸序列，d)编码该NT-3多肽的核酸是本披露内容的任何核酸，e)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，并且将该rAAV以导致持续表达低浓度NT-3多肽的剂量来给予，f)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，该组合物被配制用于肌内给予途径，并且该rAAV的剂量为约1.5x1012vg/kg至约6.5x1012vg/kg，g)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，该组合物被配制用于肌内给予途径，并且该rAAV的剂量为约2x1012vg/kg至约6x1012vg/kg，h)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，该组合物被配制用于肌内给予途径，并且该rAAV的剂量为约2x1012vg/kg，i)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，该组合物被配制用于肌内给予途径，并且该rAAV的剂量为约4x1012vg/kg，j)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，该组合物被配制用于肌内给予途径，并且给予的rAAV的剂量为约6x1012vg/kg，k)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，该组合物被配制用于肌内注射，浓度为约2x1013vg/ml，使用约0.5至1ml的3至6次注射/块肌肉来给予，或l)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，该组合物被配制用于肌内注射，浓度为约2x10¹³vg/ml，使用多次注射以总体积约5至14ml来给予。

在另一个实施例中，本披露内容提供了包含编码该NT-3多肽的核酸的组合物，该组合物用于在人类受试者中改善肌肉强度或刺激肌肉生长，其中a)该核酸包含与SEQ IDNO:1的核苷酸序列90％相同的核苷酸序列；b)该核酸包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列；c)该核酸包含编码与SEQ ID NO:2至少90％相同或与SEQ ID NO:2为100％相同的氨基酸序列的核酸序列，d)编码该NT-3多肽的核酸是本披露内容的任何核酸，e)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，并且该rAAV处于导致持续表达低浓度NT-3多肽的剂量，f)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，该组合物被配制用于肌内给予途径，并且该rAAV的剂量为约1.5x1012vg/kg至约6.5x1012vg/kg，g)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，该组合物被配制用于肌内给予途径，并且该rAAV的剂量为约2x1012vg/kg至约6x1012vg/kg，h)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，该组合物被配制用于肌内给予途径，并且该rAAV的剂量为约2x1012vg/kg，i)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，该组合物被配制用于肌内给予途径，并且该rAAV的剂量为约4x1012vg/kg，j)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，该组合物被配制用于肌内给予途径，并且该rAAV的剂量为约6x1012vg/kg，k)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，该组合物被配制用于肌内注射，浓度为约2x1013vg/ml，使用约0.5至1ml的3至6次注射/块肌肉来给予，或l)编码该NT-3多肽的核酸是重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3，该组合物被配制用于肌内注射，浓度为约2x10¹³vg/ml，使用多次注射以总体积约5至14ml来给予。

例如，本披露内容的任何组合物可以包含使用病毒载体如腺相关病毒载体进行配制以用于给予的核酸。另外，本披露内容的任何组合物可以包含与肌肉特异性启动子可操作地连接的核酸，例如该肌肉特异性启动子是肌肉特异性肌酸激酶启动子(MCK)。在另一个实施例中，在任何组合物或本披露内容中，scAAV1.tMCK.NTF3包含SEQ ID NO:11所列出的NT-3基因盒。

在一个实施例中，本披露内容提供了包含重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3的组合物，该组合物用于在有需要的人类受试者中治疗肌肉消耗障碍或神经病变，该组合物导致低浓度的NT-3蛋白的持续表达。

在另一个实施例中，本披露内容提供了重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3用于在有需要的人类受试者中刺激肌肉生长的用途，该重组腺相关病毒导致低浓度的NT-3蛋白的持续表达。

在一个实施例中，本披露内容提供了包含一定剂量的重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3的组合物，该组合物用于在有需要的人类受试者中治疗肌肉消耗障碍或神经病变，其中该组合物被配制用于肌内给予，并且给予的rAAV的剂量为约1.0x10¹²vg/kg至约7x10¹²vg/kg、或约1.5x10¹²vg/kg至约6.5x10¹²vg/kg、或约2x10¹2vg/kg至约6x10¹²vg/kg。

在另一个实施例中，本披露内容提供了包含一定剂量的重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3的组合物，该组合物用于在有需要的人类受试者中治疗肌肉消耗障碍或神经病变，其中该组合物被配制用于肌内给予，并且给予的rAAV的剂量为约1.0x10¹²vg/kg、或约1.5x10¹²vg/kg、或约2x10¹²vg/kg、或约3x10¹²vg/kg、或约4x10¹²vg/kg、或约5x10¹²vg/kg、或约6x10¹²vg/kg、或约7x10¹²vg/kg、或约8x10¹²vg/kg、或约9x10¹²vg/kg、或约1x10¹³vg/kg。

在另一个实施例中，本披露内容提供了包含一定剂量的重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3的组合物，该组合物用于在有需要的人类受试者中治疗肌肉消耗障碍或神经病变，其中该组合物被配制用于肌内给予，并且给予的rAAV的剂量为约2x10¹³vg/ml，以低剂量(每名患者2x10¹²vg/kg)和高剂量(每名患者6x10¹²vg/kg)来给予。在一些实施例中，将该组合物分别使用3至6次注射/块肌肉来给予(每次注射体积将为0.5至1ml)至每条腿中腓肠肌和胫骨前肌的内侧头和外侧头。总计5mL至14mL的载体将被给予至每条腿中腓肠肌和胫骨前肌的内侧头和外侧头。

在示例性的实施例中，本披露内容提供了包含一定剂量的重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3的组合物，该组合物用于在有需要的人类受试者中治疗肌肉消耗障碍或神经病变，其中该组合物被配制用于肌内给予，并且给予的rAAV的剂量为约2x10¹³vg/ml，分别使用3至6次注射/块肌肉以低剂量(每名患者2x10¹²vg/kg)和高剂量(每名患者6x10¹²vg/kg)来给予(每次注射体积将为0.5至1ml)。总计5mL至14mL的载体将被给予至每条腿中腓肠肌和胫骨前肌的内侧头和外侧头。

在一个实施例中，本披露内容提供了包含一定剂量的重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3的组合物，该组合物用于改善人类受试者中的肌肉强度，其中该组合物被配制用于肌内给予，并且给予的rAAV的剂量为约1.0x10¹²vg/kg至约7x10¹²vg/kg、或约1.5x10¹²vg/kg至约6.5x10¹²vg/kg、或约2x10¹²vg/kg至约6x10¹²vg/kg。

在另一个实施例中，本披露内容提供了包含一定剂量的重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3的组合物，该组合物用于改善人类受试者中的肌肉强度，其中该组合物被配制用于肌内给予，并且给予的rAAV的剂量为约1.0x10¹²vg/kg、或约1.5x10¹²vg/kg、或约2x10¹²vg/kg、或约3x10¹²vg/kg、或约4x10¹²vg/kg、或约5x10¹²vg/kg、或约6x10¹²vg/kg、或约7x10¹²vg/kg、或约8x10¹²vg/kg、或约9x10¹²vg/kg、或约1x10¹³vg/kg。

在另一个实施例中，本披露内容提供了包含一定剂量的重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3的组合物，该组合物用于在有需要的人类受试者中改善肌肉强度或刺激肌肉生长，其中该组合物被配制用于肌内给予，并且给予的rAAV的剂量为约2x10¹³vg/ml，以低剂量(每名患者2x10¹²vg/kg)和高剂量(每名患者6x10¹²vg/kg)来给予。在一些实施例中，将该组合物分别使用3至6次注射/块肌肉来给予(每次注射体积将为0.5至1ml)至每条腿中腓肠肌和胫骨前肌的内侧头和外侧头。总计5mL至14mL的载体将被给予至每条腿中腓肠肌和胫骨前肌的内侧头和外侧头。

在示例性的实施例中，本披露内容提供了包含一定剂量的重组腺相关病毒(rAAV)scAAV1.tMCK.NTF3的组合物，该组合物用于在有需要的人类受试者中改善肌肉强度或刺激肌肉生长，其中该组合物被配制用于肌内给予，并且给予的rAAV的剂量为约2x10¹³vg/ml，分别使用3至6次注射/块肌肉以低剂量(每名患者2x10¹²vg/kg)和高剂量(每名患者6x10¹²vg/kg)来给予(每次注射体积将为0.5至1ml。总计5mL至14mL的载体将被给予至每条腿中腓肠肌和胫骨前肌的内侧头和外侧头。

在本披露内容的任何组合物中，scAAV1.tMCK.NTF3的给予途径是向腓肠肌和胫骨前肌的内侧头和外侧头的肌内双侧注射。另外，在本发明的任何组合物中，scAAV1.tMCK.NTF3的给予导致受试者中的上肢或下肢的肌肉强度得到改善，并且例如肌肉强度的改善被测量为在CMT儿科量表(CMTPedS)上的综合得分的降低。另外，在本披露内容的任何组合物中，该组合物的给予导致在两年时间段内疾病进展的减少或停止。疾病进展是由CMTPedS来测量的。CMTPedS是11个条目的量表，其由以下构成：功能性敏捷度测试，九孔柱测试(9HPT)，手握力、足跖屈和足背屈强度(使用手持肌测仪)，针刺和振动感觉，Bruininks Oseretsky测试-平衡评估，步态评估，跳远和六分钟步行测试(6MWT)。功效定义为在基因转移后2年时通过此量表测量的能力下降停止。

在本披露内容的方面，在任何组合物中，该受试者患有遗传性神经病变(如腓骨肌萎缩(CMT)神经病变，例如CMT1A、CMT2K、CMT4A、CMTRIA)，以及由常染色体隐性基因变体或常染色体显性基因变体或X连锁基因变体引起的轴突和脱髓鞘神经病变。该遗传性神经病变可能是由表1中提供的任何基因变体引起的。此外，该遗传性神经病变可以是由转甲状腺素蛋白(TTR)基因突变，如以下基因变体：Val30Met、Ile107Val和Ser77Tyr引起的转甲状腺素蛋白淀粉样神经病变。

在本披露内容的另一方面，在任何组合物中，该受试者患有具有轴突丧失和/或神经再生受损的获得性神经病变。该获得性神经病变是由引起神经病变的任何障碍或疾病引起的周围神经病变。例如，该受试者患有由以下引起的周围神经病变：糖尿病、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、甲状腺障碍(如甲状腺功能减退)、低血糖症、尿毒症、肾功能不全、肝功能障碍、肝衰竭、红细胞增多症、结缔组织障碍、癌症、莱姆病、乳糜泻、麻风病、卟啉症、舍格伦综合征、脊髓灰质炎、肢端肥大症、脂质/糖脂代谢障碍、西尼罗河综合征、淀粉样变性、线粒体障碍、异常蛋白血症障碍如意义未明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)或POEMS综合征。该受试者患有营养/维生素缺乏症，如维生素B₁₂缺乏症、维生素E缺乏症或铜缺乏症。

另外，在本披露内容的任何组合物中，该受试者患有自身免疫性周围多发性神经病变、急性炎性脱髓鞘性多神经根神经病变(AIDP)、慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经病变(CIDP)、血管炎性多发性单神经炎、神经旁病变、特发性神经节炎、肌萎缩侧索硬化、多灶性运动传导阻滞神经病变或下运动神经元综合征。

在本披露内容的任何组合物中，该获得性神经病变是中毒性神经病变。例如中毒性神经病变是以下的毒性作用的结果：处方药如氯霉素、胆碱喹啉、秋水仙碱、双硫仑、依那西普、乙胺丁醇、金(Gold)、羟氯喹、硝基呋喃妥因、甲硝唑、司他夫定、扎西他滨、英利昔单抗、来氟米特、沙利度胺，或化疗剂如顺铂、阿糖胞苷、硼替佐米、多西他赛、来那度胺、Misondiazole、奥沙利铂、紫杉醇、丙卡巴肼、苏拉明、沙利度胺、长春碱或长春新碱，或抗酒精药如双硫仑，或抗惊厥剂如苯妥英或狄兰汀，或心脏或血压药物如他汀类、胺碘酮、肼屈嗪、普鲁卡因胺、哌克昔林，或抗生素如氟喹诺酮、异烟肼、西普罗、左氧氟沙星、灭滴灵或甲硝唑，以及皮肤病治疗如达普松。该中毒性神经病变也是由长期酗酒或维生素B₆毒性引起的。

在本披露内容的另一方面，在任何组合物中，该受试者是患有获得性神经病变的癌症患者。例如，该癌症患者发展出与营养缺乏、化疗副作用和/或副肿瘤综合征有关的神经病变。

在本披露内容的又另一方面，在任何组合物中，该受试者是患有获得性神经病变的外科患者。例如，该外科患者在进行减肥手术、多次整形外科手术或多次“卡压神经”手术后发展出神经病变。

在本披露内容的另一方面，在任何中，该受试者患有遗传性肌病、神经肌肉疾病、肌肉萎缩、药源性肌病、少肌症、恶病质、II型肌纤维萎缩、遗传决定的肌营养不良、年龄相关性肌肉萎缩或获得性自身免疫性原发性肌肉障碍。

在本披露内容的另一方面，在任何组合物中，受试者患有杜氏肌营养不良，贝克肌营养不良，强直性肌营养不良，肌聚糖病(sarcoglycanopathy)，肌强直性营养不良，埃-德二氏肌营养不良(Emery-Dreifuss muscular dystrophy)，先天性肌营养不良，分区蛋白缺陷性先天性肌营养不良，贝特莱姆肌病，乌尔里奇先天性肌营养不良(Ullrich congenitalmuscular dystrophy)，面肩肱型肌营养不良，脊柱肌营养不良，刚性脊柱肌营养不良，远端肌营养不良，眼咽肌营养不良，先天性肌营养不良(MDC)1A、1B、1C和1D；肢带型肌营养不良(LGMD)1A、1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2H、2I、2J、2K、2L、2M、2N、2O和2Q；肌肉眼脑疾病；福山沃克瓦堡综合征(Fukuyama Walker Warburg Syndrome)；肌无力综合征；先天性肌肉衰弱；包涵体肌病；包涵体肌炎；皮肌炎；中央核肌病；Myoshi肌病；线粒体肌病；杆状体肌病；Nonaka肌病；重症肌无力；或多肌炎。

在本披露内容的另一方面，在任何组合物中，该受试者患有创伤性神经损伤，如由压迫、双卡或横切引起的神经损伤。

附图说明

参考以下附图可以更容易地理解本发明，其中：

图1A至图1C提供了显示TrJ肌肉中AAV1.NT-3诱导的纤维类型重塑的图表和图像。注射后16周时，AAV1.tMCK.NT-3治疗的TremblerJ(TrJ)(图1A)和未治疗(TrJ-PBS)的腓肠肌(图1B)的SDH染色的组织切片的代表性图像。显示了慢缩氧化(STO，箭头(arrow))、快缩氧化(FTO，箭头(arrow head))和快缩糖酵解(FTG，星号)(图1B)。a中的氧化纤维减少。在TrJ-PBS肌肉(图1B)中，所有纤维类型出现了增加数量的小型STO纤维和角纤维，以及与神经源性变化相容的小型类型组群。对于a、b，比例尺＝30gm。使用NT-3基因疗法的TrJ肌肉(图1C)中，纤维类型从STO转变为FTO/FTG纤维。两个治疗组中的平均STO百分比(来源于每组中n＝3-5只小鼠)与野生型(WT)肌肉无显著差异，这表明在使用NT-3的情况下在TrJ神经源性肌肉中朝着纤维类型分布的正常化的变化。

图2A至图2C提供了显示AAV1.NT3治疗对mTOR信号传导和代谢标记物的作用的图表和图像。在注射后16周时，在TrJ(图2A)和野生型(WT)(图2B)腓肠肌中的mTOR靶标即磷酸(P)-4EBP1(Thr37/46)和P-S6(Ser235/236)的代表性的蛋白质印迹图像和分析。这些图表显示了针对GAPDH归一化的蛋白质的磷酸化形式的表达水平。考马斯蓝染色的膜代表相等的凝胶上样。误差条为±SEM；每组中n＝5-6，*P<0.05，未配对t检验。(图2C)通过qPCR得到的糖酵解(1-1K1和PK1)和氧化调节因子(PGC1α)的相对表达；GAPDH用作管家基因。误差条为±SEM；每组中n＝5-6，*P<0.05，单因素方差分析，然后进行图基多重比较检验。

图3A至图3D提供了显示NT-3对肌管的直接作用的图表和图像。(图3A)在与重组人NT-3(100ng/ml)或PBS(对照)孵育30分钟的肌管中，Akt/mTOR途径、磷酸(P)-Akt(Ser473)、P-4EBP1(Thr37/46)和P-S6(Ser235/236)的代表性的蛋白质印迹图像和分析。磷酸化蛋白质条带的密度值针对GAPDH归一化，并显示为对照组的百分比。考马斯蓝染色的膜代表相等的凝胶上样。将肌管与NT-3(100ng/ml)孵育48小时，然后通过qPCR检测代谢标记物(PGC1a、HK1、PK1)的相对mRNA表达(图3B)，并通过ELISA检测细胞培养基中的葡萄糖消耗与乳酸产生的关系(图3C)。(图3D)在NT-3(100ng/ml)治疗48小时后，成肌细胞与肌管中肌细胞生成素以及NT-3受体P75NTR和TrkC的相对表达水平。GAPDH在分析中作为管家基因。显示的结果是来自至少三个独立实验的平均值±SEM，*P<0.05，学生配对t检验。

图4提供了显示治疗和未治疗小鼠中NT-3的血清水平的图表。在终点，从每只小鼠收集血清，并通过ELISA检测循环的NT-3水平。

图5显示了TrJ和WT腓肠肌中P75^NTR和TrkC的相对mRNA表达。GAPDH在分析中作为管家基因。显示的结果是来自至少三个独立实验的平均值±SEM，*P<0.05，学生t检验。

图6提供了构建体AAV.tMCK.NTF3(SEQ ID NO:11)的示意图。该载体含有肌肉特异性tMCK启动子(SEQ ID NO:3)、嵌合内含子(SEQ ID NO:5)、共有Kozak序列(SEQ ID NO:6)、NTF3 cDNA(SEQ ID NO:1)和聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:7)。

图7提供了限制性图谱和ORF分析pAAV.tMCK.NTF3。

图8A至图8B指示了在人类受试者中IM注射AAV.tMCK.NTF3的位置。

图9提供了AAV.tMCK.NTF3的核苷酸序列(SEQ ID NO:11)。

具体实施方式

研究了AAV.NT-3治疗诱导的在TrJ肌肉中的纤维大小增加，以确定这种增加是否仅是神经再支配的结果，或者是否NT-3对肌肉蛋白合成具有直接作用，而与神经再生无关，从而能够增加肌肉纤维大小。

本文披露的是NT-3的新颖作用；即其直接影响神经源性肌肉中蛋白质合成和代谢重塑的能力。

本文所述的工作首先评估了基因注射后16周时AAV.NT-3基因疗法对TrJ肌肉氧化状态的作用，并发现肌肉纤维大小增加与肌肉纤维的氧化状态朝着WT中所见的纤维类型比率的正常化的变化相关。该治疗导致慢缩氧化(STO)纤维的百分比减少，而快缩氧化和糖酵解(FTO和FTG)纤维群体增加，这反映了未治疗的TrJ肌肉中所见的模式的逆转。NT-3诱导的纤维大小增加对于FTG纤维群体最为突出。然后研究了雷帕霉素复合物1(mTORC1)激活的哺乳动物靶标是否在NT-3诱导的肌肉蛋白合成中、特别强调在糖酵解纤维的优先放射状生长中发挥作用。mTORC1通过翻译调节因子即真核翻译起始因子4E结合蛋白1(4E-BP1)和S6激酶1(S6K1)的磷酸化来调节翻译和核糖体生物发生。Laplante M,SabatiniD.,Cell[细胞],149(2):274-293(2012)。此外，mTORC1与细胞糖酵解的激活相关，这种激活涉及糖酵解酶或其转录调节因子的增加的翻译。Duvel等人,Molecular cell[分子细胞],39(2):171-183(2010)。发现在TrJ肌肉中的组织化学变化伴随着4E-BP1和S6蛋白(S6P)磷酸化水平的升高，其作为mTORC1激活的证据。与此同时，TrJ肌肉中线粒体生物发生调节因子(过氧化物酶体增殖物激活的受体y共激活物1a，PGC1α)的表达水平和糖酵解的标记物(己糖激酶-1即HK1，和丙酮酸激酶1即PK1)增加。这些变化在AAV.NT-3治疗的WT肌肉中不显著。此外，体外研究显示重组NT-3可以直接在表达TrkC的肌管中而不是在成肌细胞中诱导Akt/mTOR途径激活。此外，与成肌细胞相比，肌管中肌细胞生成素的表达水平显著高而p75NTR表达下调，这指示NT-3诱导的成肌细胞分化与mTORC1激活相关。

本文所述的发现对于NT-3的潜在用途具有许多暗示，不仅可用于治疗神经病变，对神经和肌肉都有益处，而且还可用于肌肉消耗病症，包括衰老、癌症恶病质或II型肌纤维萎缩、以及与受损的再生放射状生长阶段相关的遗传性或获得性自身免疫性原发性肌肉障碍，在该受损的再生放射状生长阶段中可能涉及mTORC1信号传导的扰动和有缺陷的线粒体生物发生。

本披露内容涉及在受试者中刺激肌肉生长的方法。该方法包括向有需要的受试者给予治疗有效量的神经营养因子-3(NT-3)、前NT-3或其有效片段，或者编码NT-3、前NT-3或其有效片段的核酸。需要刺激肌肉生长的受试者包括患有肌营养不良或肌肉萎缩的受试者。

本发明提供了抑制肌肉消耗的方法，其包括给予AAV载体以递送编码神经营养因子-3(NT-3)的NTF3基因。在一个实施例中，本发明提供了治疗腓骨肌萎缩1A型(CMT1A)的基因治疗方法，其中使用在肌肉特异性tMCK启动子的控制下的自身互补腺相关病毒(scAAV)1型将编码NT-3的NTF3基因递送至该受试者。在另一个实施例中，本发明提供了在有需要的受试者(例如被诊断患有或患有肌肉消耗障碍(如CMT)的受试者)中增加肌肉强度的基因治疗方法。

临床前研究证明，将构建体AAV1.tMCK.NTF3递送至trembler J小鼠9(Tr^J)(即CMT1的天然存在的小鼠模型)的腓肠肌改善了神经再生、髓鞘形成、有髓纤维密度、转棒仪测试中坐骨神经复合肌肉动作电位幅度和功能性能、以及后肢握力(参见实例3)。

如本文所用，术语“治疗”(“treatment”、“treating”)等是指获得所需的药理或生理作用。就部分或完全治愈疾病或可归因于该疾病的不利作用而言，该作用可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖对哺乳动物、特别是对人类中的疾病的任何治疗，并且可以包括抑制疾病或病症，即阻止其发展；和缓解疾病，即引起该疾病的消退。

如本文所用，预防是指对具有患有病症或疾病(如神经病变、脱髓鞘性多发性神经病变、肌肉消耗障碍或萎缩)的风险的受试者提供益处的任何行动。

如本文所用的“药学上可接受的”意指根据疾病的严重程度和治疗的必要性，该化合物或组合物适合于以本文所述的方法给予至受试者，而没有过度有害的副作用。

术语“治疗上有效的”和“药理上有效的”旨在限定药剂的将实现改善疾病严重程度和发生频率的目标的量。治疗的有效性可以通过评价受试者中响应于NT-3的给予的症状减轻来测量。

术语“有效片段”是指编码NT-3多肽的功能片段的多核苷酸序列的一部分。术语“有效片段”也指保留NT-3生长因子活性的NT-3多肽氨基酸序列的一部分。示例性NT-3生长因子活性包括支持现有神经元的存活和分化，以及诱导和支持新神经元和突触的生长和分化。另外，NT-3活性包括刺激肌肉生长和肌肉功能。

如本文所用，术语“诊断”可以涵盖确定受试者将发展疾病的可能性，或受试者中疾病的存在或性质。如本文所用，术语诊断还涵盖确定疾病或疾病发作的严重程度和可能的结果或恢复的前景(其通常称为预后)。“诊断”还可以涵盖在合理疗法的背景下的诊断，其中该诊断指导疗法，包括疗法的初始选择、疗法的修改(例如，剂量或剂量方案的调整)等。

如本文所用的“受试者”可以是任何动物，并且也可以称为患者。优选地，受试者是脊椎动物，并且更优选地，受试者是哺乳动物，如驯养的家畜(例如，牛、马、猪)或宠物(例如，狗、猫)。在一些实施例中，受试者是人。

术语“多核苷酸”或“核酸分子”是指长度为至少10个碱基的核苷酸的聚合形式。该术语包括DNA分子(例如，eDNA或基因组或合成DNA)和RNA分子(例如，mRNA或合成RNA)，以及含有非天然核苷酸类似物、非天然核苷间键或二者的DNA或RNA类似物。核酸可以呈任何拓扑构象。例如，核酸可以是单链、双链、三链、四链、部分双链、支链、发夹状、环状或呈挂锁构象。

如本文所用，术语“基因”是指可以引导酶或其他多肽分子的合成(例如，可以包含编码序列，例如，编码多肽的连续开放阅读框(ORF))或者本身可在生物体中起作用的核苷酸序列。如本文所定义，生物体中的基因可以聚簇在操纵子内，其中该操纵子通过基因间DNA与其他基因和/或操纵子分开。操纵子内包含的单独基因可以重叠，而单独基因之间没有基因间DNA。

如本文所用，术语“AAV”是腺相关病毒的标准缩写。腺相关病毒是单链DNA细小病毒，其仅在通过共感染辅助病毒提供某些功能的细胞中生长。目前已表征十三种AAV血清型。AAV的一般信息和综述可见于，例如Carter,1989,Handbook of Parvoviruses[细小病毒手册],第1卷,第169-228页，和Berns,1990,Virology[病毒学],第1743-1764页,RavenPress,(纽约)。然而，完全可以预期，这些相同的原理将适用于另外的AAV血清型，因为众所周知的是，各种血清型在结构和功能上、甚至在基因水平上都相当密切相关。(参见例如Blacklowe,1988,Parvoviruses and Human Disease[细小病毒和人类疾病],第165-174页,J.R.Pattison,编辑；和Rose,Comprehensive Virology[综合病毒学]3:1-61(1974))。例如，所有AAV血清型明显地展现出由同源rep基因介导的非常相似的复制特性；并且全部携带三种相关的衣壳蛋白，如在AAV2中表达的那些。关联性的程度由异源双链分析进一步表明，该异源双链分析揭示了沿基因组长度在血清型之间的广泛交叉杂交；并且在末端存在与“反向末端重复序列”(ITR)对应的类似自退火区段。相似的感染性模式还表明，每种血清型中的复制功能均处于相似的调节控制之下。

术语“载体”或“表达载体”是指包含编码能够被转录的RNA的核酸的任何类型的基因构建体。表达载体可以含有多种控制序列、结构基因(例如，目标基因)以及也提供其他功能的核酸序列。

“载体”意指DNA分子，其通常源自DNA片段可以插入或克隆至其中的质粒或噬菌体。重组载体将含有一个或多个独特的限制位点，并且可能能够在限定的宿主或媒介生物体中自主复制，使得克隆的序列具有可复制性。载体含有与基因或编码区可操作地连接的启动子，使得在转染到接受者细胞中时表达RNA。

如本文所用，“AAV载体”是指包含侧接AAV末端重复序列(ITR)的一个或多个目标多核苷酸(或转基因)的载体。此类AAV载体当存在于已经用编码和表达rep和cap基因产物的载体转染的宿主细胞中时，可以被复制并包装成感染性病毒颗粒。

“AAV病毒体”或“AAV病毒颗粒”或“AAV载体颗粒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白和衣壳化的多核苷酸AAV载体构成的病毒颗粒。如果颗粒包含异源多核苷酸(即，除了野生型AAV基因组以外的多核苷酸，如待递送至哺乳动物细胞的转基因)，则其通常被称为“AAV载体颗粒”或简称为“AAV载体”。因此，AAV载体颗粒的产生必然包括AAV载体的产生，因为这种载体被包含在AAV载体颗粒内。

如本文所用，术语“约”是指与基本值的+/-10％偏差。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的意义相同的意义。

周围神经病变的基因疗法

一方面，本发明提供了使用基因疗法治疗患有肌肉萎缩的受试者的方法。

可用于递送治疗性核酸的载体包括病毒载体和非病毒载体。可以使用的合适载体包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、HSV(单纯疱疹病毒)和质粒。单纯疱疹病毒载体的优点是它们对于感觉神经元的天然嗜性。然而，腺病毒相关病毒载体由于其插入诱变和免疫原性的低风险、其缺乏内源性病毒基因以及它们以高滴度产生的能力而最受欢迎。Kantor等人综述了将基因转移到中枢神经系统的多种方法，而Goins等人描述了用于治疗慢性周围神经系统疼痛的基因治疗方法。参见Kantor等人,Adv Genet.[遗传学进展]87,125-197(2014)，和Goins等人,Neurobiol.Dis.[疾病的神经生物学]48(2),255-270(2012)，将它们的披露内容通过引用并入本文。具体地，已经报道了使用多种病毒载体成功地将基因递送至许旺细胞，即周围神经的驻留胶质细胞。Mason等人,Curr.Gene Ther.[当今基因疗法]11,75-89(2011)。如果载体在病毒载体中并且载体已经被包装，则病毒体可以用于感染细胞。如果使用裸DNA，则可以使用适合于特定宿主细胞的转染或转化程序。利用聚合物、脂质体或纳米球的裸DNA配制品可用于基因递送。可以将核酸以提供足够有效的递送水平的任何所需形式给予，该形式包括在病毒颗粒中、在脂质体中、在纳米颗粒中以及与聚合物复合。

可以将编码基因(其表达减少周围神经病变)的核酸(例如，cDNA或转基因)克隆至表达盒中，该表达盒具有调节元件如启动子(组成性或可调节的)以驱动转基因表达和核酸下游的聚腺苷酸化序列。例如，可以使用如下调节元件，其是1)特异于身体组织或区域的；2)组成性的；和/或3)可诱导的/可调节的。

在一些实施例中，使用肌肉特异性调节元件。肌肉特异性调节元件包括肌肉特异性启动子，其包括哺乳动物肌肉肌酸激酶(MCK)启动子、哺乳动物肌间线蛋白启动子、哺乳动物肌钙蛋白I(TNNI2)启动子或哺乳动物骨骼α-肌动蛋白(ASKA)启动子。可用于本发明的肌肉特异性增强子选自由以下组成的组：哺乳动物MCK增强子、哺乳动物DES增强子和脊椎动物肌钙蛋白I IRE(TNI IRE，在下文中称为FIRE)增强子。这些肌肉特异性增强子元件中的一种或多种可以与本发明的肌肉特异性启动子组合使用以提供组织特异性调节元件。

用于通过基因疗法治疗肌肉萎缩的优选载体是AAV。AAV介导的基因递送已成为神经障碍的临床前和临床研究二者的有效且安全的工具。Ojala等人,Neuroscientist.[神经系统科学家],21(1):84-98(2015)。当前，AAV是在针对神经障碍的临床试验中最广泛使用的载体，并且未从临床试验报告过与使用该载体相关的不利作用：腺相关病毒是来自细小病毒科的非致病性依赖病毒，其需要来自其他病毒(如腺病毒或单纯疱疹病毒)的辅助功能来实现其生命周期。野生型(WT)AAV的特征在于约5kb的被衣壳包围的单链DNA(ssDNA)基因组，其在两端具有反向末端重复序列(ITR)。

用于针对应用(如体内基因疗法和体外研究和/或转基因产物的产生)而将转基因递送至细胞的腺病毒载体通常源自缺失早期区域1(El)基因的腺病毒(Berkner,K.L.,Curr.Top.Micro.Immunol.[微生物学和免疫学的最新论题]158 L39-66 1992)。El基因的缺失使得此类腺病毒载体有复制缺陷，并显著降低了载体内存在的其余病毒基因的表达。重组腺病毒载体具有用作基因递送媒介物的若干个优点，包括分裂细胞和非分裂细胞的嗜性、最低致病潜力、复制至高滴度以制备载体原种的能力以及携带大插入片段的潜力。然而，认为腺病毒载体中其余病毒基因的存在可能是有害的。

因此，在一些实施例中，腺病毒载体具有多种腺病毒基因序列的缺失。具体地，假腺病毒载体(PAV)(也称为‘无肠(gutless)腺病毒’)或小型腺病毒载体是源自腺病毒基因组的腺病毒载体，其含有复制和包装载体基因组所需的最小顺式作用核苷酸序列，并且其可以含有一个或多个转基因(参见通过引用并入本文的美国专利号5,882,877，该专利涵盖假腺病毒载体(PAV)和产生PAV的方法)。可容纳多达约36kb的外来核酸的此类PAV是有利的，因为优化了载体的携带能力，同时降低了宿主对载体的免疫应答或复制型病毒的生成的可能性。PAV载体包含含有复制起点的5’反向末端重复序列(ITR)和3'ITR核苷酸序列以及包装PAV基因组所需的顺式作用核苷酸序列，并且可以容纳具有适当的调节元件(例如启动子、增强子等)的一个或多个转基因。

AAV

本发明的重组AAV基因组包含本发明的核酸分子和侧接核酸分子的一个或多个AAVITR。rAAV基因组中的AAVDNA可以来自可衍生重组病毒的任何AAV血清型，其包括但不限于AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12和AAV-13(参见例如Gao等人,PNAS,99:11854-11859((2002)；和Viral Vectorsfor Gene Therapy:Methods and Protocols[用于基因疗法的病毒载体：方法和方案],编辑町田,Humana出版社,2003)。此外，假型AAV载体也可以用于本文所述的方法中。假型AAV载体是在第二AAV血清型的衣壳中含有一个AAV血清型的基因组的那些；例如，含有AAV2衣壳和AAV1基因组的AAV载体，或含有AAV5衣壳和AAV2基因组的AAV载体。(Auricchio等人,(2001)Hum.Mol.Genet.[人类分子遗传学],10(26):3075-81)。假型rAAV的产生披露于例如WO 01/83692中。也设想了其他类型的rAAV变体，例如具有衣壳突变的rAAV。参见例如Marsic等人,Molecular Therapy[分子疗法],22(11):1900-1909(2014)。如以上背景技术部分所述，多种AAV血清型的基因组的核苷酸序列是本领域已知的。为了促进骨骼肌特异性表达，可以使用AAV1、AAV6、AAV8或AAVrh.74。

本发明的DNA质粒包含本发明的rAAV基因组。将DNA质粒转移至允许被AAV的辅助病毒(例如，腺病毒，E1缺失的腺病毒或疱疹病毒)感染的细胞，以将rAAV基因组组装成感染性病毒颗粒。用于产生rAAV颗粒的技术(其中向细胞提供待包装的AAV基因组、rep和cap基因以及辅助病毒功能)在本领域是标准的。rAAV的产生要求单个细胞(在此称为包装细胞)内存在以下组分：rAAV基因组、与rAAV基因组分离(即不在rAAV基因组中)的AAV rep和cap基因、以及辅助病毒功能。AAV rep和cap基因可以来自任何AAV血清型(从该AAV血清型中可以衍生重组病毒)，并且可以来自不同的AAV血清型而不是rAAV基因组ITR，包括但不限于AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAVrh.74、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12和AAV-13。假型rAAV的产生披露于例如WO 01/83692中，将其通过引用以其整体并入本文。

生成包装细胞的方法是产生对于AAV颗粒产生而言，稳定表达所有必需组分的细胞系。例如，将包含以下项的质粒(或多个质粒)整合到细胞的基因组中：缺少AAV rep和cap基因的rAAV基因组、与rAAV基因组分开的AAV rep和cap基因、以及选择性标记(例如新霉素耐药性基因)。AAV基因组已通过程序如GC加尾(Samulski等人,1982,Proc.Natl.Acad.S6.USA[美国国家科学院院刊S6],79:2077-2081)、添加含有限制性内切核酸酶切割位点的合成接头(Laughlin等人,1983,Gene[基因],23:65-73)或通过直接的平端连接(Senapathy和Carter,1984,J.Biol.Chem.[生物化学杂志],259:4661-4666)而被引入细菌质粒中。然后用辅助病毒(如腺病毒)感染包装细胞。此方法的优点是，细胞是可选择的，并且适合rAAV的大规模生产。适合的方法的其他实例采用了腺病毒或杆状病毒而不是质粒来将rAAV基因组和/或rep和cap基因引入包装细胞中。

产生rAAV的一般原理综述于例如Carter,1992,Current Opinions inBiotechnology[生物技术现状],1533-539；和Muzyczka,1992,Curr.Topics inMicrobial.and Immunol.[微生物学和免疫学的当前论题],158:97-129)中。多种方法描述于以下文献中：Ratschin等人,Mol.Cell.Biol.[分子和细胞生物学]4:2072(1984)；Hermonat等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],81:6466(1984)；Tratschin等人,Mo1.Cell.Biol.[分子和细胞生物学]5:3251(1985)；McLaughlin等人,J.Virol.[病毒学杂志],62:1963(1988)；和Lebkowski等人,1988 Mol.Cell.Biol.[分子和细胞生物学],7:349(1988)。Samulski等人(1989,J.Virol.[病毒学杂志],63:3822-3828)；美国专利号5,173,414；WO 95/13365和对应的美国专利号5,658,776；WO 95/13392；WO 96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441(PCT/US96/14423)；WO 97/08298(PCT/US 96/13872)；WO 97/21825(PCT/US 96/20777)；WO 97/06243(PCT/FR96/01064)；WO 99/11764；Perrin等人(1995)Vaccine[疫苗]13:1244-1250；Paul等人(1993)Human Gene Therapy[人类基因疗法]4:609-615；Clark等人(1996)Gene Therapy[基因疗法]3:1124-1132；美国专利号5,786,211；美国专利号5,871,982；和美国专利号6,258,595。将前述文件通过引用以其整体特此并入本文，特别强调的是文件中与rAAV产生有关的那些部分。

因此，本发明提供了产生感染性rAAV的包装细胞。在一个实施例中，包装细胞可以是稳定转化的癌细胞，如HeLa细胞、293细胞和PerC.6细胞(同源293细胞系)。在另一个实施例中，包装细胞是如下细胞，它们是未转化的癌细胞，如低传代293细胞(用腺病毒的E1转化的人胎儿肾细胞)、MRC-5细胞(人胎儿成纤维细胞)、WI-38细胞(人胎儿成纤维细胞)、Vero细胞(猴肾细胞)和FRhL-2细胞(恒河猴胎儿肺细胞)。

本发明的重组AAV(即感染性衣壳化rAAV颗粒)包含rAAV基因组。在示例性的实施例中，两种rAAV的基因组均缺乏AAV rep和cap DNA，即在基因组的ITR之间不存在AAV rep或cap DNA。可以构建为包含本发明的核酸分子的rAAV的实例陈述在国际专利申请号PCT/US 2012/047999(WO 2013/016352)中，将其通过引用以其整体并入。

可以通过本领域中标准的方法，如通过柱色谱或氯化铯梯度来纯化rAAV。从辅助病毒纯化rAAV载体的方法是本领域中已知的，并且包括披露于例如Clark等人,Hum.GeneTher.[人类基因疗法],10(6):1031-1039(1999)；Schenpp和Clark,Methods Mol.Med.[分子医学方法],69 427-443(2002)；美国专利号6,566,118和WO 98/09657中的方法。

在另一个实施例中，本发明设想了包含本发明的rAAV的组合物。本发明的组合物包含rAAV和药学上可接受的载体。这些组合物还可以包含其他成分，如稀释剂和佐剂。可接受的载体、稀释剂和佐剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒并且优选地是惰性的，并且包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐或其他有机酸；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；和/或非离子表面活性剂，如吐温、普朗尼克或聚乙二醇(PEG)。

在本发明的方法中要给予的rAAV的滴度将根据例如特定的rAAV、给予方式、治疗目标、个体和所靶向的一种或多种细胞类型而变化，并且可以通过本领域中标准的方法来确定。rAAV的滴度可以在约1x10⁶、约1x10⁷、约1x10⁸、约1x10⁹、约1x10¹⁰、约1x10¹¹、约1x10¹²、约1x10¹³至约1x10¹⁴或更多个抗DNase颗粒(DRP)/ml的范围内。剂量也可以以病毒基因组的单位(vg)来表示。

本发明设想了在体内或体外用rAAV转导靶细胞的方法。体内方法包括将有效剂量或多个有效剂量的包含本发明的rAAV的组合物给予至有需要的动物(包括人)的步骤。如果在障碍/疾病发展之前给予该剂量，则该给予是预防性的。如果在障碍/疾病发展之后给予该剂量，则该给予是治疗性的。在本发明的实施例中，有效剂量是如下剂量，其缓和(消除或减轻)与所治疗的障碍/疾病状态相关的至少一种症状，减慢或防止进展为障碍/疾病状态，减慢或防止障碍/疾病状态进展，减小疾病的程度，导致疾病的(部分或完全)缓解和/或延长存活期。

具体地，本发明的rAAV的实际给予可以通过使用将rAAV重组载体转运到动物的靶组织中的任何物理方法来完成。根据本发明的给予包括但不限于注射至肌肉、血流和/或直接注射至肝中。已证明简单地将rAAV重悬浮在磷酸盐缓冲盐水中足以提供可用于肌肉组织表达的媒介物，并且对可与rAAV共同给予的载体或其他组分没有已知的限制(但采用rAAV的常规方式应避免可降解DNA的组合物)。可以修饰rAAV的衣壳蛋白，使得rAAV靶向特定的目标靶组织，如肌肉。参见例如WO 02/053703，将其披露内容通过引用并入本文。可以将药物组合物制备为可注射配制品或局部配制品，以通过透皮转运递送至肌肉。先前已经开发了用于肌内注射和透皮转运的多种配制品，并且它们可以用于实践本发明。rAAV可与任何药学上可接受的载体一起使用，以易于给予和处理。

可以用包含组织特异性控制元件的基因盒进行转导。例如，本发明的一个实施例提供了由肌肉特异性控制元件引导的转导肌肉细胞和肌肉组织的方法，这些肌肉特异性控制元件包括但不限于源自肌动蛋白和肌球蛋白基因家族的那些(如源自myoD基因家族[参见Weintraub等人,Science[科学],251:761-766(1991)])，肌细胞特异性增强子结合因子MEF-2[Cserjesi和Olson,Mol Cell Biol[分子细胞生物学]11:4854-4862(1991)]，源自人类骨骼肌动蛋白基因[Muscat 等人,Mol Cell Biol[分子细胞生物学],7:4089-4099(1987)]、心肌肌动蛋白基因的控制元件，肌肉肌酸激酶序列元件[参见Johnson等人,MolCell Biol[分子细胞生物学],9:3393-3399(1989)]和鼠肌酸激酶增强子(mCK)元件，源自骨骼快缩肌钙蛋白C基因、慢缩心肌肌钙蛋白C基因和慢缩肌钙蛋白I基因的控制元件：缺氧可诱导的核因子(Semenza等人,Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊],88:5680-5684(1991))，类固醇可诱导的元件和启动子(包括糖皮质激素应答元件(GRE)(参见Mader和White,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:5603-5607(1993)))，以及其他控制元件。

肌肉组织不是体内至关重要的器官，而且易于获取，因此是体内DNA递送的有吸引力的靶标。本发明设想了来自转导的肌纤维的miRNA的持续表达。

“肌肉细胞”或“肌肉组织”意指源自任何种类的肌肉(例如，骨骼肌和平滑肌，例如来自消化道、膀胱、血管或心脏组织)的细胞或细胞群。此类肌肉细胞可以是分化的或未分化的，如成肌细胞、肌细胞、肌管、心肌细胞和成心肌细胞(cardiomyoblast)。

术语“转导”用于指经由本发明的复制缺陷型rAAV将NT-3的编码区在体内或体外给予/递送至接受者细胞，从而导致通过接受者细胞表达NT-3。

在一个实施例中，基因疗法是经由重组腺相关病毒(AAV)递送的NT-3基因疗法。诸位发明人开发了携带在CMV启动子或三肌肉特异性肌酸激酶(tMCK)启动子控制下的人NT-3cDNA编码序列的AAV表达盒。诸位发明人先前已经显示，使用重组AAV1载体增加颤抖(Try)小鼠(它是腓骨肌萎缩疾病变体CMT1A的模型)中神经营养因子-3表达可以实现周围神经的运动功能、组织病理学和电生理学的改善。参见Sahenk等人,Mol Ther.[分子疗法]22(3):511-21(2014)，将其披露内容通过引用并入本文。

因此，本发明提供了向有需要的患者给予有效剂量(或基本上同时给予的剂量或以一定间隔提供的剂量)的编码NT-3的rAAV的方法。

剂量和给予途径

本发明提供了有效剂量的rAAV和本发明的组合物的局部给予和全身性给予，包括本发明的组合疗法。例如，全身性给予是给予至循环系统中，使得全身受到影响。全身性给予包括肠内给予(如通过胃肠道的吸收)和通过注射、输注或植入的肠胃外给予。

因此，前述方法中设想的rAAV的给予途径包括但不限于腹膜内(IP)、肌内(IM)和血管内[包括例如动脉间肢灌注(ILP)和静脉内(IV)途径。

在本文披露的方法中要给予的rAAV的剂量将根据例如特定的rAAV、给予方式、治疗目标、个体和所靶向的一种或多种细胞类型而变化，并且可以通过本领域中标准的方法来确定。可以给予多于一个剂量，例如一个、两个、三个或更多个剂量。剂量中的rAAV的滴度可以在约1x10⁶、约1x10⁷、约1x10⁸、约1x10⁹、约1x10¹⁰、约1x1¹¹、约1x10¹²、约1.5x10¹²、约1x10¹²、约3x10¹²、约4x10¹²、约5x10¹²、约6x10¹²、约6.5x10¹²、约7x10¹²、1x10¹³、约1x10¹⁴、或至约1x10¹⁵或更多个抗DNase颗粒(DRP)/ml的范围内。剂量也可以以病毒基因组的单位(vg)来表示(即，分别为1x10⁷vg、1x10⁸vg、1x10⁹vg、1x10¹⁰vg、1x10¹¹vg、1x10¹²vg、约1.5x10¹²vg、约1x10¹²vg、约3x10¹²vg、约4x10¹²vg、约5x10¹²vg、约6x10¹²vg、约6.5x10¹²vg、约7x10¹²vg、1x10¹³vg、1x10¹⁴vg、1x10¹⁵)。滴定AAV的方法描述于Clark等人,Hum.GeneTher.[人类基因疗法],10:1031-1039(1999)中。

在给予途径为IM途径的前述方法的一些实施例中，给予的rAAV的剂量为约1.5x10¹²至至少约6.5x10¹²vg/kg。(本文中的所有范围旨在表示这些范围中的每个单独的值，以及每个范围的单独的上限值和下限值。)在给予途径为IM的前述方法的一些实施例中，给予的rAAV的剂量为2x10¹²vg/kg。在给予途径为IM的前述方法的一些实施例中，给予的rAAV的剂量为4x10¹²vg/kg。在给予途径为IM的前述方法的一些实施例中，给予的rAAV的剂量为6x10¹²vg/kg。

人类患者是本文设想用于治疗的受试者。人类患者是本文设想用于通过IM递送来治疗的受试者。此类患者包括那些患者，例如：i)被诊断患有CMT1A的成年受试者(>18岁)，ii)在包括周围髓鞘蛋白22(PMP22)基因的17p11.2处展现出1.5Mb重复，iii)任何人种或种族群体的男性和女性，iv)展现出踝背屈肌无力(应具有抵抗重力的完整ROM，但不能保持抵抗重力的完整背屈或能够脚跟站立3秒钟或更长时间(Northstar标准))，iv)神经传导速度异常，v)配合临床评价和重复神经传导研究的能力，以及vi)性活跃受试者在研究过程中愿意采用可靠的避孕方法。合适的患者可不包括，例如具有以下情形的患者：i)基于HIV的临床观察或血清学证据的活性病毒感染，或者甲型、乙型或丙型肝炎感染；ii)正在进行免疫抑制疗法或在试验开始后6个月内的免疫抑制疗法(例如，皮质类固醇、环孢霉素、他克莫司、甲氨蝶呤、环磷酰胺、静脉注射免疫球蛋白)，iii)持续性白细胞减少或白细胞增多(WBC≤3.5K/μL或≥20.0K/μL)或绝对嗜中性粒细胞计数<1.5K/μL，iv)AAV1结合抗体滴度≥1:50，如通过ELISA免疫测定所确定的，v)伴随疾患或需要进行长期药物治疗，PI认为这会带来不必要的基因转移风险，vi)阻碍适当的肌肉强度测试的踝关节挛缩或手术，vii)怀孕、母乳喂养或打算怀孕，viii)其他神经病变的原因，和/或ix)在过去六个月中进行了肢体手术。在示例性的临床方案中，CMT1A患者接受总剂量的载体scAAV1.tMCK.NTF3，其分配至腿的腓肠肌和胫骨前(TA)肌的内侧头和外侧头中，这优先引起CMT中的踝关节无力和不稳定。受试者接受以下中的一种：i)低剂量的2x10¹²vg/kg载体(总剂量)或ii)高剂量的6x10¹²vg/kg载体(总剂量)。

在一个实施例中，在没有稀释剂的情况下通过IM注射来给予载体。在替代性实施例中，用于肌内注射的组合物包括佐剂，例如可以使用芝麻油或花生油或在丙二醇水溶液中，以及无菌水溶液。如果需要的话，可以缓冲此类水溶液，并且首先用盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。可以将rAAV作为游离酸(DNA含有酸性磷酸基团)或药理上可接受的盐的溶液在水中与表面活性剂(如羟丙基纤维素)适当混合来制备。rAAV的分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中、以及油中制备。在通常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。就此而言，所采用的无菌水性介质全部可以通过本领域技术人员熟知的标准技术容易地获得。

适用于注射用途的药物载体、稀释剂或赋形剂包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下该形式必须是无菌的并且必须具有达到容易注射的程度的流动性。其在制造和存储的条件下必须是稳定的并且必须抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用而保存。该载体可以是包含以下各项的一种溶剂或分散介质：例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、其适合的混合物、以及植物油。恰当的流动性可以(例如)通过使用包衣(如卵磷脂)来维持，在分散体的情况下通过维持所需的颗粒大小来维持，以及通过使用表面活性剂来维持。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来防止微生物的作用。在许多情况下，将优选的是包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可通过使用延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射组合物的延长的吸收。

通过以下方式制备无菌可注射溶液：将rAAV以所需的量根据需要与以上枚举的各种其他成分掺入适当的溶剂中，然后过滤灭菌。总体上，通过将灭菌的活性成分掺入无菌媒介物中来制备分散体，该无菌媒介物含有基础分散介质以及来自以上枚举的那些的所需其他成分。就用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术，这些方法产生活性成分的粉末以及来自其以前的无菌过滤溶液的任何另外的所需成分。

rAAV的转导也可以在体外执行。在一个实施例中，将所需的靶肌肉细胞从受试者取出，用rAAV转导并再引入该受试者中。替代性地，可以使用同基因的或异种异体的肌肉细胞，其中那些细胞不会在该受试者中生成不适当的免疫应答。

在另一方面，本文提供了rAAV基因组。给予的rAAV基因组包含在转录控制序列的控制下的NT-3多核苷酸。rAAV基因组缺少AAV rep和cap DNA。rAAV基因组中的AAVDNA可以来自可衍生重组病毒的任何AAV血清型，其包括但不限于AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11和AAVrh.74。这些AAV血清型的基因组的核苷酸序列是本领域中已知的，如以上背景技术部分所述。

在一些实施例中，rAAV基因组的转录控制序列是肌肉特异性控制元件，其包括但不限于源自肌动蛋白和肌球蛋白基因家族的那些(如来自myoD基因家族[参见Weintraub等人,Scienc e[科学],251:761-766(1991)])，肌细胞特异性增强子结合因子MEF-2[Cserjesi和Olson,Mol.Cell.Biol.[分子和细胞生物学],11:4854-4862(1991)]，源自人类骨骼肌动蛋白基因[Muscat等人,Mol.Cell.Biol.[分子和细胞生物学],7:4089-4099(1987)]、心肌肌动蛋白基因的控制元件，肌肉肌酸激酶(MCK)启动子[Johnson等人,Mol.Cell.Biol.[分子和细胞生物学],9:3393-3399(1989)]和MCK增强子，MHCK7启动子(并入了来自肌球蛋白重链的增强子的MCK启动子的修饰形式(Salva等人,Mol.Ther.[分子疗法],15:320-329(2007))，肌间线蛋白启动子，源自骨骼快缩肌钙蛋白C基因、慢缩心肌肌钙蛋白C基因和慢缩肌钙蛋白I基因的控制元件：缺氧可诱导的核因子(Semenza等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],88:5680-5684(1991))，类固醇可诱导的元件和启动子(包括糖皮质激素应答元件(GRE)(参见Mader和White,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],90:5603-5607(1993)))，以及其他控制元件。在一些实施例中，转录控制元件包括MCK启动子。在一些实施例中，转录控制元件包括MHCK7启动子。

在一些实施例中，rAAV基因组中的NT-3多核苷酸是SEQ ID NO:1所列出的NT-3cDNA(对应于SEQ ID NO:11的核苷酸1077-1850)。在一些实施例中，rAAV基因组中的NT-3多核苷酸是Genbank登录号NM_001102654所列出的NT-3 cDNA或SEQ ID NO:1所列出的NT-3cDNA序列，或者是与该NT-3 cDNA具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的变体多核苷酸。在一些实施例中，变体NT-3多核苷酸编码与由SEQ ID NO:1的NT-3 cDNA编码的多肽相同的NT-3多肽。由SEQ ID NO:1所列出或Genbank登录号NM_001102654提供的NT-3 cDNA编码的NT-3多肽的氨基酸序列在SEQ ID NO:2中列出。在一些实施例中，与由SEQ ID NO:1所列出或Genbank登录号NM_001102654提供的NT-3 cDNA编码的多肽的氨基酸序列(SEQ IDNO:2)相比，变体NT-3多核苷酸编码具有至少一个氨基酸序列改变的变体NT-3多肽。氨基酸序列改变可以是例如一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入，优选保守取代。变体NT-3多肽可以具有保留多肽活性的氨基酸取代、缺失或插入的任何组合。一方面，变体NT-3多肽可以具有许多氨基酸改变，使得其氨基酸序列与SEQ ID NO:1所列出或Genbank登录号NM_001102654提供的NT-3 cDNA编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％同一性。

在一些实施例中，rAAV基因组是AAV.tMCK.NTF3基因组，其NT-3基因盒的序列在SEQ ID NO:11中列出并在表4中注释(参见实施例3)。

在又另一方面，提供了包含SEQ ID NO:11所示核苷酸序列的分离的核酸。在一些实施例中，分离的核酸由SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列组成。

还提供了分离的核酸，其以从5’至3’的顺序包含：(i)第一AAV2反向末端重复序列(ITR)(SEQ ID NO:4)；(ii)肌肉肌酸激酶启动子序列(SEQ ID NO:3)；(iii)编码人NT-3多肽的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)；和(iv)第二AAV2 ITR序列(SEQ ID NO:8)，其中该人NT-3多肽具有与SEQ ID NO:2至少90％相同、与SEQ ID NO:2为100％相同、或由SEQ ID NO:11的核苷酸1077-1850编码的氨基酸序列。

设想了包含前述核酸的重组AAV以及包含与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列的rAAV。

提供了包含本披露内容的rAAV基因组的DNA质粒。DNA质粒包含本文设想的rAAV基因组。将DNA质粒转移至允许被AAV的辅助病毒(例如，腺病毒，E1缺失的腺病毒或疱疹病毒)感染的细胞，以将rAAV基因组组装成感染性病毒颗粒。用于产生rAAV颗粒的技术(其中向细胞提供待包装的AAV基因组、rep和cap基因以及辅助病毒功能)在本领域是标准的。rAAV的产生要求单个细胞(在此称为包装细胞)内存在以下组分：rAAV基因组、与rAAV基因组分离(即不在rAAV基因组中)的AAV rep和cap基因、以及辅助病毒功能。AAV rep和cap基因可以来自任何AAV血清型(从该AAV血清型中可以衍生重组病毒)，并且可以来自不同的AAV血清型而不是rAAV基因组ITR，包括但不限于AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11和AAVrh74。假型rAAV的产生披露于例如WO 01/83692中。也设想了其他类型的rAAV变体，例如具有衣壳突变的rAAV。参见例如Marsic等人,Molecular Therapy[分子疗法],22(11):1900-1909(2014)。

生成包装细胞的方法是产生对于AAV颗粒产生而言，稳定表达所有必需组分的细胞系。例如，将包含以下项的质粒(或多个质粒)整合到细胞的基因组中：缺少AAV rep和cap基因的rAAV基因组、与rAAV基因组分开的AAV rep和cap基因、以及选择性标记(例如新霉素耐药性基因)。AAV基因组已通过程序如GC加尾(Samulski等人,1982,Proc.Natl.Acad.S6.USA[美国国家科学院院刊S6],79:2077-2081)、添加含有限制性内切核酸酶切割位点的合成接头(Laughlin等人,1983,Gene[基因],23:65-73)或通过直接的平端连接(Senapathy和Carter,1984,J.Biol.Chem.[生物化学杂志],259:4661-4666)而被引入细菌质粒中。然后用辅助病毒(如腺病毒)感染包装细胞。此方法的优点是，细胞是可选择的，并且适合rAAV的大规模生产。适合的方法的其他实例采用了腺病毒或杆状病毒而不是质粒来将rAAV基因组和/或rep和cap基因引入包装细胞中。产生具有自身互补基因组的rAAV的方法也是本领域已知的。

产生rAAV的一般原理综述于例如Carter,1992,Current Opinions inBiotechnology[生物技术现状],1533-539；和Muzyczka,1992,Curr.Topics inMicrobial.and Immunol.[微生物学和免疫学的当前论题],158:97-129)中。多种方法描述于以下文献中：Ratschin等人,Mol.Cell.Biol.[分子和细胞生物学]4:2072(1984)；Hermonat等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],81:6466(1984)；Tratschin等人,Mo1.Cell.Biol.[分子和细胞生物学]5:3251(1985)；McLaughlin等人,J.Virol.,[病毒学杂志]62:1963(1988)；和Lebkowski等人,1988 Mol.Cell.Biol.[分子和细胞生物学],7:349(1988)。Samulski等人(1989,J.Virol.[病毒学杂志],63:3822-3828)；美国专利号5,173,414；WO 95/13365和对应的美国专利号5,658,776；WO 95/13392；WO 96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441(PCT/US 96/14423)；WO 97/08298(PCT/US 96/13872)；WO 97/21825(PCT/US 96/20777)；WO 97/06243(PCT/FR96/01064)；WO 99/11764；Perrin等人(1995)Vaccine[疫苗]13:1244-1250；Paul等人(1993)Human Gene Therapy[人类基因疗法]4:609-615；Clark等人(1996)Gene Therapy[基因疗法]3:1124-1132；美国专利号5,786,211；美国专利号5,871,982；和美国专利号6,258,595。将前述文件通过引用以其整体特此并入本文，特别强调的是文件中与rAAV产生有关的那些部分。

在另一方面，因此本披露内容提供了产生感染性rAAV的包装细胞。在一个实施例中，包装细胞可以是稳定转化的癌细胞，如HeLa细胞、293细胞和PerC.6细胞(同源293细胞系)。在另一个实施例中，包装细胞是如下细胞，它们是未转化的癌细胞，如低传代293细胞(用腺病毒的E1转化的人胎儿肾细胞)、MRC-5细胞(人胎儿成纤维细胞)、WI-38细胞(人胎儿成纤维细胞)、Vero细胞(猴肾细胞)和FRhL-2细胞(恒河猴胎儿肺细胞)。

可以通过本领域中标准的方法，如通过柱色谱或氯化铯梯度来纯化rAAV。从辅助病毒纯化rAAV载体的方法是本领域中已知的，并且包括披露于例如Clark等人,Hum.GeneTher.[人类基因疗法],10(6):1031-1039(1999)；Schenpp和Clark,Methods Mol.Med.[分子医学方法],69 427-443(2002)；美国专利号6,566,118和WO 98/09657中的方法。

因此，在另一方面，本披露内容设想了包含NT-3多核苷酸的rAAV。在一些实施例中，rAAV包含AAVrh74衣壳和NT-3多核苷酸。在一些实施例中，rAAV的基因组缺乏AAV rep和cap DNA。在这些方法的一些实施例中，rAAV是rAAVrh7.4.tMCK.NTF3。在一些实施例中，rAAV是自身互补基因组。

在另一方面，本披露内容设想了包含本文所述的rAAV的组合物。本披露内容的组合物包含在药学上可接受的载体中的rAAV。这些组合物还可以包含其他成分，如稀释剂。可接受的载体和稀释剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒并且优选地是惰性的，并且包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐或其他有机酸；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐平衡离子，如钠；和/或非离子表面活性剂，如吐温、普朗尼克或聚乙二醇(PEG)。在一些实施例中，将rAAV在Tris、MgCl₂、NaCl和普朗尼克F68中配制。在一些实施例中，将rAAV在含有0.001％普朗尼克F68的20mM Tris(pH8.0)、1mM MgCl₂和200mM NaCl中配制。

本文还设想了组合治疗。本文使用的组合包括同时治疗或顺序治疗。特别设想了本披露内容的方法与标准药物治疗(例如，皮质类固醇和/或免疫抑制药物)的组合，以及与新颖治疗的组合。在各个实施例中，在根据本文设想的方法治疗受试者之前、期间或之后(或以三种可能性中的两种或更多种的组合的任何排列)，用皮质类固醇治疗受试者。例如，这些组合包括在给予rAAV载体之前、期间和/或之后给予皮质类固醇，例如泼尼松龙。

通过以下方式制备无菌可注射溶液：将rAAV以所需的量根据需要与以上枚举的各种其他成分掺入适当的溶剂中，然后过滤灭菌。总体上，通过将灭菌的活性成分掺入无菌媒介物中来制备分散体，该无菌媒介物含有基础分散介质以及来自以上枚举的那些的所需其他成分。就用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术，这些方法产生活性成分的粉末以及来自其以前的无菌过滤溶液的任何另外的所需成分。

刺激肌肉生长

本发明的一个方面提供了在受试者中刺激肌肉生长的方法，其包括向有需要的受试者给予治疗有效量的神经营养因子-3(NT-3)、前NT-3或其有效片段，或者编码NT-3、前NT-3或其有效片段的核酸

在一些实施例中，本发明的方法可用于在受试者中增加肌肉强度、肌肉质量或肌肉耐力以及减少肌肉疲劳。

肌肉可分为三种类型：骨骼肌、心肌和平滑肌。骨骼肌是能够产生力并将该力传递到骨骼的肌肉组织，使得能够呼吸、运动和姿势维持。心肌是心脏的肌肉。平滑肌是动脉和肠壁的肌肉组织。本发明的方法和组合物主要适用于骨骼肌，但另外可对平滑肌产生积极影响。“一个骨骼肌”和“多个骨骼肌”定义为与骨、肌腱和关节相互作用的肌肉。

在一些实施例中，本发明提供了治疗引起肌肉强度降低的疾患、疾病、障碍和病症(在本文中也称为肌肉骨骼疾病，以及肌肉功能障碍和肌肉消耗疾病)的方法。肌肉骨骼疾病的主要类别是肌营养不良和肌肉萎缩。

在一些实施例中，本发明提供了用于治疗肌肉骨骼疾病的方法，这些肌肉骨骼疾病包括肌肉功能障碍和肌肉消耗疾病或障碍(包括遗传性肌病，神经肌肉疾病，肌肉萎缩，药源性肌病，或引起肌肉强度降低的疾患、疾病、障碍或病症)。本发明还提供了用于治疗神经病变(如CMT-遗传性和CMT1A)以及轴突和脱髓鞘性多发性神经病变(如慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病变)的方法。该治疗方法包括向有需要的患者给予治疗有效量的神经营养因子-3(NT-3)、前NT-3或其有效片段，或者编码NT-3、前NT-3或其有效片段的核酸。在一些实施例中，受试者患有选自由以下组成的组的肌肉疾病：少肌症、恶病质、II型肌纤维萎缩、和与受损的再生放射状生长阶段相关的获得性自身免疫性原发性肌肉障碍。

在一些实施例中，NT-3可用于治疗肌肉萎缩。肌肉萎缩是通用术语，其用于描述以由多种疾病、障碍、其他病症或事件导致的肌肉组织的消耗或丧失为特征的病症。肌肉萎缩可能是以下(但不限于以下)的结果：由严重烧伤后的恢复所致的长期固定、主要关节置换手术、神经性疼痛、周围神经病变、坏死性血管炎、零重力环境(例如，宇航员和航天员)、长期住院、退行性疾病(例如，肌萎缩侧索硬化)和器官移植以及脊髓损伤、慢性血液透析和中风。

在一些实施例中，NT-3可用于治疗废用性肌肉萎缩。废用性肌肉萎缩是以由长期不活动所致的肌肉组织消耗或丧失为特征的病症。废用性肌肉萎缩可能是以下(但不限于以下)的结果：由严重烧伤后的恢复所致的长期固定、主要关节置换手术、神经性疼痛、零重力环境(例如，宇航员和航天员)、长期住院、厌食和器官移植以及脊髓损伤、慢性血液透析和中风。

在一些实施例中，NT-3可用于治疗年龄相关性肌肉萎缩。年龄相关性肌肉萎缩是这样的病症，其特征是随着受试者年龄的增长，肌肉组织消耗或丧失以及纤维化组织代替肌肉组织。

在一些实施例中，NT-3可用于治疗少肌症。少肌症是这样的病症，其特征是随着受试者年龄的增长，肌肉组织消耗或丧失以及纤维化组织代替肌肉组织。

在一些实施例中，NT-3可用于治疗恶病质中的肌肉消耗。恶病质是某个人的体重减轻、肌肉萎缩、疲劳、无力和明显食欲不振(不是主动试图减肥而是慢性疾病的结果)。恶病质的肌肉消耗组分可能是以下(但不限于以下)的结果：癌症、多发性硬化症、肺结核、获得性免疫缺陷综合征、人类免疫缺陷病毒、营养不良、帕金森病、肺气肿、心力衰竭、运动神经元疾病、囊性纤维化、痴呆、少肌症、慢性阻塞性肺疾病、肾病和肾衰竭。

在一些实施例中，NT-3可用于治疗由病毒感染(例如，HIV、爱泼斯坦-巴尔病毒)、细菌感染(例如，分枝杆菌和立克次氏体)、脊髓灰质炎后综合征和寄生虫感染(例如，锥体虫和血吸虫)所致的肌肉消耗，其中受试者具有发展肌肉萎缩的风险。

神经营养因子-3

在一些实施例中，将治疗有效量的NT-3、前NT-3或其NT-3类似物给予至受试者以刺激肌肉生长。神经营养因子3(NT-3)是神经营养因子NGF(神经生长因子)家族中的神经营养因子。NT-3是蛋白质生长因子，其对周围和中枢神经系统的某些神经元具有活性；它以帮助支持现有神经元的存活和分化而闻名，并且鼓励新神经元和突触的生长和分化。

本披露内容包括与Cx26的胞外结构域的氨基酸序列的至少一部分基本相似的封闭肽。如本文所用，术语“一部分”是指Cx26的胞外结构域内的氨基酸序列，其包括至少4个氨基酸。在另外的实施例中，一部分是指长度为至少6个氨基酸的氨基酸序列、长度为至少8个氨基酸的氨基酸序列或长度为至少10个氨基酸的氨基酸序列。因此，封闭肽由至少4、6、8或10个氨基酸组成。同样，本文所述的封闭肽可具有最大的大小。封闭肽的最大大小与肽的整体大小有关，并且包括与肽连接的任何另外的序列，如蛋白质转导结构域。在一些实施例中，封闭肽具有小于约200个氨基酸的最大大小，而在其他实施例中，封闭肽具有小于约100个氨基酸的最大大小。在其他实施例中，封闭肽具有75个氨基酸或更少、50个氨基酸或更少、40个氨基酸或更少、30个氨基酸或更少、或20个氨基酸或更少的最大大小。

如本文所用，术语“多肽”是指寡肽、肽或蛋白质序列，或者指任何这些的片段、部分或亚基，以及指天然存在的或合成的分子。术语“多肽”还包括通过肽键或修饰的肽键彼此连接的氨基酸(即肽电子等排体)，并且可以含有任何类型的修饰的氨基酸。术语“多肽”还包括肽和多肽片段、基序和类似物、糖基化的多肽、所有“模拟的”和“拟肽的”多肽形式以及逆反(retro-inversion)肽(也称为全D-retro或mtro-对映体肽)。

“基本上相似”意指给定的氨基酸(或核酸)序列与参考序列具有至少85％、更优选至少90％、以及甚至更优选至少95％同一性。在比对序列并引入空位(如果需要的话)以实现最大的同源性百分比并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分后，在本文中将关于此类序列的同一性或同源性定义为候选序列中与已知肽相同的氨基酸残基的百分比。N末端、C末端或内部延伸、缺失或插入肽序列中不应解释为影响同源性。

基本上相似的肽包括因一个或多个氨基酸改变而不同的那些，其中这些改变，例如氨基酸残基的取代、添加或缺失不会消除相关肽的特性，如它们与FAK或NANOG缔合的能力。此外，仅描述或编码其中仅在保守区域进行保守取代的蛋白质的序列总体上基本相似。优选地，基本上相似的序列也保留多肽的独特活性。

保守取代的实例包括：非极性(疏水性)残基如异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸间的相互取代。同样，本发明设想了一个极性(亲水性)残基的取代，如精氨酸与赖氨酸之间、谷氨酰胺与天冬酰胺之间、以及甘氨酸与丝氨酸之间的取代。另外，还设想了碱性残基(如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)取代另一个，或一个酸性残基(如天冬氨酸或谷氨酸)取代另一个。非保守取代的实例包括非极性(疏水性)残基(如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、蛋氨酸)取代极性(亲水性)残基(如半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸)，和/或极性残基取代非极性残基。

短语“保守取代”还包括使用化学衍生的残基代替非衍生的残基，只要该肽保留与NT-3缔合的必要能力即可。基本上相似的肽还包括另外的氨基酸的存在或一个或多个氨基酸的缺失，这不影响与NT-3缔合的必要能力。例如，基本上相似的肽可以含有N或C末端半胱氨酸，如果需要的话，该肽可以通过其共价附接至载体蛋白(例如白蛋白)。这种附接可以减少肽从血液的清除，并且还可以降低肽的蛋白质水解速率。另外，出于本发明的目的，含有D-氨基酸而不是L-氨基酸的肽也包括在术语“保守取代”中。此类D-异构体的存在可以帮助最小化蛋白水解活性和肽的清除。

在一些实施例中，将前神经营养因子-3蛋白(前NT-3)给予至受试者。神经营养因子-3的前体形式是约30kDa的NT-3前体形式，可通过酶切割和去除约15kDa的N末端前结构域而转化为成熟NT。参见Tauris等人,Eur.J Neurosci[神经科学杂志],33(4),622-631(2011)。

肌肉萎缩的治疗

本发明提供了治疗患有周围肌肉萎缩的受试者的方法。丙酮酸化合物可用于提供预防性和/或治疗性治疗。丙酮酸化合物可以例如在周围神经病变发生之前预防性地给予至受试者。预防性(即预防的)给予有效地降低在受试者中后续发生周围神经病变的可能性，或降低后续发生的周围神经病变的严重程度。可以向具有发展周围神经病变的升高风险的受试者(如具有周围神经病变的家族史的受试者)提供预防性治疗。髓鞘蛋白22(PMP22)突变的表达代表所有发生的腓骨肌萎缩神经病变的70％-80％，因此，它们的存在可用作选择接受使用本文所述丙酮酸化合物的治疗的患者的标准。

替代性地，可以将本发明的化合物治疗性地给予至已经被周围神经病变折磨的受试者。在治疗性给予的一个实施例中，这些化合物的给予有效地消除周围神经病变；在另一个实施例中，丙酮酸化合物的给予有效地降低周围神经病变的严重程度或延长受此折磨的受试者的寿命。在一些实施例中，治疗方法由以下组成：在相当长的一段时间内向受试者给予在药学上可接受的配制品中的治疗有效量的丙酮酸化合物。

CMT变体

腓骨肌萎缩(CMT)遗传性神经病变是指一组以慢性运动和感觉多发性神经病变为特征的障碍，也称为遗传性运动和感觉神经病变。常染色体显性CMT神经病变类型为：脱髓鞘性(也称为CMT1)、轴突非脱髓鞘性(也称为CMT2)和显性中间型CMT(DI-CMT)。也等同于CMT的其他神经病变是远端遗传性运动神经病9dHMN)和远端脊柱肌肉萎缩(DSMA)和德热里纳-索塔斯(Dejerine-Sottas)综合征(DSS)。CMT神经病变的描述和分类描述于Bird,GeneReviews[基因综述],西雅图华盛顿：西雅图华盛顿大学PIM20301532,更新于2018年6月28日。

目前，与CMT相关的基因已知有70多种已知的基因变体。这些基因变体使用Magy等人(Neurology[神经病学]90:e870-6,2018)的分类系统提供在以下表1中。每个与CMT相关的基因变体的固有模式为常染色体显性(AD)、常染色体隐性(AR)或X连锁(XL)的。对于每个与CMT相关的基因变体的神经病变是轴突(Ax)、脱髓鞘性(De)和中间型(In)的。表1中提供的“其他名称”是在其他分类系统中使用的名称，包括显性中间型CMT(DI-CMT)、远端脊柱肌营养不良(DSMA)、遗传性感觉和自主神经病变(HSAN)和远端遗传性运动神经病变(dHMN)。

表1

MOI＝遗传方式

AD＝常染色体显性

AR＝常染色体隐性

XL＝X连锁

Ax＝轴突

De＝脱髓鞘

In＝中间型

UMN＝上运动神经元

DI-CMT＝显性中间型CMT

DSMA＝远端脊柱肌肉萎缩

ALS＝肌萎缩侧索硬化

HSAN＝遗传性感觉和自主神经病变

dHMN＝远端遗传性运动神经病变

给予和配制品

可将与本发明的一些实施例一起使用的载体或肽掺入适合给予至受试者的药物组合物中。在一些特定的实施例中，该药物组合物包含本发明的载体和药学上可接受的载体。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等中的一种或多种，以及它们的组合。在许多情况下，可优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(诸如甘露醇、山梨醇)、或氯化钠。药学上可接受的载体可进一步包含少量辅助物质(如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂)，其延长载体或药物组合物的保质期或增强其有效性。

这些载体或肽可以急性地给予(即在发病期间或在导致肌肉萎缩的事件发生后不久)，或者可以预防性地给予(例如，在计划的手术前或出现体征或症状之前)，或者在肌肉萎缩的病程期间给予以减轻或改善原本会发生的症状进展。给予的时间和间隔根据受试者的症状而变化，并且可以以数小时至数天的间隔，在数小时、数天、数周或更长时间的时间过程中给予，这将由本领域技术人员确定。

含有载体或肽的组合物通常在静脉内给予。当静脉内给予时，这些组合物可以与其他成分(如载体和/或佐剂)组合。肽也可以共价附接至蛋白质载体(如白蛋白)以最小化肽的清除。对其他成分的性质没有限制，但此类成分必须是药学上可接受的，对于其预期的给予有效并且不会降低组合物的活性成分的活性。

适合于注射的药物形式包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，最终的溶液形式必须是无菌和液体的。典型的载体包括溶剂或分散介质，其包括例如水缓冲水溶液(即生物相容性缓冲液)、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇、其合适的混合物)、表面活性剂或植物油。灭菌可以通过任何本领域公认的技术来完成，该技术包括但不限于过滤或添加抗细菌剂或抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇(chlorobutano)、苯酚、山梨酸或硫柳汞。此外，可将等渗剂如糖或氯化钠掺入主题组合物中。

含有主题肽的无菌可注射溶液的产生是通过将这些化合物以所需量掺入具有上述各种成分的适当溶剂中，然后根据需要进行灭菌，优选过滤灭菌。为了获得无菌粉末，根据需要将上述溶液真空干燥或冷冻干燥。

当口服给予本发明的肽时，含有有效剂量的肽的其药物组合物还可以含有作为可同化的食用载体等的惰性稀释剂，在硬壳或软壳明胶胶囊中，压制成片剂，或者可以在酏剂、悬浮液、糖浆等中。因此，将本发明肽以药学上有效的量与治疗有效量的合适的药学上可接受的载体混合以用于方便和有效的给予。

如本文所用，表述“有效量”或“治疗有效量”是指足以刺激肌肉生长或减少或预防肌肉萎缩的药剂的量。所需的确切量将因受试者而异，取决于受试者的物种、年龄和一般状况、特定的治疗剂、其给予模式和/或途径等。然而，应理解的是，本发明的化合物和组合物的总日用量可以由主治医师在合理的医学判断的范围内决定。对于任何特定患者或生物体的特定治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括正在治疗的障碍和障碍的严重程度；所用特定化合物的活性；所使用的特定组合物；受试者的年龄、体重、总体健康、性别和饮食；给予时间、给药途径和所用特定组合物的排泄率；治疗的持续时间；与所用特定组合物组合或巧合使用的药物；以及医学领域众所周知的因素。

可以将载体或肽以与剂量配制品相容的方式并且以同样在治疗上有效的这种量给予。全身性剂量取决于患者的年龄、体重和状况以及给予途径。例如，向成年人给予的肽的合适剂量在每千克体重约0.001至约20.0mg的范围内。肽应优选以每剂量至少约50mg、更优选以每剂量至多约500mg至约1g的量给予。由于本发明的肽组合物最终从血流清除，因此指示并优选重新给予这些组合物。

实例

因此，通过以下实例说明本发明的方面和实施例。然而，在本发明的范围之内还有各种各样的其他实施例，而不应该限于本文提供的特定实例。

实例1

AAV1.NT-3基因疗法通过激活CMT小鼠模型中的mTOR途径和代谢重塑来增加肌肉纤维直径

NT-3对周围神经和许旺细胞具有公认的作用，即促进轴突再生和相关的髓鞘形成。评估了AAV.NT-3基因疗法对基因注射后16周时颤抖(TrJ)小鼠的神经源性肌肉氧化状态的作用，并且发现肌肉纤维大小的增加与肌肉纤维的氧化状态朝着野生型中的纤维类型比率的正常化的变化相关。NT-3诱导的纤维大小增加对于快缩糖酵解纤维群体最为突出。TrJ肌肉的这些变化伴随着4E-BP1和S6蛋白磷酸化水平的升高，其作为mTORC1激活的证据。与此同时，TrJ肌肉中线粒体生物发生调节因子PGC 1α的表达水平和糖酵解标记物(HK1和PK1)增加。体外研究显示重组NT-3可以直接在表达TrkC的肌管中而不是在成肌细胞中诱导Akt/mTOR途径激活。此外，与成肌细胞相比，肌管中肌细胞生成素的表达水平显著高而p75NTR表达下调，这指示NT-3诱导的成肌细胞分化与mTORC1激活相关。这些研究首次显示，NT-3通过直接激活mTOR途径增加神经源性肌肉中的肌肉纤维直径，并且对于快缩纤维，纤维大小的增加更为突出。

方法

动物、治疗方案和组织病理学：TrJ小鼠(B6.D2-Pmp22Tr-J/J)和C57BL/6野生型从杰克逊实验室(巴尔港，缅因州)获得。将9至12周大的TrJ小鼠在左腓肠肌中注射PBS(n＝6)或3x10¹⁰vg的自身互补(sc)AAV1.tMCK.NT-3载体(n＝6)。向另一TrJ小鼠群组注射1x10¹¹vg的单链AAV1.CMV.NT-3，以诱导高NT-3表达水平，以进行比较(n＝6)。WT小鼠接受PBS(n＝6)或3x10¹⁰vg的scAAV1.tMCK.NT-3载体(n＝4)。对各组小鼠实施安乐死，并在基因注射后16周时收获它们的肌肉，并处理用于恒冷箱切片。琥珀酸脱氢酶(SDH)酶组织化学用于使用内部建立的标准方案评估代谢纤维类型分化。肌肉纤维类型比直径测量值是从12[tin厚-SDH染色的截面获得的。三个图像分别代表腓肠肌沿中线轴(每只动物的每个区域的每个切片)的三个不同区域(主要由STO组成的深层区域、显示STO和FTO或FTG的棋盘状外观的中间区域以及主要由FTG纤维组成的浅表区域)，它们是使用Olympus BX41显微镜和SPOT相机以X20放大倍数拍摄的。选择该方法来拍摄每个区域中响应于治疗所致代谢变化的纤维氧化状态改变。使用Zeiss Axiovision LE4软件通过测量跨肌肉纤维的最短距离来确定深色(STO)、中间(FTO)和浅色FTG纤维的直径，并将其表示为总纤维的百分比。平均纤维直径(平均值±SEM)由每个群组中所有3种纤维类型的组合得出。测量每组平均1250个纤维(在960与1486之间)。

AAV.NT-3载体的产生和效力：先前描述了在tMCK或CMV启动子下具有含NT-3的血清型1的自身互补AAV病毒载体的设计，这些病毒载体产生于美国国家儿童医院病毒载体核心(Viral Vector Core at Nationwide Children's Hospital)，Columbus.Sahenk等人,Mol Ther[分子疗法],22(3):511-521(2014)。将等分的病毒在-80℃下保持直至使用。在注射后6周和16周时在麻醉下通过眼出血从治疗的和未治疗的小鼠收集血样，并使用捕获ELISA测定血清的NT-3水平。

C2C12成肌细胞培养和肌管形成：C2C12成肌细胞在37℃和5％CO2下在加湿室内在由补充有10％FBS(飞世尔科技公司(Fisher Scientific)，#26-140-079，加利福尼亚州卡尔斯巴德)和1％青霉素/链霉素溶液(Gibco-Invitrogen，#15640055，加利福尼亚州卡尔斯巴德)的DMEM培养基(Gibco-Invitrogen，#10569010，加利福尼亚州卡尔斯巴德)组成的生长培养基(GM)中培养。通过将GM转换为分化培养基[补充有5％马血清(Gibco-Invitrogen，#26050088，加利福尼亚州卡尔斯巴德)和1％青霉素/链霉素溶液(Gibco-Invitrogen，#15640055，加利福尼亚州卡尔斯巴德)的DMEM培养基(Gibco-Invitrogen，#11965092，加利福尼亚州卡尔斯巴德)]，在汇合的培养细胞上诱导肌管形成。在诱导肌管形成后3天开始用肌管进行所有随后的测定，包括QPCR、蛋白质印迹和ELISA。将成肌细胞和肌管二者均暴露于6孔板中浓度为100ng/ml的重组人NT-3(Pepprotech，新泽西州洛基山)中。根据制造商的说明书，通过使用葡萄糖和乳酸测定试剂盒(伊顿生物科技公司(EtonBioscience)，加利福尼亚州圣地亚哥)，收集培养基以检测葡萄糖消耗和乳酸形成。

QPCR实验：在终点处从NT-3治疗和未治疗的对照小鼠的腓肠肌分离总RNA。在NT-3治疗之前和之后48小时从成肌细胞和肌管分离总RNA。使用mirVana RNA分离试剂盒(美国生命技术公司(Life Technologies)，#AM1560，美国德克萨斯州)，随后按照制造商的说明书使用Trascriptor First Strand cDNA合成试剂盒(瑞士罗氏公司(Roche)，#04379012001，美国瑞士罗氏)合成cDNA。其他qPCR实验是通过使用iTaqTm通用Green supermix(伯乐公司(Biorad)，#1725122，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯)进行的。PGC 1α(Cunningham等人,Nature[自然],450(7170):736-740(2007))和GAPDH(Toscano等人,Mol Ther[分子疗法],18(5):1035-1045(2010))(管家基因)的引物序列发现于文献中。其他引物序列发现于引物条带。Wang等人,Nucleic acids research[核酸研究],40(Database issue[数据库发布]):D1144-1149(2012)。所有qPCR实验均使用ABI 7500实时PCR机器进行，并使用数据辅助软件(ABI)分析结果。

蛋白质提取和蛋白质印迹实验：将冷冻的腓肠肌肌肉块切成20μin的厚度，放入2ml小塑料管中(每块15-20个切片)，并在裂解缓冲液[具有lx Halt蛋白酶抑制剂(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher)，#78429，美国)和lx磷酸酶抑制剂(Sigma，#P0044，美国)的RIPA裂解缓冲液(赛默飞世尔公司，#89900，美国)]中使用自动颗粒混合器和一次性研杵均质化，每次20秒时间，共三次。为了进行体外信号转导测定，将成肌细胞和肌管在与NT-3(100ng/ml)孵育30分钟后，收集在2ml小试管中，并按照上述相同的方式进行裂解。将裂解物在4℃下以13,000rpm离心10分钟，并小心收集上清液。通过使用BCA蛋白质测定试剂盒(赛默飞世尔公司，#23252，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)测量蛋白质浓度。将蛋白样品(10-40itg)在4％-12％Bis-Tris Plus预制的10或15孔聚丙烯酰胺凝胶(赛默飞世尔公司，#NW04120BOX)中跑胶，并转移到PDVF膜(通用电气医疗集团(GE Healthcare)，#10600021，美国匹兹堡)。将膜在室温下用5％牛血清白蛋白(BSA，美国马萨诸塞州贝德福德(Bedford))在具有0.05％吐温20(TBS-T，Amresco，美国俄亥俄州)的TBS缓冲液中封闭2小时，并与适当的一抗在具有5％BSA的TBS-T缓冲液中于4℃下在冷室中孵育过夜。本研究中使用的一抗如下：抗磷酸S6蛋白Ser235/236(#4858)、抗S6蛋白(#2217)、抗磷酸AktSer473(#4060)、抗Akt(#9272)、抗磷酸4E-BP1 thr37/46(#2855)、抗4E-BP1(#9644)、抗GAPDH(圣克鲁斯，#sc365062)。用TBS-T在定轨振荡器上洗涤5分钟洗涤5次后，将膜与来自美国明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D Systems的二抗[HRP缀合的抗兔(#HAF008)、HRP缀合的抗小鼠(HAF007)]在TBS-T缓冲液中的5％干奶中孵育1小时。将膜用上述相同的方法再次用TBS-T洗涤，然后与ECL Prime western检测试剂(Amersham，#RPN2232，美国新泽西州)孵育1-3分钟，然后使用多个暴露时间将其暴露于X射线胶片(Denville，#E3018，美国马萨诸塞州)。使用相机(Sony A600，日本)对胶片上的蛋白质条带进行拍照，并使用(Quantity-One软件，伯乐公司，v.4.6.9)对条带强度进行定量。通过将条带强度针对同一样品中GAPDH的含量归一化，确定每个样品中所分析的蛋白质的相对含量。将膜用0.1％考马斯亮蓝R染色剂(赛默飞世尔公司，美国)染色，冲洗并拍照，以确认每个泳道中的蛋白质上样相等。

统计学：对于治疗组与未治疗组之间的肌纤维大小比较，使用单因素方差分析(方差分析(Anova))在Graph pad Prism6软件中进行统计分析。如果适用于其他统计分析，则进行学生t检验或单因素方差分析。显著性水平设定为P<0.05。在所有实验中结果均以平均值±SEM给出。

结果

AAV1.NT-3诱导的TrJ肌肉纤维类型重塑

先前在TrJ肌肉中，观察到从快型纤维向慢型纤维的转变是神经病变性表型的一部分。Nicks等人,JNeuropathol Exp Neurol[神经病理学与实验神经学杂志],72(10):942-954(2013)。在本研究中，SDH染色被用于通过从所述肌肉的深层、中间和浅表区域取样来评估TrJ和年龄相匹配的WT的腓肠肌中的代谢纤维类型分化。在基因注射后16周时，与显示神经源性变化、小角纤维和类型组群的未治疗(PBS)组相比，STO纤维显著减少，并且特别是FTO和FTG类型的纤维大小增加(图1A和图1B)。定量研究显示，在TrJ-PBS肌肉中，每单位面积的STO纤维的数量和百分比二者均显著高于WT肌肉，这与先前的研究一致。在治疗组中，具有导致低(tMCK)或高(CMV)NT-3表达(图4)的两种启动子的1x10¹¹vg剂量的AAV1.NT-3显示纤维类型从STO到FTO/FTG纤维的转变。两个治疗组中的STO的平均密度或百分比(来源于每组中n＝3-5只小鼠)与WT肌肉无显著差异，这指示朝着在NT-3情况下的纤维类型分布的正常化的变化(图1C)。此外，AAV1.NT-3治疗的WT肌肉在纤维类型分布谱中没有显示出显著的变化。

在TrJ小鼠中的NT-3治疗显示出对肌肉纤维大小增加的不同作用(表2)。当NT-3在tMCK启动子的控制下表达时，仅在FTG纤维中观察到显著的直径增加。在第二个治疗群组中，其中使用CMV启动子获得了高NT-3表达，所有纤维类型的直径均显著增加。有趣的是，这种剂量依赖性的NT-3作用仅在神经源性TrJ肌肉中可见；在基因注射后16周的同一时间点，采用NT-3基因疗法的WT肌肉中的任何纤维类型均未见显著的直径变化。

表2显示，对于快缩纤维，NT-3基因疗法后神经源性TrJ肌肉的纤维大小增加更为明显。

平均纤维直径

*，p<0.001

AAV-NT-3改善TrJ肌肉中的mTOR信号传导和代谢标记物

上文显示的响应于AAV1.NT-3治疗的TrJ肌肉的组织学发现提示了对于mTORC1激活是否在NT-3诱导的肌肉纤维放射状生长中发挥作用的研究。mTORC1的活性是通过各组肌肉样品中其下游底物4EBP-1和核糖体S6P的磷酸化水平来评估的。在AAV1.NT-3治疗的TrJ肌肉中，磷酸化4EBP-1和S6P的水平与从TrJ-PBS对照获得的未治疗的对应物相比显著增加(图2A)。相比之下，发现NT-3治疗没有显著影响WT肌肉中4EBP-1和S6P的磷酸化水平(图2B)。

mTORC1经由4E-BP来调节细胞核编码的线粒体蛋白的合成、控制线粒体活性和生物发生，从而协调能量消耗和产生[17]。因此，在NT-3治疗的TrJ肌肉中，线粒体生物发生的主要调节因子PGC 1α被上调，这指示NT-3能够逆转在神经源性肌肉中所见的PGC 1α的有缺陷的表达水平(图2C)。与缺乏mTORC1激活相一致，用NT-3治疗的WT肌肉中未见PGC 1α表达水平的变化(图2C)。采用NT-3基因疗法的TrJ肌肉的纤维大小增加主要发生在FTO和FTG纤维中，这些纤维的糖酵解活性高于慢纤维[18]。一致地，还发现在治疗的TrJ肌肉中糖酵解限速酶HK1和PK1的表达上调，这表明糖酵解通量增加。这些变化在AAV.NT-3治疗的WT肌肉中不显著。

NT-3激活C2C12肌管中通过TrkC受体的Akt/mTORC1途径

本文所述的体内研究显示，TrJ肌肉中AAV1.NT-3治疗诱导的纤维大小增加和纤维类型重塑与mTORC1激活相关。然而，需要回答以下问题，即这种变化仅是神经再支配的结果，还是与神经再生无关NT-3可以直接改变肌肉蛋白合成和细胞代谢。下一步，通过将C2C12成肌细胞和肌管暴露于重组NT-3，研究了在不受神经的影响的情况下NT-3对体外系统中mTOR途径的直接作用。结果指示，NT-3可以诱导肌管中而非成肌细胞中的Akt/mTOR途径激活(图3A)。与对照组相比，用100ng重组NT-3治疗肌管30分钟导致Akt、4EBP1和S6P的磷酸化显著更高(图3A)。在另一组实验中，发现孵育48小时后，NT-3在肌管中显著增强了线粒体生物发生标记物PGC 1α和糖酵解标记物PK1的表达(图3B)。因此，在该时间点的上清液分析揭示与对照相比，NT-3治疗的肌管中葡萄糖消耗增加和乳酸产生增加(图3C)。在进行这些实验的条件下，未观察到NT-3对HK1表达水平的影响。

分析了p75NTR和TrkC受体以及肌细胞生成素(它是成肌细胞进入成肌细胞和肌管培养物中的分化途径中的标记物)的表达。NT-3通过其优选受体TrkC或与低亲和力神经营养因子受体p75NTR结合发挥其生物学作用。Schecterson LC,Bothwell M,Neuron[神经元],9(3):449-463(1992)。p75NTR在C2C12成肌细胞中表达，并在成肌分化过程中被下调。Seidl等人,Journal of cellular physiology[细胞生理学杂志],176(1):10-21(1998)。已经显示神经营养因子NGF经由p75NTR影响成肌分化和细胞生长，并且p75NTR的下调被认为对于成肌分化是必需的。类似于NGF作用，发现NT-3也增强肌管中肌细胞生成素的表达，并且正如所预期的，这与成肌细胞中p75NTR的表达明显高于肌管中相关，而TrkC表达水平在两组中没有差异(图3D)。NT-3对成肌细胞或肌管中这些受体的表达水平所起到的影响没有差异。

讨论

本文提供的证据是NT-3可以直接影响神经源性肌肉代谢，从而经由mTORC1激活导致纤维大小增加和纤维类型朝着正常化而重塑。纤维大小的增加对于II型纤维、特别是对于FTO亚型最为明显。此外，已经显示NT-3作为对其在神经源性肌肉中体内作用的重要贡献者，可以直接诱导肌管中而非成肌细胞中的Akt/mTOR途径激活。有趣的是，在WT肌肉中相同剂量下的NT-3基因疗法没有影响这些特性，但未研究使用基因疗法范例时NT-3对去神经支配的WT肌肉的作用。先前已经显示了在有或没有将NT-3局部递送至神经挤压部位的情况下，在神经修复后8个月在大鼠腓肠肌中NT-3对II型肌肉纤维亚型的差异作用，并且发现IIb型纤维的比例和大小恢复正常。Sterne等人,J Cell Biol[细胞生物学杂志],139(3):709-715(1997)。然而，此作用被解释为对运动靶器官具有有益结果的由NT-3增强的轴突再生，以及NT-3的可能性可以特异性地影响可决定IIb型肌肉纤维表型的运动神经元亚组。可以认为，我们的体内研究的发现可以代表NT-3对神经和肌肉的联合作用。然而，我们的体外数据强调以下证据，即NT-3经由Akt/mTORC1的激活对肌肉代谢具有直接作用，并且这种直接作用可能在神经源性肌肉中是重要的，从而导致FTG即Erb型纤维的优先大小增加。

在条件转基因小鼠中，表达Akt的组成性活性形式由于III型肌肉纤维的生长而导致肌肉肥大。Izumiya等人,Cell metabolism[细胞代谢],7(2):159-172(2008)。这与糖酵解中涉及的转录物的上调、增加的葡萄糖消耗和乳酸产生相关，而这些与较低的胰岛素水平、血液中增加的胰高血糖素水平以及对高脂饮食诱导的肥胖的抵抗相关联。相反，mTOR失活与糖酵解酶PK1和HK1的减少相关。Risson等人,J Cell Biol[细胞生物学杂志],187(6):859-874(2009)。在我们的研究中，TrJ肌肉中的AAV.NT-3治疗增加FTG纤维的大小以及糖酵解酶PK-1和HK-1的表达。此外，体外研究揭示NT-3增加肌管中葡萄糖摄取和乳酸形成以及PK-1的上调。尽管这些结果表明NT-3可能通过调节快速/糖酵解纤维参与控制全身代谢，但需进一步研究以详细表征其作用。此外，AAV.NT-3治疗能够逆转在TrJ神经源性肌肉中所见的PGC1α有缺陷的表达水平以及升高的激活4E-BP1水平。先前表明在骨骼肌中，mTOR通过4E-BP1/PGC1α调节线粒体的生物发生和代谢。Tsai等人,JClin Invest[临床研究杂志],125(8):2952-2964(2015)。NT-3也可能在通过在肌肉中激活4EBP1和PGClα来促进氧化磷酸化中发挥作用。

NT-3首先以高水平发现于胎儿发育过程中的中枢神经系统(CNS)中，而在成年大脑中减少，这表明它在早期神经元发育中具有重要作用[28,29]。NT-3在周围神经中也很重要，并且在神经肌肉发育的多个阶段具有积极作用。在非洲爪蟾神经肌肉共培养物中，肌肉来源的NT-3显著增强神经肌肉接点处突触传递的成熟度[30-33]。此外，NT-3增加神经肌肉系统的关键元件即SC的存活[34]。在SC中表达的NT-3促进神经再生，并且是自分泌存活环的重要组分，确保SC在成年神经中的存活和分化[35-39]。在CMT1A小鼠模型的研究中，观察到NT-3的若干种重要生物学作用：(i)SC数量增加、(ii)有髓纤维数量增加、和(iii)轴突神经丝细胞骨架正常化[5,40]。此处特别关注的另一个NT-3作用是髓鞘厚度的增加，这被视为NT-3可能影响髓鞘蛋白产生的形态学证据。

较早的研究已经显示大量的证据证明mTORC1在调节CNS的髓鞘形成中起作用。组成性活性Akt激酶的转基因过表达足以增强经由mTOR信号传导的CNS中的髓鞘膜生长[41,42]，并且在少突胶质细胞祖细胞中的由IGF-1刺激的蛋白质合成需要PI3KJAkt和MER/ERK途径[43]。靶向翻译机构的NT-3刺激髓鞘蛋白合成的能力首次显示在少突胶质细胞原代培养物中[44]。发现NT-3通过PI3K/mTOR途径上调少突胶质细胞中的4EBP1磷酸化。使用基因失活方法去除特别是在SC中的mTOR功能影响该SC正常形成髓鞘的能力[45]。实际上，在突变体中发现髓鞘是薄的，节间长度短并且轴突的放射状生长受损。此外，mTOR下游靶标S6和4E-BP1的磷酸化程度较低[45]。

根据这些先前的研究，NT-3对肌肉纤维直径增加的作用可能是通过相同的机制，即经由mTORC1激活的直接作用。重要的是，应注意，WT肌肉中以在TrJ中使用的相同剂量的NT-3基因疗法没有诱导纤维类型大小或类型分布的显著变化。WT肌肉中的这些观察结果表明，NT-3作用并不针对分化良好或正常功能的细胞，而是对病理过程可能导致的重塑的细胞代谢起作用。一个支持的证据是，NT-3不改变WT动物中挤压损伤后的功能恢复，仅导致比对照或NGF治疗的动物稍微多的轴突[46]。我们评估scAAV1.tMCK.NT-3的毒理学研究与这些观察结果一致，未显示在以1X10¹³vg/kg(比CMT1A治疗的人体试验推荐的最高剂量高10倍)给药的C57BL/6或TrJ小鼠中与治疗相关的器官组织的毒性或组织病理学异常。

在肌肉发育过程中，p75NTR在形成肌管/肌肉纤维或分化为卫星细胞的成肌细胞上瞬时表达[23]。受体的时间表达模式指示p75NTR在分化前介导成肌细胞的存活，并且在肌生成过程中此受体的活性对于发育肌肉是重要的[23]。类似于NGF作用[21]，发现NT-3增强肌管中肌细胞生成素的表达，并且正如所预期的，这与成肌细胞中p75NTR的显著更高的表达相关，而p75NTR的表达在肌管中被显著下调。检查了TrJ和WT肌肉样品中的p75NTR和TrkC表达，并且发现与WT相比，神经源性TrJ肌肉中此二者显著高的表达水平，并且这些水平响应于NT-3而下降(图5)。但有趣的是，但这一观察结果无法得出关于哪种细胞类型表达这些受体，或者它们是否在全部肌肉纤维或仅肌肉纤维的亚型中、在卫星细胞或SC中表达的结论。NT-3和其他神经营养因子及其受体在人类肌肉疾病中的表达的可用数据是有限的。然而，迄今为止，最新的研究结合了肌肉活检的组织学研究与原代肌肉前体细胞的分子和细胞分析，这些最新研究已经显示p75NTR在体内大多数卫星细胞中表达，并且是发炎和营养不良的肌肉中纤维再生的标记物[47,48]。我们在神经源性肌肉中的发现特别令人感兴趣，并且需要对不同疾病过程中的机制进行更全面的研究。

作为一种保守的Ser/Thr激酶，mTOR通过整合来自营养素、生长因子、能量状态和环境胁迫的信号，成为细胞生长的中央调节因子。mTOR在细胞生物学和病理生物学中，特别是在具有显著的代谢和形态适应能力的肌肉中的重要作用目前引起了人们的极大兴趣。mTOR与猛禽形成mTORC1有关，显示猛禽的肌肉特异性失活导致了肌肉萎缩、氧化能力受损和糖原贮备增加，从而导致在氧化肌肉中最明显的营养不良特征[49]。另一方面，mTOR活性的丧失加重了慢氧化和快糖酵解肌肉中的肌病特征，并且展示出与在缺乏肌肉的猛禽中所观察到那些类似的代谢变化，包括氧化代谢受损、线粒体调节改变和糖原积累[26]。在使用心脏毒素诱导的肌肉坏死/再生周期的范例的研究中，诸位发明人最近显示了在肢带型肌营养不良2A型的小鼠模型中受损的再生，并显示钙蛋白酶-3缺失型肌肉与mTORC1信号传导扰动和有缺陷的线粒体生物发生相关(在综述中)。总之，本文所述发现对于NT-3的潜在用途具有许多暗示，不仅可用于治疗神经病变，对神经和肌肉都有益处，而且还可用于肌肉消耗病症，包括衰老、癌症恶病质或II型肌纤维萎缩以及与受损的再生放射状生长阶段相关的遗传性或获得性自身免疫性原发性肌肉障碍[50-52]。了解这些障碍中mTOR信号传导的扰动的作用应允许开发新的组合治疗策略，其中NT-3可能起重要作用。

实例2

使用scAAV1.tMCK.NFT3载体进行NT-3递送

给予的组合物是称为scAAV1.tMCK.NTF3的非复制重组腺相关病毒，如图3所示。该载体含有在tMCK肌肉特异性启动子控制下的人NT-3基因。在将载体(1x10¹¹vg)肌内注射至C57B16小鼠的腓肠肌中，接着在基因注射后4至6周时通过ELISA对血清中的循环NT-3进行定量后，将测试体内生物效能。

首先证明了递送至腓肠肌的ssAAV1.CMV.NTF3产生了延长的且治疗性的NT-3血液水平，其足以在TrJ神经中提供功能性、电生理学和组织病理学改善。然后研究是否有可能产生所需的载体剂量并通过用scAAV1包装表达盒实现相同水平的表达。对C57BL/6小鼠进行剂量响应研究，比较了以3种剂量(3x10⁹vg、1x10¹⁰vg和3x10¹⁰vg)肌内注射scAAV1.tMCK.NTF3和scAAV1.CMV.NTF3后的血清NT-3 ELISA数据。以1x10¹¹vg给予sc.rAAV1.CMV.NTF3载体产生的NT-3水平显著高于相同剂量下的单链载体，这与使用自身互补载体产生的更大效力相一致。在半对数的较少剂量下(3x10¹⁰vg)，CMV和tMCK载体二者均产生与从接受1x10¹¹vg剂量的ss.AAV1.CMV.NTF3的小鼠获得的那些可比的NT-3血清水平，其产生了生物应答。注射后24周时TrJ小鼠的NT-3水平(平均值±SEM)。在所有7组中，NT-3水平存在显著差异，p值<0.0001。对于启动子和对照二者，均观察到最高和中间剂量的载体的NT-3水平的显著差异。然而，对于两种载体的较低剂量，分析均未发现显著差异。使用Kruskal-Wallis检验比较所有组(PBS、CMV 3E+09/1E+10/3E+10和tMCK 3E+09/1E+10/3E+10)中的血清NT-3。使用Mann-Whitney U检验比较每组与PBS(对照)组之间的NT-3，并且使用Bonferroni校正来针对多重比较进行调整。参见Sahenk等人,Mol.Ther.[分子疗法]22(3):511-521,2014，将其通过引用以其整体并入本文。

治疗后40周时肌肉直径增加：与PBS相比，在注射ssAAV1.CMV.NTF3(1x10¹¹vg)的动物亚组中注射后40周时，在TrJ小鼠中评估了NT-3基因疗法对肌肉纤维大小的作用。未治疗的小鼠的肌肉中明显存在以萎缩性角纤维和成组萎缩为特征的神经源性变化，而以纤维类型组群和总体纤维大小增加方式的神经再支配的证据则可认作治疗效果。从左下肢的对侧前室和后室肌肉(胫骨前肌和腓肠肌)生成的肌纤维大小直方图显示纤维直径增加。

我们实验室中的另外的研究已经显示，NT-3刺激SC细胞中的Akt/mTOR途径，从而改善神经中的髓鞘形成和轴突的放射状生长，并且NT-3也通过Trk-C受体对肌管具有直接刺激作用，这指示它在TrJ小鼠的肌肉中的纤维直径增加中的作用。图3A显示NT-3增加SC和肌管培养物中Akt(P-Akt)和mTOR靶标4EBP-1(P-4EBP1)和PS6K(P-S6K)的磷酸化。这些研究提供了证据，证明我们在此临床试验中选择小腿的前后肌进行载体递送的道理。

采用自身互补(sc)AAV1和使用肌肉特异性截短型肌酸激酶(tMCK)启动子的研究

scAAV允许较低的给药从而增强安全性，以及满足生产标准的给药水平。tMCK启动子的使用是有价值的目标，通过避免脱靶效应再次提供了更高的安全性。在下组实验中，将在CMV启动子的控制下的scAAV1.NTF3的功效与肌肉特异性tMCK启动子进行了比较，将二者均以半对数范围内的三种剂量(3x10⁹vg、1x10¹⁰vg和3x10¹⁰vg)给予。在基因转移后24周，通过电生理学(表3)和形态学研究评估了TrJ小鼠周围神经中AAV1.NTF3基因转移的功效。通过使用ELISA测量血清NT-3水平来评估转基因表达的证据。

表3.TrJ坐骨神经中的CMAP和传导速度

在电反应诊断研究期间，检查者对治疗组不知情。CMAP在AAV1.NTF3.CMV(高剂量，HD)与AAV1.NTF3.tMCK(高剂量，HD)之间没有统计学差异，并且优选使用肌肉特异性tMCK启动子。这通过ELISA测定中的NT-3水平进一步得到支持，其中对于启动子和对照二者，均观察到最高和中间剂量的载体的NT-3水平的显著差异。

本文引用的所有专利、专利申请和出版物的完整披露内容以及可电子获得的材料均通过引用并入。仅出于清楚理解起见给出以上详细说明和实例。不应将其理解成不必要的限制。本发明不限于所示和所述的精确细节，因为将在权利要求定义的本发明内包含对于本领域技术人员而言显而易见的变体。

实例3

表达NT-3的AAV构建体的构建

含有在tMCK或CMV启动子控制下的NT-3 cDNA的血清型1自身互补AAV病毒载体的设计先前描述于Sahenk等人,Mol Ther[分子疗法],22(3):511-521(2014)中，将该文献通过引用以其整体并入本文。将等分的病毒在-80℃下保持直至使用。在注射后6周和16周时在麻醉下通过眼出血从治疗的和未治疗的小鼠收集血样，并使用捕获ELISA测定血清的NT-3水平。该构建体在本文中称为scAAV1.tMCK.NTF3。

tMCK启动子/增强子序列用于驱动肌肉特异性基因表达，并且由肌肉肌酸激酶启动子和与之融合的添加的增强子元件(enh358MCK，584-bp)构成。将三重串联的MCK增强子(206-bp)与tMCK启动子/增强子中的87-bp基础启动子连接。

scAAV1.tMCK.NTF3药物产品是通过用以下质粒对人HEK293主细胞库(MasterCell Bank)细胞进行3种质粒DNA转染而产生的：(i)pAAV.tMCK.NTF3-载体质粒(参见图7)，(ii)含有AAV rep2和Cap1野生型基因的称为R88/C1的AAV1辅助质粒，以及(iii)辅助腺病毒质粒

具有分子特征和开放阅读框的质粒的示意图如图7所示。源自pAAV.tMCK.NTF3质粒的AAV载体基因组是含有侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)的人NTF3 cDNA表达盒的自身互补DNA基因组。正是此序列被封装到AAV1病毒体中。通过将驱动NTF3基因序列的tMCK表达盒插入AAV克隆载体psub201中，构建质粒pAAV.tMCK.NTF3。人NTF3基因由小鼠三重串联MCK启动子表达，该启动子是先前描述的CK6启动子的修饰形式并含有三重E盒(box)序列。SV40聚腺苷酸化信号用于有效的转录终止。该盒(cassette)还含有用于增加基因表达的嵌合内含子，并且由人β-珠蛋白基因的第一个内含子的5'供体位点和在前导序列与免疫球蛋白基因重链可变区的主体之间的内含子的分支点和3’剪接受体位点组成。NTF3表达盒具有在ATG起始之前紧接的共有Kozak和可有效终止mRNA的200bp SV40聚A信号。NTF3 cDNA以其整体包含在内(NCBI参考序列：NM_001102654)。此载体中包含唯一的病毒序列是AAV2的反向末端重复序列，它是病毒DNA复制和包装所必需的。AAV ITR是在两端几乎相同但取向相反的序列。“左”(突变)ITR的末端解析位点缺失，以允许基因组的发夹形成。通过对质粒来源原种进行DNA质粒测序来确认所有DNA质粒元件的身份。

表4显示了在SEQ ID NO:11的AAV载体DNA质粒内相关分子特征的碱基对位置。

实例4

I阶段肌内研究

对于最初的I阶段肌内(IM)安全性研究，持续的NT-3转基因表达是此第一阶段中提出的结果量度，由于多种原因这是重要的。毒性的真实评估依赖于证明基因表达。如果肌肉未经转导，则毒性测试(不利作用)将更难以解释(转导失败与基因表达丧失)。该研究为建立明确识别转基因表达并将其与内源基因表达区别开来的方法提供了机会。

此临床试验是开放标签、一次性注射递增剂量研究，其中将scAAV1.tMCK.NTF3通过肌内注射至具有PMP22基因重复的CMT1A受试者的双腿中的腓肠肌和胫骨前肌中来给予。将九名18岁以上的CMT1A成年患者纳入该试验中的两个群组之一。前三名受试者以四肢间双侧分布的最低有效剂量(2.0X10¹²vg/kg)纳入群组1。另外六名受试者以3倍剂量递增纳入群组2(6.0X10¹²vg/kg)。基因转移后监测包括以第7、14、30、60、90、120天和第3个月的间隔进行随访，试验的其余随访延长至2年。安全性是此临床基因转移试验的主要终点。停止标准基于无法接受的毒性的发展，其定义为两周后仍未消退的任何II级眼部或全身毒性或者任何III级或更高毒性的发生。次要终点是如下功效，其被定义为在基因转移后2年时通过CMT儿科量表(CMTPedS)测量的能力下降停止。CMTPedS是11个条目的量表，其由以下构成：功能性敏捷度测试，九孔柱测试(9HPT)，手握力、足跖屈和足背屈强度(使用手持肌测仪)，针刺和振动感觉，Bruininks Oseretsky测试-平衡评估，步态评估，跳远和六分钟步行测试(6MWT)。探索性的结果量度将包括100米定时测试(100M)、腓骨和尺骨CMAP幅度以及感觉和运动传导速度、用于提高对针刺的敏感性的经修订的感觉测试、触摸测试和振动评估、疼痛和疲劳的视觉模拟量表、作为生活质量衡量标准的简明健康问卷(SF-36)以及循环的NT-3水平。

纳入试验的患者包括任何种族、人种或性别背景。已经定义了该疾病的标准，并且它将遵循Shy等人(Neurology[神经学]64:1209-1214,2001和Neurology[神经学]70:378-383,2008)先前建立的指南。

该研究的入选标准如下：

·被诊断患有CMT1A的成年受试者(>18岁)

·必须在包括周围髓鞘蛋白22(PMP22)基因的17p11.2处展现出1.5Mb重复

·任何人种或种族的男性和女性

·必须展现出踝背屈肌无力(应具有抵抗重力的完整ROM，但不能保持抵抗重力的完整背屈或能够脚跟站立3秒钟或更长时间(Northstar标准)]

·神经传导速度异常

·配合临床评价和重复神经传导研究的能力

·性活跃受试者在研究过程中愿意采用可靠的避孕方法

该研究的排除标准如下：

·基于HIV的临床观察或血清学证据的活性病毒感染，或者甲型、乙型或丙型肝炎感染

·正在进行免疫抑制疗法或在试验开始后6个月内的免疫抑制疗法(例如，皮质类固醇、环孢霉素、他克莫司、甲氨蝶呤、环磷酰胺、静脉注射免疫球蛋白)

·持续性白细胞减少或白细胞增多(WBC≤3.5K/μL或≥20.0K/μL)或绝对嗜中性粒细胞计数<1.5K/μL

·AAV1结合抗体滴度≥1:50，如通过ELISA免疫测定所确定的

·伴随疾患或需要进行长期药物治疗，PI认为这会带来不必要的基因转移风险

·阻碍适当的肌肉强度测试的踝关节挛缩或手术

·怀孕、母乳喂养或打算怀孕

·其他神经病变的原因

·在过去六个月中进行了肢体手术

表5研究设计

*表5提供了基于以70Kg的患者体重为实例的给药方案概述。剂量体积是基于约1.5x10¹³vg/ml的目标产品浓度。

注射前的基线量度(第-30天至第-1天)

在获得书面知情同意书并完成医院登记程序之后，将执行以下基线医疗程序和测量。

·病史

·服用伴随药物

·体检

·胸部X光

·超声心动图

·EKG

·血液学血液实验室(CBC)

·凝血参数：血小板、PT/INR、PTT

·临床化学血液实验室：胆红素、血尿素氮(BUN)、GGT，

·碱性磷酸酶、甲胎蛋白(AFP)、肌酸酐、淀粉酶、血清蛋白电泳、电解质、葡萄糖、肌酸激酶

·尿液分析

·病毒筛查(肝炎和HIV)

·怀孕测试(仅育龄女性)

·血液免疫学：中和抗体(AAV1)和ELISpots

·(NT-3和AAV1)

·ELISA血清(循环NT-3)

·功效量度

·探索性量度

·注射部位的照片

预注射泼尼松龙剂量

在基因转移之前，每名患者将接受1mg/kg/天的口服泼尼松剂量，最大剂量为60mg/天，然后在基因转移当天接受第二剂量。在基因转移后24小时和48小时，受试者将接受泼尼松，共4个剂量。

基因转移方案

在一次双侧肌内注射中，将携带在tMCK启动子(scAAV1.tMCK.NTF3)的控制下的人NTF3基因的自身互补AAV1给予至腓肠胫骨前(TA)肌的内侧头和外侧头。

基因转移程序

基因转移程序如下：

·基因转移输注程序在无菌条件下进行。

·在没有稀释剂的情况下递送载体，每名患者总计约10mL至28mL(每个肢体5至14mL，分配至3块肌肉)。

·将载体递送至指定的标记冷却器中携带的、密封于双重防漏袋中的预先标记的注射器的操作室里。

·将总计5mL至14mL载体给予至腓肠肌和TA肌的每个和外侧头，总计3至6次注射/块肌肉(每次注射体积将为0.5至1.0ml)。参见图8A和图8B中注射部位的示意图。

·注射是在筋膜以下至少0.25cm处，并且注射沿着超声引导的肌肉纵轴进行。

·每次注射间隔约1.5cm。

住院监测

基因转移注射后，受试者回到指定的住院床位，密切监测生命体征和呼吸功能。在最初的4个小时中大约每小时监测一次生命体征，然后每4个小时监测一次直到出院。通过体检和实验室评价来评估安全性。给予受试者第三个剂量的口服泼尼松(第1天)，并在第二天(注射后48小时，第2天)给予第四个和最终剂量的泼尼松。基因转移后约48小时，患者将出院(如果未观察到副作用的话)。

门诊监测

出院后，患者在第7、14、30、60、90、120和3个月的间隔返回随访，试验的其余随访延长至基因转移后2年。评估在所有随访时获得的血液样品的NT-3蛋白表达，如在血清ELISA中用抗NT-3抗体所示的。另外，将在随访7、9、11、13和14时测试患者中的功效和探索性量度。血清ELISA是功能性基因表达的直接量度，并且次要结果量度显示循环转基因的功效

主要终点：

安全性是此临床基因转移试验的主要终点。这是基于无法接受的毒性的发展(被定义为任何一种III级或更高、未预期的与治疗相关的毒性的发生)来评价的。

安全性量度

在每次研究时，将用身高和体重、生命体征、身体检查和系统检查以及一系列血液实验室工作的集合来测量安全性。实验室工作将包括CBC、血小板、血尿素氮(BUN)、GGT、胆红素、碱性磷酸酶、甲胎蛋白、肌酸酐、淀粉酶、血清蛋白电泳、电解质、葡萄糖、PT/INR和PTT、CK、尿液分析。免疫学由以下组成：中和抗AAV1抗体和用于检测抗NT-3抗体的ELISA，用于检测对AAV1和NT-3的T细胞应答的ELISpot。将记录所有不良事件并评估与基因转移的关联性。

次要终点

临床基因转移试验的次要终点是如下功效，其被定义为在基因转移后2年时通过CMT儿科量表(CMTPedS)测量的能力下降停止。

使用手持式测力计对上肢(手握力)和腿(足背屈)的远端运动进行上肢和下肢肌肉强度测试。测试的肢体被固定以待测试，这显著提高了足等长收缩量度的可靠性(29)。上肢功能用9孔柱测试(9HPT)进行测量。下肢功能通过定时10米跑步/步行(T10MW)测试进行测量。

探索性结果量度

探索性的结果包括100米定时测试(100M)、腓骨和尺骨CMAP幅度以及感觉和运动传导速度、用于提高对针刺的敏感性的经修订的感觉测试、触摸测试和振动评估、疼痛和疲劳的视觉模拟量表、作为生活质量衡量标准的简明健康问卷(SF-36)以及循环的NT-3水平。

电生理学测试包括尺神经(从外展小趾肌记录的)和腓神经(从胫骨前肌记录的)的尺骨感觉神经幅度和复合肌肉动作电位(CMAP)幅度以及感觉和运动传导速度的测量。胫骨前肌的腓骨CMAP幅度已显示是对于CMT1A患者的临床试验的有用的结果量度(30)；并且对于上肢运动症状，尺骨CMAP幅度已被证明是最有用的参数(31)。在这些测试程序中，脚和手的温度将保持在32℃-34℃。视觉模拟量表将用于疼痛和疲劳的量度(32)。简明健康问卷(SF-36)用作生活质量文件，以监测和比较治疗前后的疾病负担。

为患者提供财务奖励，使其接受可选的束状腓肠神经活检。如果选择的话，则在治疗开始之前(从左腓肠)和研究结束时(从右腓肠)获得活检。活检是在局部麻醉下作为门诊检查进行的。将对组织进行处理和检查，以评估NT-3对有髓纤维再生的作用。为了使治疗前和治疗后材料的水平匹配整个神经的长度，将切口的近端(长度为2.5cm)放置在跟腱的上方恰好10cm处(8)。

统计分析

安全性是此临床基因转移试验的主要终点。这将是基于无法接受的毒性的发展(被定义为任何一种III级或更高、未预期的与治疗相关的毒性的发生)来评价的。在每次研究时，将用身高和体重、生命体征、身体检查和系统检查以及一系列血液实验室工作的集合来测量安全性。实验室工作将包括CBC、血小板、血尿素氮(BUN)、GGT、胆红素、碱性磷酸酶、甲胎蛋白、肌酸酐、淀粉酶、血清蛋白电泳、电解质、B12、葡萄糖、PT/INR和PTT、CK、尿液分析。免疫学将由以下组成：中和抗AAV1抗体和用于检测抗NT-3抗体的ELISA，用于检测对AAV1和NT-3的T细胞应答的ELISpot。将记录所有不良事件并评估与基因转移的关联性。

主要的次要结果量度被定义为在CMT疾病儿科量表评分(CMTPedS)上的疾病严重程度没有下降。CMTPedS的计算机化评分系统使用来自规范样品的z得分，以根据患者表现与健康人群的标准差数确定个体得分。在整个研究中，对所有患者进行CMTPedS评分均是在20岁的固定年龄，出于两个原因这是有必要的。第一个原因是，原始CMTPedS量表在计算最终得分时依赖于各个量表项目的规范值，但超过2030岁的个体不存在规范值。第二个原因是，尽管将孩子与健康的同龄人进行比较的得分对于仍在发育的孩子是必要的，但它的局限性在于，当孩子再过一个生日时，会导致功能下降。即使孩子的测试原始得分没有变化，评分标准也会随着他们年龄的增长而变得更加严格，这反映出健康孩子中通常所看到的期望的运动技能提高。然而，在退行性疾病的临床试验中，停止实际进展将构成成功的试验。在整个研究过程中保持参考对照数据的年龄一致允许使用内置在CMTPedS中的经过验证的评分系统。它还允许观察评估中的实际变化，使得检测到进展停止。

使用二项式检验得出的CMTPedS得分在两年时间内改善或保持不变的患者比例估计为95％置信区间。作为探索性目的，分别估计了CMTPedS的11项中每一项，以及在100米定时测试(100M)、CMAP幅度、疼痛强度的视觉模拟量表(VAS)、简明健康问卷得分(SF-36)和NT-3循环水平中未下降的患者比例。另外，在每个测量点使用皮尔逊(Pearson)或斯皮尔曼(Spearman)相关系数来评估循环NT-3水平与每个结果量度之间的关联。由于该研究尚处于初步阶段，因此不会调整用于多重比较的p值。然而，基于Bonferroni-Holm减缓程序，进行了敏感性分析，并指出调整后哪些关联在统计上是显著的。

基于纵向自然历史数据(31,32)，成功的次要结果量度被定义为手握力和踝背屈强度的标准化组合得分的恶化率的停止、完成9孔柱测试的时间和步行/跑步10米的时间。

实例5

毒理学研究

本研究的目的是评估在腓肠肌中单次肌内注射后，在野生型(C57BL/6)和Trembler(Tr^J)小鼠中在肌肉特异性tMCK启动子(scAAV1.tMCK.NTF3)的控制下表达人神经营养因子3(NTF3)cDNA的自身互补腺相关病毒(scAAV)载体的安全性。此报告的结果证明，在野生型和trembler小鼠中单次肌内注射是安全的，并且在注射后48周内耐受良好。

测试动物

向野生型C57BL/6(阴性对照)和Tr^J(测试品)小鼠肌内注射媒介物(0.9％无菌盐水)或1x10¹³vg/kg的scAAV1.tMCK.NTF3，总体积为50μl。这种载体小鼠品系可从杰克逊实验室(原种#000664)或查尔斯河(原种#027)获得。Tr^J小鼠可从杰克逊实验室获得(原种#002504)。

注射时Trembler小鼠的年龄为8-10周。由于动物的可获得性和该动物品系的已知繁殖问题，因此对动物的亚组在12周龄时进行治疗。

该研究总共包括88只(44只雄性/44只雌性)动物。44只动物(22 C57BL/6,22 TrJ)用盐水对照治疗，而44只动物(22 C57BL/6,22 TrJ)用scAAV1.tMCK.NTF3测试品治疗。在这些数目中，每个群组的一半动物在治疗后24周实施安乐死，并且其余动物在治疗后48周实施安乐死。通过耳标独特地标识动物。

研究设计

为了评估scAAV1.tMCK.NTF3测试品的安全性，经由在左腓肠肌中单次IM注射向4-6周龄野生型C57BL/6和8-12周龄的Tr^J小鼠注射媒介物(0.9％无菌盐水)或1x10¹³vg/kg的scAAV1.tMCK.NTF3，总体积为50μl。在整个研究过程中每天观察动物的总体健康状况和发病率。每天两次检查死亡率。每2周测量一次体重。每8周进行一次超敏的功能测试(热板和声学惊吓测试)。每2周进行一次行为测试(转棒仪和金属丝悬挂)。

在注射前的两周开始使用Rodent热板测试进行热敏性测试，然后在第0天，并且每8周进行一次热敏性测试。为了进行测试，将动物放置在温度保持在55℃的平板表面上，并使用围绕平板表面的15cm高的Plexiglas壁将运动限制在100cm²区域。将动物放置在加热的表面上后立即启动计时器，并通过秒表将反应时间的延迟记录为0.1s。以下活动被认为是对热刺激的反应：后爪舔或弹/扑动，试图通过跳跃逃脱也是可接受的反应。当观察到这种反应时，立即将小鼠移出。

注射前的两周测试声学敏感性，然后在第0天(基线)，在血清NT-3水平的峰值(8至12周)时，以及使用声学惊吓测试(AST)测试所有动物的听觉超敏性后之后每8周测试声学敏感性。使用单个惊吓室(SR-Lab，圣地亚哥仪器公司(San Diego Instruments)，加利福尼亚州圣地亚哥)测量惊吓反应性，如先前在Beigneux等人,Behavioral Brain Res.[行为大脑研究]171:295-302,2006中所述。

该室由放在通风室内的平台上的透明非限制性Plexiglas圆柱体组成。室内的高频扬声器产生65dB的连续背景噪声和各种听觉刺激。由动物的全身惊吓反应引起的Plexiglas圆柱体的振动通过附接至平台的压电单元转换为模拟信号。然后将信号数字化并由计算机存储。从刺激发作开始以1ms的间隔获取六十五个读数，并使用平均幅度(V_avg)确定听觉惊吓反应。在5min的适应时间内呈现了65dB的背景噪声水平，并使其在整个测试期持续。所有的前脉冲抑制(PPI)测试期均由惊吓试验(仅脉冲)、前脉冲试验(前脉冲+脉冲)和无刺激试验(无刺激)组成。仅脉冲试验由40ms 120dB宽带噪声脉冲组成。通过前脉冲+脉冲试验(由20ms噪声前脉冲、100ms延迟、然后40ms 120dB惊吓脉冲组成)测量PPI。声学前脉冲强度为69、73和81dB。无刺激试验仅由背景噪声组成。测试期以单独脉冲试验的五次呈现开始和结束；在中间，每种试验类型均以伪随机顺序出现10次。两次试验之间平均为15s(12-30s的范围内)。

对于转棒仪分析，需要至少训练一周，以确保所有受试者都以相同的程度学习了该任务。在加速旋转方案中，将动物放在棒上，棒加速到5rpm，然后以5rpm/sec7增加。动物平均每期接受三次试验。

为了进行金属丝悬挂分析，将动物的四个爪子放在直径2mm的金属丝线上，该金属丝线水平保持在厚软垫层上方35cm处。记录直到小鼠从金属丝上掉下来的时间长度，并且在每次掉下之后给小鼠1分钟的恢复时间。每个测试期均由三个试验组成，从这些试验取平均得分。

注射后22周和46周(安乐死前2周)，从眶后窦(retro-orbital sinus)收集血液用于血液学研究(红细胞计数、血细胞比容、血红蛋白、白细胞计数、总和差异、平均红细胞血红蛋白、平均红细胞血红蛋白浓度、平均红细胞体积、平均血小板体积、血小板计数、网织红细胞计数)。分析了临床化学的以下参数：丙氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、天冬氨酸转氨酶、胆红素(总胆红素和直接胆红素)、血尿素氮、肌酸酐、肌酸激酶、葡萄糖、总蛋白。

注射后24和48周时，通过心脏内穿刺收集血液，将血清用于免疫研究。收集血清样品以针对每个群组中的所有动物进行抗AAV1和抗NT-3抗体滴定(不论治疗或性别)。血清样品另外用于循环NT-3水平的ELISA测定。

注射后24和48周时，收集Tr^J动物的以下组织进行组织病理学分析：生殖腺、脑、脾、肾、空肠、结肠、胰腺、心脏、肺、胃、肝脏、腹股沟淋巴结、脊髓、腓肠肌(左和右)和肉眼病变(如果有的话)。将组织固定在10％中性缓冲福尔马林中，切片并用苏木精和伊红染色。由SNBL USA进行组织学分析。

在注射后24和48周时，针对每个群组6只动物(3M，3F)收集用于内部组织病理学的组织，但Tr^J对照群组(n＝5，3M，2F)除外。处死小鼠，并用磷酸盐缓冲液(0.1M，pH7.4)中的4％多聚甲醛经心脏灌注。解剖腰椎脊髓、背根神经节(DRG)和整个坐骨神经段(坐骨切迹至腘窝)。将坐骨神经段在其原位长度的近端一半和一个腰椎DRG转移到戊二醛固定剂中，进行处理以用于塑料包埋和制作1μm厚的切片。将其余的坐骨神经组织和腰椎DRG在30％蔗糖中冷冻保护，冷冻在液氮中冷却的异戊烷中，并切成12μm切片用于免疫组织化学，以检测DRG神经元和轴突的CGRP阳性(将TrJ小鼠的脊髓和脑置于10％中性缓冲福尔马林中)。

动物给药、观察和分析

指示的动物在第0天经由单次IM注射至左腓肠肌中，以50μL的体积给药一次。为了进行准确的给药，将动物用异氟烷吸入麻醉至少15分钟。通过直接注射至左腓肠肌进行给药。注意将整个载体剂量准确地注入肌肉中。进行给药后，观察动物直至能走动并返回笼子。在整个研究过程中每天对每只动物进行观察。每2周测量一次体重。每天两次进行死亡率检查。

在适当的年龄，小鼠用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物(200mg/kg/20mg/kg)过量给药。经由心脏穿刺收集血液。然后收集组织并送去分析。

绘制每个群组每个时间点的体重、小鼠血液学和临床化学。对所有终点进行了抗AAV1循环抗体、抗NT-3循环抗体和循环NT-3水平的ELISA测定。每8周使用啮齿动物热板和声学惊吓设备对所有动物进行超敏功能测试。每两周对所有动物进行一次行为测试，即转棒仪和金属丝悬挂测试。对所有动物进行器官的正式组织病理学。对每个群组6只小鼠(3M，3F)进行腰椎脊髓和DRG的内部组织病理学，但包括5只动物的Tr^J群组(3M，2F)除外。组织病理学评估包括CGRP阳性(在腰椎DRG神经元和脊髓中)的免疫细胞化学分布以及坐骨神经和DRG神经元的塑料包埋，以分析病理变化。

结果

发病率和死亡率

所有小鼠均在注射程序中存活，并且通过了初始观察时间段而没有任何不适体征。由于供水系统故障，四只Tr^J动物死亡。没有与测试品有关的死亡。

体重

在整个研究过程中，每两周测量一次每组中所有小鼠的体重。在整个研究中，所有治疗组都保持稳定的增重。

在C57BL/6雄性动物中，注射测试品的动物与对照之间没有显著差异。在雌性动物中，与注射测试品的动物相比，对照动物的体重略高。在Tr^J雄性动物中，盐水治疗的群组显著比NT-3治疗的群组更重。对于雌性Tr^J小鼠，体重没有显著差异。

血液学和临床化学

在22周和46周时的血液学参数或者在24周和48周时间点时的血清化学没有测试品有关的变化。

ELISA测定

使用在24周和48周尸检中收集的血清样品进行抗AAV1抗体、抗NT-3抗体和循环NT-3的ELISA测定。

为了测量循环抗AAV1抗体，在载体给予后24周和48周时收集血清样品，并通过结合酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定抗体滴度，参见下表7。用scAAV1.tMCK.NTF3治疗的动物具有升高的循环抗AAV1衣壳抗体。在两个时间点，雄性和雌性的抗体滴度均相似。在盐水对照治疗的动物中未检测到阳性滴度(>1:50)。

为了测量抗NT-3循环抗体，在载体给予后24周和48周时收集血清样品，并通过结合酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定针对NT-3的抗体滴度。在载体给予后24周和48周时，所有小鼠的抗体滴度均<1:50(认为是阴性的)。参见表8。

经由标准结合ELISA测定来测定载体给予后24周和48周时收集的Tr^J小鼠的血清样品中的循环NT-3水平。肌内注射scAAV1.tMCK.NTF3载体导致在载体给予后24周和48周时Tr^J小鼠的NT-3稳健表达和分泌。表9显示了在盐水和载体注射组的Tr^J中注射后24和48血清NT-3水平的平均值和标准差。性别对循环NT-3水平没有影响。

超敏测试

在C57BL/6和TrJ小鼠中，在基线时(在用对照盐水的测试品治疗之前)以及每8周进行一次热敏性测试直到注射后48周。在C57BL/6和TrJ群组中，在对照与载体注射的小鼠之间没有差异。每个群组中雄性与雌性小鼠之间的退缩潜伏期也没有显著差异。

在声学惊吓测试中进行的听觉敏感性测量结果证明，AST在所有强度(69、73和81dB)下均明显地受到前脉冲的抑制，并且在野生型和TrJ小鼠二者中抑制水平取决于前脉冲的强度。采用测试品的治疗不改变C57BL/6野生型小鼠的PPI反应。在对照品治疗的TrJ动物中，可检测到％-PPI较低，这在测试品(NT-3)治疗的TrJ动物中朝着正常化而有所改善。NT-3治疗的Tr^J动物中的这种改善主要出现在雄性动物中。

行为测试

对于转棒仪评估，不论如何治疗，C57BL/6群组中的动物在转棒仪功能测试中均未显示出任何差异。与对照组TrJ动物相比，在TrJNT-3治疗的群组中的动物在治疗后16周开始显示出显著的转棒仪表现的改善，这持续到终点。

对于金属丝悬挂评估，不论如何治疗，C57BL/6群组中的动物在金属丝悬挂功能测试中均未显示出差异。与对照TrJ动物相比，在TrJNT-3治疗的群组中的动物在治疗后28周开始显示出明显的金属丝悬挂能力改善，这持续到终点。

组织病理学

进行正式的组织病理学。下表10中列出了分析的器官和组织的清单。

安乐死后，将腰椎脊髓、背根神经节(DRG)和整个坐骨神经(从坐骨切迹到腘窝)取出并进行处理，以进行组织病理学评价。内部组织病理学所包括的单个动物的列表显示在表11中。

CGRP分布的免疫细胞化学分析

为了进行CGRP分布的免疫细胞化学分析，在注射后24周和48周时检查腰椎脊髓段的截面。此分析揭示，无论治疗品如何，Tr^J和C57BL/6动物中在使用NT-3的情况下CGRP反应性均未增加。

分析了塑料包埋切片的病理变化。在C57BL/6动物中，注射后24周和48周时检查的塑料包埋的左坐骨神经和左腰椎DRG神经元未显示出病理变化。在治疗后48周，在C57BL/6动物的两个治疗群组中均观察到了与年龄相关的变化，如髓鞘起皱/内折和外折，表明轴突萎缩。在用盐水治疗的Tr^J动物中，有髓纤维和许多低有髓或裸露的轴突明显脱落。用测试品治疗的Tr^J动物显示出小的有髓鞘纤维、髓鞘厚度的明显增加以及裸露轴突的减少。在TrJ小鼠中NT-3治疗没有任何不利作用，如通过DRG内没有轴突出芽所证明。

总之，在整个研究中，C57BL/6和Tr^J动物中均未出现与不利的与治疗有关的发现，这指示直至注射后48周该治疗是耐受良好的。

讨论

为了评估经由单次肌内注射递送的scAAV1.tMCK.NTF3的安全性，设计了毒理学研究，其包括总共88只(44只雄性/44只雌性)动物。44只动物(22 C57BL/6,22 TrJ)用0.9％无菌盐水对照治疗，而44只动物(22 C57BL/6,22 TrJ)用浓度为1x10¹³vg/kg的scAAV1.tMCK.NTF3测试品治疗。在这些动物中，每个群组的一半动物在治疗后24周实施安乐死，并且其余动物在治疗后48周实施安乐死。

此报告中的数据证明，以高于推荐的临床剂量10倍的剂量治疗动物并没有导致出现与测试品有关的不利安全性作用。在整个研究中，每天观察动物的总体健康状况和发病率，并每天进行两次死亡率检查。每2周测量一次动物体重。每8周进行一次超敏(热敏和声学)的功能测试。每2周进行一次行为测试。所有动物在注射程序和初始观察时间段中均存活，并且没有不适体征。由于供水系统故障，TrJ动物中有4例死亡，这与测试品的给予无关。在本研究中没有其他死亡记录。

尸检后，对血液学和临床化学进行了测量，并且没有显示与测试品有关的任何差异。进行了抗AAV1血清ELISA，并其显示用非性别特异性的测试品治疗的动物中循环抗体的预期增加。对所有动物进行抗NT-3血清ELISA，显示出在所有时间点的抗体滴度均为阴性。还测量了所有治疗组的循环NT-3水平，并且仅在测试品治疗的动物中升高。对循环NT-3水平没有性别特异性影响。热超敏测试揭示，C57BL/6或Tr^J动物中没有治疗或性别特异性变化。听觉敏感性测量结果揭示，C57BL/6动物中没有与测试品有关的变化，但确实显示了对照物品治疗的Tr^J动物中的缺陷，以及测试品治疗的Tr^J动物中朝着正常化的改善。这种改善主要在雄性Tr^J动物中看到。对在C57BL/6动物中的运动控制的转棒仪评估揭示，没有与测试品的治疗有关的差异。从治疗后16周开始，与对照Tr^J动物相比，用测试品治疗的TrJ动物显示出显著的改善。同样，金属丝悬挂评估揭示在C57BL/6群组中没有与测试品有关的差异。用测试品治疗的Tr^J动物在治疗后28周开始显示出明显的金属丝悬挂时间改善，并持续到终点。

评价了在治疗后24周和48周时从所有群组收集的组织和器官。总而言之，在24周的尸检中，在3/4的第1组雄性和4/5的第1组雌性中的测试品注射的左腓肠肌中观察到最小的单核细胞浸润。然而，在其余第1组雌性(动物3942)中未注射的腓肠肌中也观察到类似的浸润。在第24周的尸检中，任何第2组(对照)动物中的注射盐水的左腓肠肌或未注射的右腓肠肌中均未观察到这种变化。在48周的尸检中，在2/5的第1组雄性和1/6的第1组雌性中的测试品注射的左腓肠肌中观察到最小的单核细胞浸润。所有其他微观发现是随机分布在对照和治疗动物中，是该物种的背景发现，或被认为与测试品给予有关。

对动物亚组的腰椎脊髓段、背根神经节和坐骨神经进行内部组织学(每组3M，3F)。腰椎脊髓段的截面检查揭示，无论治疗如何，动物中在使用NT-3的情况下CGRP活性均未增加。塑料包埋的坐骨神经和腰椎DRG神经元的病理学评价显示，除与年龄相关的差异外，C57BL/6动物无变化。在Tr^J动物中，用测试品治疗导致改善的病理学，如通过小有髓纤维增加、髓鞘厚度增加和裸露轴突减少所证明。DRG中轴突出芽的缺乏进一步支持测试品的安全性。

总之，本研究中提供的收集数据指示，在雄性和雌性C57BL/6野生型和Tr^J小鼠中通过单次肌内注射以1x10¹³vg/kg的剂量直接注射至腓肠肌中的测试品scAAV1.tMCK.NTF3在注射后48周内耐受良好，如通过上述多个量度所证明。

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尽管已经根据特定实施例描述了本发明，但是应理解，本领域技术人员将想到多种变化和修改。因此，只有在权利要求中出现的此类限制才适用于本发明。