阅读说明：本技术 一种陶瓷膜表面Janus改性并固定脂肪酶的方法 (Method for modifying Janus on surface of ceramic membrane and fixing lipase ) 是由 高能文 熊沛 于 2019-01-16 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种陶瓷膜表面Janus改性并固定脂肪酶的方法。Janus改性陶瓷膜一面亲水而另一面疏水,而后将脂肪酶固定于Janus改性陶瓷膜的疏水侧。制备步骤包括：一、利用含有氨基硅烷、直链烷基硅烷的乙醇溶液对陶瓷膜整体进行疏水改性,再利用双氧水氧化去除分离层表面的氨基硅烷、直链烷基硅烷,暴露出亲水羟基,得到支撑体侧疏水而分离层侧亲水的Janus改性陶瓷膜；二、在疏水侧表面锚定交联剂,再通过交联剂和脂肪酶的反应,将脂肪酶固定在陶瓷膜疏水侧。本发明具有以下优点：制备方法简单,操作方便；陶瓷膜管壁厚,载酶量大；陶瓷膜酶反应器使用稳定性好；对纯油或水溶性油脂降解效率高。(The invention relates to a method for modifying and fixing lipase on Janus on the surface of a ceramic membrane. One side of the Janus modified ceramic membrane is hydrophilic, and the other side of the Janus modified ceramic membrane is hydrophobic, and then lipase is fixed on the hydrophobic side of the Janus modified ceramic membrane. The preparation method comprises the following steps: firstly, performing hydrophobic modification on the whole ceramic membrane by using an ethanol solution containing aminosilane and linear alkyl silane, oxidizing and removing the aminosilane and the linear alkyl silane on the surface of a separation layer by using hydrogen peroxide, and exposing hydrophilic hydroxyl to obtain a Janus modified ceramic membrane with the support body side hydrophobic and the separation layer side hydrophilic; secondly, anchoring a cross-linking agent on the surface of the hydrophobic side, and then fixing the lipase on the hydrophobic side of the ceramic membrane through the reaction of the cross-linking agent and the lipase. The invention has the following advantages: the preparation method is simple and convenient to operate; the wall thickness of the ceramic membrane tube is thick, and the enzyme carrying capacity is large; the ceramic membrane enzyme reactor has good use stability; has high degradation efficiency on pure oil or water-soluble grease.)

一种陶瓷膜表面Janus改性并固定脂肪酶的方法

技术领域

本发明涉及一种陶瓷膜表面Janus改性并固定脂肪酶的方法。

背景技术

脂肪酶亦称甘油酯水解酶，广泛存在于含脂肪的动植物体中。能够催化一些不溶性脂类的酯化水解，其催化机理是切断三甘油酯分子上的脂键，使得油脂分解成单甘油脂、脂肪酸等，这些产物具有较好的溶解性，易于去除。酶的催化反应条件温和，催化选择性高，因而广泛应用于医药、食品加工、生物研究等行业。但由于脂肪酶分散于原液中，导致其催化活性大大减小；并且后续还需要对产品进行酶分离操作，操作步骤复杂，酶的重复使用性也受到影响。

酶膜反应器是将自由酶通过一定技术手段固定于膜上，达到催化、分离一体的目的，因此具有设备简单、反应效率高等优点。原液侧的液体在推动力下透过膜，原液组分在膜表面被固定化酶分解，并通过膜的选择性分离功能，达到分离不同组分的目的。固定化酶与自由酶相比，酶的稳定性得到加强；并且由于脂肪酶独特的“界面活化”现象，酶催化性能在亲疏水界面处能够得到大大提高强，因此在油脂水解等领域具有很高的应用价值。

常见的酶膜反应器中基本都是采用有机膜材料做基底，一是因为有机膜材料易于改性，表面容易产生固定酶的活性位点。二是因为有机膜制膜过程或制膜方法易于调控，如通过调控膜孔径或内部结构，使得酶更易于固定在膜上；或者在制膜液中添加酶或酶载体，使酶均埋于膜材料内部。专利CN101255348描述了一种通过物理方法将脂肪酶固定于中空纤维的透醇膜表面，利用中空纤维膜对低碳醇的选择透过性来提供制备生物柴油过程中所需的低碳醇，用于催化油脂法制取生物柴油。专利CN102304503A描述了一种利用物理吸附结合交联的方法将脂肪酶固定在醋酸纤维素/聚四氟乙烯制成的复合有机膜表面，提高了酶在反应体系中的活性。但有机膜做固定酶的载体，其最大的弊端在于其材料性能(如化学稳定性、热稳定性、强度等)的不足使其在使用过程中容易发生溶胀、变性，使得膜微观结构发生改变，影响物理吸附或包埋固定酶的效果，使用过程中很容易造成酶的脱落泄露，不能长期使用以及不适用于某些特定环境(如高温)的过滤条件。

无机陶瓷膜具有热稳定性好、化学稳定性高、机械强度高等优点逐渐被应用于膜分离行业。无机陶瓷膜本身具有亲水性，对陶瓷膜表面亲疏水性的调控已经有报道。专利CN108380058A描述了利用化学气相沉淀法对陶瓷膜进行疏水改性，反应物单体和引发剂在电热丝加热下以气体形式吸附在膜表面并进行聚合反应，最终在膜表面形成一层疏水性薄膜，达到疏水改性目的。专利CN108722207A提出分别利用多巴胺与脂肪胺混合液、多巴胺/KH560混合液涂覆在膜两侧表面分别改性得到一面亲水一面疏水的Janus膜，用于油水分离及膜蒸馏领域。专利CN108704489A提出了一种制备一面为疏水/亲油的改性ZnO/纤维素膜和一面为亲水/水下疏油的改性MnO₂纳米线膜的柔性Janus复合膜，应用于油包水和水包油型乳液进行分离。专利CN106669440A中描述通过使用涂覆法或浸渍法将硅烷类化合物沉淀到陶瓷膜表面，随后在保护氛围内进行热处理，冷却后得到改性陶瓷膜。以上专利都是通过改变膜表面亲疏水性，来提高陶瓷膜分离性能或者提高陶瓷膜的抗污染性能。

基于脂肪酶独特的“界面活化”现象，本专利对无机陶瓷膜进行Janus改性，让膜支撑体侧疏水而分离层侧亲水，并在疏水侧化学接枝固定脂肪酶，构建一种陶瓷膜酶反应器。相比于有机膜，陶瓷膜稳定性更强，适用于长期使用；并且陶瓷膜膜壁厚，具有更大的载酶量。本专利的以无机陶瓷膜为基底的酶膜反应器，用于生物柴油制备、油脂水解等领域，具有很好的应用前景。

发明内容

(1)此发明针对已有方法的不足，选择陶瓷膜为载体，提出对陶瓷膜表面Janus改性并共价结合脂肪酶的方法。固定化脂肪酶拥有良好的催化效率和稳定性，为油脂的降解以及生物柴油的制备提供了一个简便高效的处理方法。

(2)本发明利用陶瓷膜做载体，对其支撑体侧进行氨基硅烷改性，再通过共价接枝方式固定脂肪酶。同时利用长链烷基硅烷对支撑体侧进行疏水改性；分离层侧通过双氧水氧化处理，使其保持亲水性。在亲疏水界面处，脂肪酶催化性能得到大大提高。

(3)本专利对陶瓷膜表面进行Janus改性并共价结合脂肪酶，采用如下技术方案，其中主要步骤包括：

a.将陶瓷膜整体浸入溶有氨基硅烷、直链烷基硅烷的乙醇溶液中，然后再用双氧水擦拭陶瓷膜分离层表面，使得羟基暴露得到亲水性表面，洗净烘干后得到支撑体侧疏水、分离层侧亲水的Janus改性陶瓷膜。

b.将疏水侧浸入体积浓度为0.05％-5％的交联剂溶液中进行交联反应，清洗表面未反应的交联剂，干燥后保存。将锚定交联剂的陶瓷膜浸入质量浓度为0.5-50mg/ml的脂肪酶溶液中进行酶固定化，然后取出清洗干燥，最终获得固载酶的陶瓷膜。

(4)此方法采用的氨基硅烷浓度为0.01M，氨基硅烷与直链烷基硅烷的浓度之比为1:(0.1-10)。通过硅烷水解与膜表面羟基官能团反应，形成功能化的改性膜表面，提供化学锚固脂肪酶的活性位点。

(5)上述(3)中陶瓷膜为支撑层为α-氧化铝，或者氮化硅，分离层为氧化铝，或者氧化锆，或者氧化钛，或者氧化硅，或者以上两种或多种材料的混合的复合膜中的一种，其分离层的孔径为0.5nm-1μm。

(6)上述(3)中所选用的氨基硅烷为3-氨丙基三甲氧基硅烷(KH-540)，或者γ-氨丙基甲基二甲氧基硅烷(KH-554)，或者γ-氨丙基三乙氧基硅烷，或者N-正丁基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷(KH-558)，或者N-(6-氨基己基)氨基甲基三乙氧基硅烷，或者11-氨基十一烷基三乙氧基硅烷，或者4-氨基丁基三乙氧基硅烷。所选用的直链烷基硅烷为乙基三甲氧基硅烷、或者正己基三甲氧基硅烷、或者辛基三甲氧基硅烷、或者十六烷基三甲氧基硅烷。

(7)上述(3)中所选用的交联剂为戊二醛，或者聚乙烯亚胺类中的一种，或者聚丙烯胺类中的一种。

(8)使用该方法所得的复合膜载酶量达到35mg/g以上，对纯油或水溶性油脂进行降解，均有很好的效果。在单次循环过滤中，转化速率相比于自由酶提升80％以上；固定酶活性达到35.7U/mg以上，相比于自由酶，85％以上的活性得到保留。在0.1MPa下连续运行4小时，酶脱附率小于6％，具有很好的稳定性。

有益效果：

1、陶瓷膜管壁为2-3mm厚，厚度远大于有机膜，因此载酶量大。

2、陶瓷膜酶反应器稳定性强，重复使用性好。

3、陶瓷材料转移电子能力强，并且在Janus改性陶瓷膜的亲疏水界面处，脂肪酶的催化性能得到提高，因此对油脂的转化效率高。

具体实施方式

实施例1：将平均孔径为0.5nm的Al₂O₃膜浸泡在去离子水中0.5h后，再在80℃干燥2h。接着将Al₂O₃膜浸泡在含有浓度为0.01M 3-氨基丙基三甲氧基硅烷、浓度为0.001M乙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液中改性20min，取出后再用双氧水擦拭分离层表面。将所得陶瓷膜用乙醇清洗干净，并干燥后，得到支撑体侧疏水、分离层侧亲水的Janus陶瓷膜。将得到的Janus陶瓷膜用磷酸缓冲液润湿后，浸泡在溶有戊二醛(体积浓度0.25％)的磷酸缓冲液中5min，再将膜取出用磷酸缓冲液清洗掉未反应的戊二醛。最后将陶瓷膜浸泡在含有3mg/ml脂肪酶的磷酸缓冲液中24h，将膜取出清洗干净得到固载脂肪酶的陶瓷膜，存放于4℃暗光环境。

载酶稳定性测试：采用死端过滤方式，压力保持在0.1MPa，用纯橄榄油做底液连续过滤4h，单位面积单位时间脂肪酶的脱附率为5％。固定脂肪酶保留20％以上活性的适宜pH值从自由酶的PH 6-8.5扩大为pH 5-10。固定脂肪酶保留20％以上活性的适宜温度从自由酶的25℃-45℃扩大为20℃-50℃。

固酶活性及效果：固定酶活性为37.83U/mg，相比于自由酶活性仍有90％；载酶量为35mg/g；处理含油废水，相比于同等条件下的自由酶，固定化酶对脂肪的降解速率提升90％以上。

实施例2：将平均孔径10nm的SiO₂陶瓷膜放入去离子水浸泡0.5h后放入80℃环境干燥2h。放入氨基硅烷摩尔浓度为0.01M的γ-氨丙基三乙氧基硅烷、浓度为0.01M正己基三甲氧基硅烷的乙醇溶液进行疏水改性，反应时间为360min，取出陶瓷膜体后用双氧水擦拭分离层表面，得到亲水性表面层，随后用乙醇将改性后的Janus陶瓷膜进行清洗，并干燥，得到的改性Janus膜用磷酸缓冲液润湿后浸入体积浓度为4％的聚乙烯亚胺的磷酸缓冲液中10min。再取出膜体用磷酸缓冲液清洗未反应的聚乙烯亚胺。最后将得到的陶瓷膜洗净浸入浓度为0.5mg/ml的脂肪酶溶液中30h。将膜取出，充分清洗得到固载酶的陶瓷膜，放入低温4℃暗光环境保存。

载酶稳定性测试：采用死端过滤方式，入口压力稳定保持0.1MPa，用纯橄榄油做底液连续过滤4h，单位面积单位时间脂肪酶的脱附率为5％。与自由酶的稳定性相比得到提升，固定脂肪酶保留20％以上活性的适宜pH值从自由酶的pH6-8.5扩大为pH 5.5-10。固定脂肪酶适宜温度保留20％以上活性从自由酶25℃-45℃扩大为23℃-55℃。

固酶活性及效果：固定酶活性为35.7U/mg，相比于自由酶活性，固定酶仍具有85％活性；载酶量为38mg/g；相比于同等条件下的自由酶，处理水解含油废水脂肪的速率提升85％以上。

实施例3：将平均孔径为50nm的TiO₂陶瓷膜放入去离子水浸泡0.5h后放入80℃环境干燥2h，然后放入氨基硅烷摩尔浓度为0.01M的4-氨基丁基三乙氧基硅烷、浓度为0.05M的乙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液进行疏水改性30min，取出陶瓷膜体后用双氧水擦拭分离层表面，得到亲水性表面层，随后用乙醇将改性后的Janus陶瓷膜清洗并干燥，得到的改性Janus陶瓷膜用磷酸缓冲液润湿后浸入体积浓度为入体积浓度为0.05％的戊二醛磷酸缓冲液中30min。再取出膜体用磷酸缓冲液清洗表面未反应的戊二醛。最后将得到的陶瓷膜浸入浓度为10mg/ml的脂肪酶溶液中，固酶时间为18h。将膜取出，进行充分清洗得到固载酶的陶瓷膜，放入4℃暗光环境妥善保存。

载酶稳定性测试：采用死端过滤方式，入口压力稳定保持0.1MPa，用纯橄榄油做底液连续过滤4h，测得单位面积单位时间上脂肪酶的脱附率小于4％，与自由酶的稳定性相比得到提升，固定脂肪酶保留20％以上活性的适宜pH值从自由酶的pH 6-8.5扩大为pH 5-10。固定脂肪酶适宜温度保留20％以上活性从自由酶25℃-45℃扩大为20℃-55℃。

固酶活性及效果：固定酶活性为37.2U/mg，固定酶的活性相对于自由酶活性有85％得到保存；载酶量为40mg/g；对含油废水乳化液的降解过滤相较于自由酶脂肪水解速率提升了80％以上。

实施例4：将平均孔径为30nm的ZrO₂陶瓷膜放入去离子水浸泡0.5h后放入80℃环境干燥2h，放入氨基硅烷摩尔浓度为0.01M的N-(6-氨基己基)氨基甲基三乙氧基硅烷、浓度为0.03M的辛基三甲氧基硅烷的乙醇溶液进行疏水改性40min，取出陶瓷膜体后用双氧水擦拭分离层表面，得到亲水性表面层，随后用乙醇将改性后的Janus陶瓷膜清洗并干燥。将得到的改性Janus陶瓷膜用磷酸缓冲液润湿后浸入体积浓度为5％的聚丙烯亚胺磷酸缓冲液中10min。再取出膜体用磷酸缓冲液清洗表面未反应的聚丙烯亚胺。最后得到的陶瓷膜浸入浓度为20mg/ml的脂肪酶溶液中，酶固定时间为12h。将膜体取出并清洗，得到的固载酶的陶瓷膜，放入4℃低温暗光条件下保存。

载酶稳定性测试：采用死端过滤方式，入口压力稳定保持0.1MPa，用纯橄榄油做底液连续过滤4h，测得单位面积单位时间脂肪酶的脱附率小于6％，与自由酶的稳定性相比，固定脂肪酶保留20％以上活性的适宜pH值从自由酶的pH6-8.5扩大为pH 5-10。固定脂肪酶保留20％以上活性的适宜温度从自由酶25℃-45℃扩大为20℃-55℃。

固酶活性及效果：固定酶活性为39.55U/mg，固定酶的活性相对于自由酶活性有85％得到保存；单位面积上的载酶量为42mg/g；对含油废水乳化液的降解过滤相较于自由酶水解脂肪的速率提升了85％以上。

实施例5：将平均孔径100nm的ZrO₂陶瓷膜放入去离子水浸泡0.5h后放入80SS℃环境干燥2h，然后将陶瓷膜放入氨基硅烷摩尔浓度为0.01M的11-氨基十一烷基三乙氧基硅烷、浓度为0.1M的辛基三甲氧基硅烷的乙醇溶液进行疏水改性40min，取出陶瓷膜体后用双氧水擦拭分离层表面，得到亲水性表面层，随后用乙醇将改性后的Janus陶瓷膜清洗并干燥。将得到的改性Janus陶瓷膜用磷酸缓冲液润湿后浸入体积浓度为1.5％的戊二醛磷酸缓冲液液中20min。取出膜体用磷酸缓冲液清洗表面未反应的戊二醛。最后将清洗后的陶瓷膜浸入浓度为50mg/ml的脂肪酶溶液中，固酶时间为8h。将膜取出并充分清洗，得到固载酶的陶瓷膜，放入4℃低温暗光环境妥善保存。

载酶稳定性测试：采用死端过滤方式，入口压力稳定保持0.1MPa，用纯橄榄油做底液连续过滤4h，测得单位面积单位时间脂肪酶的脱附率小于6％，与自由酶相比，固定脂肪酶的稳定性得到提升，固定脂肪酶保留20％以上活性的适宜pH值从自由酶的pH 6-8.5扩大为pH 5-10。固定脂肪酶适宜温度保留20％以上活性从自由酶25℃-45℃扩大为20℃-55℃。

固酶活性及效果：固定酶活性为40.34U/mg，固定酶的活性有90％得到保存，并用于对含油废水乳化液的降解过滤；单位面积上的载酶量为42mg/g；相较于自由酶，含油废水的水解速率提升了90％以上。

实施例6：将平均孔径为1μm的Al₂O₃陶瓷管式膜放入去离子水浸泡0.5h后放入80℃环境干燥，然后将陶瓷膜放入含有0.01M N-正丁基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷、0.02M十六烷基三甲氧基硅烷的乙醇溶液中改性60min，取出陶瓷膜后用双氧水擦拭陶瓷膜分离层表面，得到亲水性表面层，随后用乙醇将改性后的陶瓷膜清洗并干燥，得到Janus改性的陶瓷膜。再将Janus陶瓷膜用磷酸缓冲液润湿后浸入体积浓度为3％的聚乙烯亚胺磷酸缓冲液中60min，取出后用磷酸缓冲液清洗表面未反应的聚乙烯亚胺。最后将清洗后的陶瓷膜浸入浓度为10mg/ml的脂肪酶溶液中，固酶反应8h。将固载酶后的陶瓷膜充分清洗，放入4℃低温暗光条件保存。

测定两相膜反应器效果：纯橄榄油在改性陶瓷膜疏水侧循环，压力稳定在0.1MPa，纯水(PH＝7)在改性陶瓷膜亲水侧循环，橄榄油在Janus陶瓷膜的亲疏水界面处被脂肪酶分解为水溶性脂肪酸。通过测定纯水中脂肪酸的含量来反映已经降解的橄榄油质量，从而得到酶膜反应器对橄榄油的降解率。测得载酶量为40.8mg/g，测得橄榄油的水解速率为600mg/cm²·h，橄榄油降解率为97％。

载酶量、载酶稳定性、酶活性测试方法：

单位面积上载酶量的计算方法为：

式中Q₀为单位面积上的载酶量，Cp、Vp分别为过滤剩余溶液中的酶浓度和过滤液体积，Ci和Vi分别为各清洗过程中清洗液、保存液中酶的浓度和体积，C₀和V₀分别为过滤前配置的初始酶溶液浓度和体积，m为膜初始重量。

载酶稳定性通过测量膜表面脂肪酶运行一定时间后的脱附率来表示。脱附率的测定方法为：取一定面积的膜样品固定在膜组件中，在室温且膜原液侧进口压力为0.1MPa下循环过滤4小时，收集过滤液，测定过滤液中含酶量，计算公式如下：

式中φ为酶脱附率，Q₁为过滤液中含酶量，Q₀为单位面积上的载酶量。

脂肪酶酶活性的测定：一个酶活单位的定义为，1mg脂肪酶在温度为30℃，pH＝7环境下在1min内产生1ug的脂肪酸即为1U个酶活性。

比较自由酶活性与固定酶的活性的测定方法：在测定温度为30℃，pH＝7的条件下，测定比较0.1mg自由酶与载酶量为0.1mg的陶瓷膜对相同体积相同浓度油溶液催化降解，并同时计时，通过标准液滴定的方法测定两组在相同时间内所生成的脂肪酸含量，单位时间内分别生成的脂肪酸含量即分别为两组的酶活性。

酶活性测定公式：

式中A为酶活性，V为滴定所消耗的标准滴定液体积，C为标准滴定液的浓度，D为1ml标准滴定液相当于Dμmol的脂肪酸，N为被滴定溶液的稀释倍数，z为标准滴定液的浓度换算系数，t为滴定消耗的时间。

适宜pH值的测定：在测定温度为30℃条件下，配置一系列pH值范围从3—11的相同体积相同浓度的油过滤底液，分别测得0.1mg自由脂肪酶和载酶量为0.1mg的陶瓷膜的最大酶活性M。采用以上所述的酸碱滴定法依次测得不同pH下自由酶和固定酶的酶活性M1，选取M1/M>20％对应的pH值范围即为适宜pH值。

油脂降解率/油脂降解速率的测试方法：采用死端过滤的方式，两相界面降解过滤法，维持0.1MPa稳定的膜入口压力过滤参数，计算出原液侧膜的有效表面积，测得过滤前以及过滤终了的油脂质量以及过滤时间。

式中R₁，R₂分别为油脂降解率和油脂降解速率，m₁为油脂总质量，m₂为已经降解的油脂质量，S为原料液侧膜的有效面积，t为降解的时间。