阅读说明：本技术 一种快速改良盐敏感水稻品种中花11提高耐盐性的方法 (Method for rapidly improving salt tolerance of flower 11 in salt-sensitive rice variety ) 是由 宗营杰 郭桂梅 张述伟 高润红 陈志伟 刘成洪 于 2020-05-06 设计创作，主要内容包括：本发明涉及植物生物技术领域,具体是一种快速改良盐敏感水稻品种中花11提高耐盐性的方法,利用<Sup>60</Sup>Coγ-射线辐照创造变异,采用小孢子培养单倍体技术快速纯合稳定,提出在小孢子诱导胚胎发生阶段采用800mg/L NaCl可达半数抑制筛选,获得DH株系在幼苗期施加8.7g/L NaCl胁迫处理,以幼苗的叶片茎秆失绿和卷曲程度为表型分级指标进行苗期耐盐性评价,以分级指标3.8以上筛选,最终获得苗期耐盐性显著提高的材料得率1％以上。本发明提供了快速改良盐敏感水稻品种的一套完整方法,建立了明确筛选与鉴定指标,提高了耐盐性改良效率；方法简单易观测,在规模化鉴定中具有可操作性。(The invention relates to the technical field of plant biology, in particular to a method for quickly improving salt tolerance of flower 11 in a salt-sensitive rice variety by utilizing 60 Co gamma-ray irradiation is used to create variation, microspore is used to culture haploid for fast purification and stabilization, 800 mg/L NaCl is used to half inhibition and screening in microspore inducing embryogenesis stage to obtain DH strain, 8.7 g/L NaCl stress treatment is applied in seedling stage, the green and curling degrees of seedling leaf and stem are used as the grading indexes to evaluate the salt tolerance of seedling stage, and grading index over 3.8 is used to screen out and obtain material with obviously raised salt tolerance in seedling stage in yield over 1%The complete method is adopted, clear screening and identification indexes are established, and the salt tolerance improvement efficiency is improved; the method is simple and easy to observe, and has operability in large-scale identification.)

一种快速改良盐敏感水稻品种中花11提高耐盐性的方法

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体地说，是一种快速改良盐敏感水稻品种中花11提高耐盐性的方法。

背景技术

盐胁迫是限制植物生长发育和农业生产的主要环境因子之一，土壤盐渍化严重制约了农业的可持续发展及粮食的生产，成为世界性面临的土壤问题之一。因此，提高作物的耐盐能力，选育耐盐强的作物品种，对于改良盐渍土壤，促进农业发展，具有十分重要的意义。水稻是最重要的粮食作物之一，世界上约有一半以上的人口以稻米为主食。我国有十几亿亩盐碱地是不毛之地，其中将近两亿亩可以种水稻，如耐盐碱的“海水稻”等可以推广种植，将对我国的粮食安全起到战略保障作用。中花11是我国应用花培技术选育的优良粳稻品种，是水稻研究中的重要遗传转化材料，属于盐敏感类型。目前已有一些研究报道了在该品种中开展盐胁迫相关的表型和转基因研究(高林,陈春丽.NaCl胁迫对水稻品种中花11幼苗根系生长发育的影响[J].种子,2012,31(7):7-12；杨晓华,彭晓珏,杨国华,等.水稻OsRab7耐盐功能的初步鉴定及其表达载体的构建[J].武汉植物学研究,2008,26(1):1-6.)，但未见采用常规育种手段快速改良其耐盐性的报道。

中国专利文献CN102106259A公开了一种改良和谷类作物耐盐性状的方法，该方法包括在游离后小孢子、胚状体诱导、再生植株的分化培养过程中分别给予NaCl胁迫筛选，用NaCl对所述作物的小孢子进行离体处理，在诱导培养期、植株分化期分别给予NaCl胁迫筛选，层层淘汰，获得生根的再生植株后，移栽至温室，成熟后按株收获。收获后的种子置于添加NaCl的胁迫培养基上发芽，从中筛选出耐盐性强的加倍单倍体株系。该方法缺陷是小孢子胁迫筛选方法以大麦(旱地作物)为实施对象，其方法条件不适用于水稻(水田作物)；采用了多个培养过程连续NaCl盐胁迫筛选，程序繁琐；缺乏半数抑制浓度的有效性筛选，有效性不明确。

但是关于一种采用常规育种手段快速改良盐敏感水稻品种中花11提高耐盐性的方法目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供针对盐敏感的水稻模式品种中花11，提供一种快速改良方法来提高其耐盐性，通过种子辐照诱变后在小孢子离体胚胎发育和再生加倍单倍体株系施加合适的NaCl盐胁迫，快速筛选获得纯合稳定的耐盐性提高的种质材料。

相对于中国专利文献CN102106259A公开的一种改良和谷类作物耐盐性状的方法，本发明的优点在于：针对水稻模式品种“中花11”建立改良方法，对象明确，指导性强；改良方法包括3步：种子辐照诱变—小孢子胚胎发育的诱导过程中采用NaCl盐胁迫筛选—再生加倍单倍体株系苗期NaCl盐胁迫鉴定，步骤更简单；首次提出以小孢子启动胚胎发育的半数抑制比例确定NaCl筛选浓度，有效性高；根据幼苗叶片和茎秆失绿程度以及卷曲程度提出苗期鉴定分级指标，可操行强。

为了实现上述目的，本发明提供一种快速改良盐敏感水稻品种中花11提高耐盐性的方法，包括以下步骤：

A)水稻品种中花11干种子采用⁶⁰Coγ-射线辐照，剂量300-400GY(根据本试验观察，高于400影响发芽率，低于300的诱变效果不明显，优选350GY，辐照效果较好)；

B)辐照种子播种大田，育苗移栽，正常水肥管理至抽穗；

C)幼穗低温处理一周后，游离小孢子培养，在小孢子离体胚胎发育过程中，采用800mg/L NaCl盐胁迫；可取得理想筛选效果(半抑制浓度)，4d小孢子膨大启动胚胎发育的数量比例和21d诱导胚性愈伤产量均下降到对照(不添加NaCl胁迫)一半左右；

根据文献，水稻耐盐性比大麦差，但应用400mg/L NaCl胁迫筛选(前期专利确定浓度范围为50～500mg/L)时虽对小孢子启动胚胎发育有显著抑制，但对胚性愈伤诱导的抑制效果无显著差异，选用800mg/L NaCl胁迫筛选时，两个指标都接近对照的一半左右，取得理想效果。

D)获得再生植株，流式细胞仪鉴定倍性，选出加倍单倍体(二倍体)；最低得率50％以上；

E)繁种，获得加倍单倍体株系(DH株系)群体；

F)加倍单倍体株系(DH株系)Yoshida营养液水培添加8.7g/L NaCl胁迫筛选，按失绿和卷曲程度进行表型分级评价，鉴定出耐盐性比原始亲本提高的加倍单倍体株系(DH株系)，评价分级指数提高约一倍的材料即为耐盐性显著提高的材料。

进一步的，所述的步骤C中游离小孢子培养：取小孢子处于单核时期的幼穗，保鲜袋封好置于4℃冰箱低温处理一周，接种前用次氯酸钠溶液消毒15min，无菌条件下挑取花药，采用高速匀浆器打碎，过筛，用含60g/L甘露醇提取液重悬，置于含麦芽糖90g/L,2,4-D1.5mg/L的改良N6培养基上诱导生成胚性愈伤。

进一步的，所述的步骤C中在小孢子诱导胚性愈伤形成过程中，采用800mg/L NaCl胁迫处理。

进一步的，所述的步骤D中胚性愈伤组织诱导获得再生植株：步骤C胁迫筛选得到的小孢子诱导培养21d获得的胚性愈伤组织，转移到含蔗糖30g/L，TDZ 0.5mg/L和6-BA0.5mg/L的改良MS培养基上诱导形成绿苗。

进一步的，所述的步骤D中再生植株倍性鉴定方法：获得再生植株取叶片，切碎用LB-01缓冲液解离细胞核，再用PI/Rnase染液处理后，取滤液上流式细胞仪鉴定倍性，选用种子实生苗作为对照(二倍体)出峰位置，鉴定加倍单倍体(二倍体)。

进一步的，所述的步骤E：小孢子培养获得的加倍单倍体植株，通过营养液水培炼苗，生长出新根后幼苗长至10cm左右时，打包保湿送往海南南繁基地，当年移栽大田，第二年收获单株种子，形成加倍单倍体株系(DH株系)群体。

进一步的，所述的步骤F中表型分级评价标准为：

根据幼苗叶片和茎秆失绿程度以及卷曲程度，共分5级，5级耐盐性最好，1级最差；

1级：幼苗整株无绿色部分，基本确认死亡；

2级：心叶和茎秆均已失绿过半，严重卷曲，其他叶片枯黄死亡；

3级：心叶和茎秆部分失绿，少部分叶片仍有绿色，大部分叶片枯黄死亡；

4级：叶片尖部发黄卷曲，中下部叶片和茎秆仍保持绿色，部分叶片已发生卷曲；

5级：只有叶片尖部发黄卷曲，其余部叶片和茎秆仍保持绿色，心叶和倒二叶半数可见展开部分；

采用上述鉴定方法，以分级评价指数较原始亲本提高一倍(平均分级值3.8)作为筛选标准，鉴定出耐盐性比原始亲本提高的DH株系。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述的快速改良盐敏感水稻品种中花11提高耐盐性的方法，包括以下步骤：

A)种子辐照诱变：取水稻品种中花11的干种子，采用⁶⁰Coγ-射线辐照，使用剂量350GY；

B)大田播种与育苗移栽：辐照水稻种子大田播种，育苗后移栽，常规水肥管理至抽穗；基肥20kg/亩，分蘖肥追施尿素10kg/亩，拔节肥追施复合肥15kg/亩；

C)游离小孢子培养：取小孢子处于单核时期的幼穗，置于4℃冰箱低温处理一周，接种前用次氯酸钠溶液消毒15min，无菌条件下挑取花药，采用高速匀浆器打碎，过筛，用含60g/L甘露醇提取液重悬，置于含麦芽糖90g/L，2,4-D 1.5mg/L的改良N6培养基上诱导生成胚性愈伤；

D)胚胎发育过程中盐胁迫处理：在小孢子诱导胚性愈伤形成过程中，采用800mg/LNaCl胁迫处理；

E)胚性愈伤组织诱导再生植株：小孢子诱导培养21d获得的胚性愈伤组织，转移到含蔗糖30g/L，TDZ 0.5mg/L和6-BA 0.5mg/L的改良MS培养基上诱导形成绿苗；

F)再生植株倍性鉴定：获得再生植株取叶片，切碎用LB-01缓冲液解离细胞核，再用PI/Rnase染液处理后，取滤液上流式细胞仪鉴定倍性。选用种子实生苗作为对照(二倍体)出峰位置，鉴定加倍单倍体(二倍体)，统计结果估计自发加倍频率约50％；

G)海南繁种：小孢子培养获得的加倍单倍体植株，通过营养液水培炼苗，生长出新根后幼苗长至10cm左右时，打包保湿送往海南南繁基地，当年移栽大田，第二年收获单株种子，形成加倍单倍体株系(DH株系)群体；

H)Yoshida营养液盐胁迫水培筛选：每份DH株系取种子约50粒，浸种催芽后，幼苗转移至营养液水培，添加8.7g/L NaCl胁迫处理，同时采用耐盐性强的韭菜青品种为对照，以幼苗的生长表型作为幼苗期耐盐性分级评价，具体标准如下：

根据幼苗叶片和茎秆失绿程度以及卷曲程度，共分5级，5级耐盐性最好，1级最差；

1级：幼苗整株无绿色部分，基本确认死亡；

2级：心叶和茎秆均已失绿过半，严重卷曲，其他叶片枯黄死亡；

3级：心叶和茎秆部分失绿，少部分叶片仍有绿色，大部分叶片枯黄死亡；

4级：叶片尖部发黄卷曲，中下部叶片和茎秆仍保持绿色，部分叶片已发生卷曲；

5级：只有叶片尖部发黄卷曲，其余部叶片和茎秆仍保持绿色，心叶和倒二叶半数可见展开部分；

采用上述鉴定方法，以分级评价指数较原始亲本(水稻中花11幼苗期平均分级值为1.9)提高一倍(平均分级值3.8)作为筛选标准，鉴定出耐盐性比原始亲本提高的DH株系。根据幼苗叶片和茎秆失绿程度以及卷曲程度提出苗期鉴定分级指标，以评价分级指数提高约一倍的材料为苗期耐盐性提高鉴定标准，筛选获得比例可达1％以上。

本发明提供了一种针对盐敏感水稻品种中花11耐盐性快速改良的方法，该方法利用⁶⁰Coγ-射线辐照创造变异，采用小孢子培养单倍体技术快速纯合稳定，提出在小孢子诱导胚胎发生阶段采用800mg/L NaCl可达半数抑制筛选，获得DH株系在幼苗期施加8.7g/LNaCl胁迫处理，以幼苗的叶片茎秆失绿和卷曲程度为表型分级指标进行苗期耐盐性评价，以分级指标3.8(对照材料分级指标2倍)以上筛选，最终获得苗期耐盐性显著提高的材料得率1％以上。常规诱变获得目标性状的比例万分之一或更低，本发明通过早期胁迫筛选得率可以达到1％以上，相比常规方法显著提高。

本发明的主要改进点：1.六步法完成改良全部过程；2.首次提出以小孢子启动胚胎发育的半数抑制比例、小孢子胚胎发育形成胚性愈伤产量等两个指标确定NaCl筛选浓度，有效性更好；3.首次提出根据幼苗叶片和茎秆失绿程度以及卷曲程度提出苗期鉴定分级指标，可操行强；4.按本方法改良中花11苗期耐盐性的比例高，纯合稳定。

与现有技术相比，本发明优点在于：

1、本发明提供了快速改良盐敏感水稻品种的一套完整方法，建立了明确筛选与鉴定指标；

2、本发明采用了小孢子培养单倍体技术快速纯合稳定辐照诱变产生的变异，通过南繁加代两年内获得的加倍单倍体株系，可以直接用于鉴定，节省了3-5年材料自交纯合稳定的时间；

3、在小孢子启动胚胎发育和幼苗期等两个时期采用NaCl盐胁迫处理，进行早期耐盐性筛选与鉴定，提高了耐盐性改良效率；

4、本发明建立的耐盐性筛选与鉴定方法简单易观测，在规模化鉴定中具有可操作性。

附图说明

图1.水稻中花11离体小孢子在不同浓度盐胁迫下启动胚胎发育(红色箭头表示膨大小孢子)的显微观察照片(A为CK对照；B为400mg/L NaCl处理；C为800mg/L NaCl；D为1200mg/L NaCl处理)。

图2水稻中花11离体小孢子在不同浓度盐胁迫下启动胚胎发育(膨大)的数量比例；

图3水稻中花11离体小孢子在不同浓度盐胁迫下诱导的胚性愈伤产量；

图4水稻中花11幼苗耐盐性鉴定分级示例(左侧数字表示分级数值)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1：

A)种子辐照诱变：取水稻品种中花11的干种子100g，送上海市农业科学院辐照室，采用⁶⁰Coγ-射线辐照，使用剂量350GY。

B)大田播种与育苗移栽：辐照水稻种子大田播种，育苗后移栽，常规水肥管理至抽穗。基肥20kg/亩，分蘖肥追施尿素10kg/亩，拔节肥追施复合肥15kg/亩。

C)游离小孢子培养：取小孢子处于单核时期的幼穗，保鲜袋封好置于4℃冰箱低温处理一周，接种前用次氯酸钠溶液消毒15min，无菌条件下挑取花药，采用高速匀浆器打碎，过筛，用含60g/L甘露醇提取液重悬，置于含麦芽糖90g/L,2,4-D 1.5mg/L的改良N6培养基上诱导生成胚性愈伤。

D)胚胎发育过程中盐胁迫处理：在小孢子诱导胚性愈伤形成过程中，采用0，400，800和1200mg/L NaCl胁迫处理，培养4d时，倒置显微镜观察，每个培养皿选取代表性5个视野进行拍照，统计小孢子启动胚胎发育开始膨大的数目(图1)，计算其百分比。由图2可见，400mg/L NaCl胁迫处理，诱导启动的小孢子数量比例受到极显著抑制，800mg/L NaCl胁迫处理，小孢子启动胚胎发育的数量比例下降至对照的一半左右。

诱导培养21d时，用移液器吸干皿底培养基，差重法计算小孢子诱导胚性愈伤的产量(mg/皿)。由图3可见，400mg/L NaCl胁迫处理对小孢子诱导胚性愈伤的产量影响不显著，而800mg/L NaCl胁迫处理对小孢子诱导胚性愈伤的产量产生显著影响，下降为对照的一半左右。

这两个步骤确定了最优的NaCl胁迫处理浓度，前期专利的浓度范围设置非常宽泛，对水稻不能体现有效性。本方法引入两个指标，即小孢子启动胚胎发育后膨大的数量比例、小孢子胚胎发育形成胚性愈伤的产量，确定到两个指标下降到正常对照(不添加NaCl胁迫)下降到一半的NaCl浓度。在体外胁迫或抑制试验中，筛选压的选择要达到对照指标的一半，称为半数抑制浓度。

综合以上两个实验结果，针对盐敏感水稻品种中花11，在小孢子胚胎发育过程中采用800mg/L NaCl盐胁迫处理可取得有效的筛选抑制效果。

E)胚性愈伤组织诱导再生植株：小孢子诱导培养21d获得的胚性愈伤组织，转移到含蔗糖30g/L，TDZ 0.5mg/L和6-BA 0.5mg/L的改良MS培养基上诱导形成绿苗。

F)再生植株倍性鉴定：获得再生植株取叶片，切碎用LB-01缓冲液解离细胞核，再用PI/Rnase染液处理后，取滤液上流式细胞仪鉴定倍性。选用种子实生苗作为对照(二倍体)出峰位置，鉴定加倍单倍体(二倍体)，统计结果估计自发加倍频率约50％。

G)海南繁种：小孢子培养获得的加倍单倍体植株，通过营养液水培炼苗，生长出新根后幼苗长至10cm左右时，打包保湿送往海南南繁基地，当年移栽大田，第二年收获单株种子，形成加倍单倍体株系(DH株系)群体共计165份。

H)营养液(Yoshida营养液配方见表1)盐胁迫水培筛选：每份DH株系取种子约50粒，浸种催芽后，幼苗转移至营养液水培，添加8.7g/L NaCl胁迫处理，同时采用耐盐性强的韭菜青品种为对照，以幼苗的生长表型作为幼苗期耐盐性分级评价，具体标准如下：

根据幼苗叶片和茎秆失绿程度以及卷曲程度，共分5级，5级耐盐性最好，1级最差。

1级：幼苗整株无绿色部分，基本确认死亡

2级：心叶和茎秆均已失绿过半，严重卷曲，其他叶片枯黄死亡

3级：心叶和茎秆部分失绿，少部分叶片仍有绿色，大部分叶片枯黄死亡

4级：叶片尖部发黄卷曲，中下部叶片和茎秆仍保持绿色，部分叶片已发生卷曲

5级：只有叶片尖部发黄卷曲，其余部叶片和茎秆仍保持绿色，心叶和倒二叶半数可见展开部分；

采用上述鉴定方法，以分级评价指数较原始亲本(水稻中花11幼苗期平均分级值为1.9)提高一倍(平均分级值3.8)作为筛选标准，鉴定出耐盐性比原始亲本提高的DH株系5份(表2)，约占DH株系总数的3％。

表1水稻Yoshida水培营养液配方

注：母液各组分分别在烧杯中加纯净水充分溶解后定容至1L；组分F各组分先用50mL纯净水溶解后再混合，加入浓硫酸50mL，补足纯净水溶解定容至1L。

表2水稻中花11小孢子再生DH株系幼苗期耐盐性鉴定分级

注：中花11为盐敏感品种，韭菜青为耐盐性强对照品种。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。