阅读说明：本技术 亲和色谱装置 (Affinity chromatography device ) 是由 M·C·麦克玛纳维 于 2016-04-11 设计创作，主要内容包括：本发明涉及从含有靶蛋白或抗体的水性混合物中分离靶蛋白或抗体的亲和色谱装置。色谱装置可以包括堆叠膜组件或缠绕膜组件。膜组件包括至少一个其中含有无机颗粒的聚合物膜。聚合物膜和/或无机颗粒具有与之结合的亲和配体。亲和配体可以是以与靶蛋白或抗体可逆结合的蛋白、抗体或多糖。色谱装置可以重复使用,并且可以在使用之间用苛性溶液洗涤。色谱装置的动态结合能力可以为在20秒或更短的停留时间、10％穿透时等于至少30mg/ml(或0.07微摩尔/毫升)。(The present invention relates to an affinity chromatography device for separating a target protein or antibody from an aqueous mixture containing the target protein or antibody. The chromatography apparatus may comprise stacked membrane modules or wound membrane modules. The membrane module includes at least one polymeric membrane having inorganic particles contained therein. The polymer film and/or the inorganic particles have affinity ligands bound thereto. The affinity ligand may be a protein, antibody or polysaccharide that binds reversibly to the target protein or antibody. The chromatographic apparatus may be reused and may be washed with a caustic solution between uses. The dynamic binding capacity of the chromatographic device can be equal to at least 30mg/ml (or 0.07 micromole/ml) at a residence time of 20 seconds or less at 10% penetration.)

具体实施方式

本领域的技术人员应理解，可通过构造以实施所需作用的任何数量的方法和设备来实现本公开内容的各个方面。还应注意，本文参考的附图不一定是按比例绘制，而是有可能放大以说明本公开的各个方面，就此而言，附图不应视为限制性的。应理解：如本文所用，术语“在……上”是指一个元件(例如聚四氟乙烯膜)直接在另一元件上，或者还可存在插入元件。

本发明涉及从含有靶蛋白或抗体的水性混合物中分离靶蛋白或抗体的亲和色谱装置。色谱装置包括膜组件，所示膜组件包括至少一个其中含有无机颗粒的聚合物膜，例如，含氟聚合物膜。亲和配体可以与无机颗粒和/或聚合物膜结合。色谱装置可以重复使用，并且可以在使用之间用苛性溶液洗涤。此外，在Fc结合蛋白为亲和配体的装置中，色谱装置的动态结合能力(DBC)可以为在20秒或更短的停留时间、10％穿透时等于至少30mg/ml。在抗体、非Fc结合蛋白、或多糖为亲和配体的色谱装置中，色谱装置的动态结合能力(DBC)可以为在10％穿透时至少0.07微摩尔/毫升。

本文所述的膜组件包括至少一个其中含有无机颗粒的聚合物膜。聚合物膜可以包含约20质量％至约95质量％、约35质量％至约90质量％、或约50质量％至约85质量％的无机颗粒。合适的无机颗粒的非限制性示例包括：二氧化硅、沸石、羟基磷灰石，金属氧化物、及它们的组合。无机颗粒的标称粒度可以是约0.1微米、约0.5微米、约1微米、约5微米、约10微米、约15微米、约20微米、约25微米或更大。此外，无机颗粒可以是实心的或多孔的，并且可以具有各种尺寸和形状。另外，无机颗粒可以是单分散或多分散的。

在一示例性实施方式中，亲和配体与无机颗粒共价结合。在另一示例性实施方式中，亲和配体与聚合物膜共价结合。在另一实施方式中，亲和配体可以与聚合物膜和无机颗粒结合。亲和配体可以是以与靶蛋白或抗体可逆结合的蛋白、抗体或多糖。在一实施方式中，亲和配体是例如与抗体的Fc区域、抗体片段，Fc融合蛋白或抗体/药物偶联物可逆结合的蛋白质。在另一实施方式中，亲和配体是与对于其有特异性的蛋白或蛋白片段可逆结合的蛋白L、抗体或多糖。在亲和色谱装置中使用的示例性亲和配体包括但不限于：蛋白A、蛋白G、蛋白L、人Fc受体蛋白、特异性结合于其他蛋白的抗体、以及肝素。亲和配体可以是天然的、重组的、或合成的。在另一实施方式中，亲和配体是与His标记的蛋白可逆结合的金属亲和配体。

在一实施方式中，膜组件包括：在其中含有无机颗粒的至少一个聚合物膜，其中，聚合物膜以堆叠结构或层状结构设置，以形成堆叠膜组件。术语“堆叠膜组件”意思是指包括至少两个聚合物膜的色谱制品，所述至少两个聚合物膜定位成使得一个聚合物膜位于另一个聚合物膜上。聚合物膜可通过将膜简单放在彼此顶部上而设置成堆叠结构。图1显示了堆叠膜组件10的一种示例性取向，堆叠膜组件10包括：在其中含有具有标称粒度的无机颗粒的聚合物膜20。应该理解的是，无机颗粒在本文中对关于标称颗粒尺寸进行了描述，以考虑无机颗粒的尺寸和形状的可变性。箭头5描绘了流体流动通过膜组件10的方向。

在一示例性实施方式中，聚合物膜20包含：具有单一标称粒度的单一类型的无机颗粒。例如，聚合物膜20可以在其中包含标称粒度约20微米的多孔二氧化硅颗粒。应理解本文所用的术语“二氧化硅(silica)”意思表示描述不含任何可检测量的硼或不含通过X射线光电子能谱(XPS)测定的硼的二氧化硅(silicon dioxide)。

或者，聚合物膜20可以在聚合物膜20中包含超过一种类型的无机颗粒以及/或者超过一种标称粒度。换言之，聚合物膜20可以包含至少第一无机颗粒和第二无机颗粒，其中，第一无机颗粒在标称粒度和/或类型上不同于第二无机颗粒。例如，聚合物膜20可以包含第一粒度(例如，20微米)和第二粒度(例如，10微米)的相同或不同无机颗粒(例如，多孔二氧化物)的混合物。聚合物膜20中的无机颗粒混合物可以是任意混合物，例如50/50掺混物、30/70掺混物、60/40掺混物、25/75掺混物或20/08掺混物。

堆叠膜组件10中的聚合物膜20可以这样放置：第一和第二聚合物以距离(d)彼此分开，如图2示意性所示。所述距离d范围可以是约0微米至约50微米、约0微米至约25微米、约0微米至约10微米，或约0微米至约25微米。在一些实施方式中，所述距离d为零微米或基本为零微米(即，小于或等于0.1微米)。所述距离也可小于约50微米、小于约25微米、小于约10微米、小于约5微米、小于约1微米、或为0微米。

在大致如图3所示的另一实施方式中，堆叠膜组件10包括：含有具有第一标称粒度的第一无机颗粒的第一聚合物膜20、以及含有具有第二标称粒度的第二无机颗粒的第二聚合物膜30。第一聚合物膜20和第二聚合物30可以交替方式进行堆叠以形成膜组件10，例如，如图3所列举的。或者，第一聚合物膜20和第二聚合物膜30可以非交替结构进行堆叠。例如，多层第一膜20可以放置在多层第二膜30上。在另一实施方式，多层聚合物膜20可以与多层第二膜30交替堆叠以形成膜组件10而且，多层第一聚合物膜20可以交替层叠于单一(或者更多或更少数量)的第二聚合物膜30上，或者正好相反，以形成堆叠膜组件10。含有无机颗粒的另外的聚合物膜也可存在于膜组件中。

聚合物膜20、30可通过将膜简单放在彼此顶部上而设置于堆叠结构中。或者，所述聚合物膜20、30可以进行堆叠，并随后使用加热和/或加压或其它常规方法层叠在一起。使用共膨胀的两层聚合物膜以生产复合膜组件的实施方式也被认为在本发明的范围内。该复合膜组件可以包括两层(或更多层)的聚合物膜，所述聚合物膜可以共挤出或整合在一起。在示例性实施方式中，第一聚合物膜20和第二聚合物膜30为堆叠结构，并且第一聚合物膜和第二聚合物膜之间的距离为零或基本为零。

在另一实施方式中，在第一聚合物膜20和第二聚合物膜30中的无机颗粒是相同类型的。例如，两个聚合物膜20、30可以包括多孔二氧化硅颗粒。或者，在第一和第二膜中的无机颗粒可以具有不同的标称粒度。在一些实施方式中，在第一聚合物膜20和第二聚合物膜30中的无机颗粒具有相同的标称粒度或基本相同的标称粒度。

在其它实施方式中，第一和/或第二膜20、30可以在聚合物膜中包含超过一种类型的无机颗粒。换言之，第一聚合物膜20和/或第二聚合物膜30可以包含至少第一无机颗粒和第二无机颗粒，其中，第一无机颗粒在标称粒度和/或类型上不同于第二无机颗粒。例如，聚合物膜20、30可以包含第一标称粒度(例如，20微米)和第二标称粒度(例如，10微米)的相同或不同无机颗粒的50/50混合物。第一和/或第二聚合物膜20、30中的无机颗粒混合物可以是任意混合物，例如50/50掺混物、30/70掺混物、60/40掺混物、25/75掺混物或20/80掺混物。在至少一个实施方式中，膜组件10包括由相同聚合物膜(例如PTFE膜)和相同的无机颗粒(例如，多孔二氧化硅颗粒)形成的第一和第二聚合物膜20、30，但是所述无机颗粒具有不同的标称粒度(例如，在一个聚合物膜中为20微米的二氧化硅颗粒，并且在另一聚合物膜中为10微米的二氧化硅颗粒)。

本文所讨论的聚合物膜20、30可由相同、或者不同的聚合物形成。在一个或多个示例性实施方式中，至少一层聚合物膜是含氟聚合物膜。应理解，一层或超过一层的含氟聚合物膜可以形成堆叠膜组件10、或形成堆叠膜组件10的一部分。含氟聚合物膜可源自：相同含氟聚合物源、不同的源、或这两种情况的组合。在至少一个示例性的实施方式中，含氟聚合物膜是聚四氟乙烯(PTFE)膜或膨胀型聚四氟乙烯(ePTFE)膜。根据Bacino等人的美国专利第7,306,729号、Gore的美国专利第3,953,566号、Bacino的美国专利5,476,589、或Branca等人的美国专利5,183,545中描述的方法制备的膨胀型聚四氟乙烯(ePTFE)膜可以在本文中使用。此外，所述含氟聚合物膜可使用本领域已知的方法呈现亲水性(例如水可润湿)，所述方法包括例如但不限于Okita等人的美国专利第4,113,912号公开的方法。与配体有效结合的涂层可以施加至聚合物膜，例如，如Drumheller的美国专利第5,897,955号、Drumheller的美国专利第5,914,182号、或Drumheller的美国专利第8,591,932号中所述。

含氟聚合物膜还可包括具有官能四氟乙烯(TFE)共聚物材料的聚合物材料，所述官能TFE共聚物材料包括TFE和PSVE(全氟磺酰基乙烯基醚)的官能共聚物，或TFE与另一种合适的官能单体(例如但不限于偏二氟乙烯(VDF)、乙酸乙烯酯、或乙烯醇)的官能共聚物。官能TFE共聚物材料可例如根据徐等人的美国专利第9,139,707号、或徐等人的美国专利第8,658,707号中所述的方法制备。

应理解，在本申请全文中，术语“PTFE”在本文中为了方便而采用，并且表示不仅包括聚四氟乙烯，还包括膨胀型PTFE、改性的膨胀型PTFE和PTFE的膨胀型共聚物，例如在Branca的美国专利第5,708,044号、Baillie的美国专利第6,541,589号、Sabol等人的美国专利第7,531,611号、Ford的美国专利第8,637,144号、和Xu等人的美国专利第9,139,669号中所述的那些。

在一个或多个示例性实施方式中，聚合物膜可以由一种或多种非含氟聚合物材料形成，例如但不限于Sbriglia的美国专利公开第2014/0212612号中教导的超高分子量聚乙烯、Sbriglia的美国临时申请第62/030,419号中教导的聚对二甲苯、如Sbriglia的美国临时专利申请第62/030,442号中教导的VDF-共聚-(TFE或TrFE)聚合物；以及Sbriglia的美国临时专利申请第62/030,448号中教导的交替的聚(乙烯-四氟乙烯聚合物。而且，聚合物膜可以是：例如，聚烯烃膜(例如，聚丙烯膜)、有机膜(例如，纤维素基膜)、结构化水凝胶膜、或琼脂糖膜。

堆叠膜组件10中存在的聚合物膜的总数没有特别限制，并且取决于所需的最终使用和/或在膜组件中所需的质量传输流量。堆叠膜组件可以包括总共2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20(或更多)个聚合物膜。应理解，数百或者甚至数千个聚合物膜可以存在于堆叠膜组件10中。

此外，堆叠膜组件10中存在的聚合物膜的厚度可以为约1微米至约10,000微米、约100微米至约5,000微米、约500微米至约3,000微米、或约650微米至约1,000微米。如本文所用，术语“厚度”是垂直于聚合物膜长度区域的聚合物膜的方向。

色谱装置100可以进一步包括位于膜组件10顶部和/或底部的多孔玻璃料40。多孔玻璃料40、壳体50、和流动分配器60、70可以由热塑性聚合物形成，例如，聚丙烯、聚乙烯或其它聚烯烃。或者，多孔玻璃料40可以由无机或金属材料形成，只要玻璃料40不会不妨碍色谱装置的操作。

参考图4和5，堆叠膜组件10可以设置在壳体50中，所述壳体50具有第一流动分配器60和位于壳体50相反端的第二流动分配器70。在示例性实施方式中，壳体50是圆柱形的。在一实施方式中，流动分配器60包括冲击表面，以使得水性混合物的流动重新定向为相对于进料方向偏离90°。该重新定向防止流动直接冲击到聚合物膜上，并促进更均匀的流锋面(flow front)。堆叠组件10中的聚合物膜可以通过防止膜外周和壳体之间流动的任意常规方法(例如，熔融密封或使用密封剂)在壳体内壁处粘附至壳体50。流动分配器60、70可以通过类似或相同的方法密封至壳体50。各流动分配器60、70分别包括入口80和出口85，以使得水性混合物流动通过亲和色谱装置100。具体来说，入口80使得流体流入壳体50，并且出口85使得流体流出壳体50。在使用中，水性混合物以箭头5所示方向依次流动通过堆叠膜组件10中的聚合物膜。随着水性混合物流动通过色谱装置100，亲和配体与靶蛋白或抗体可逆结合，由此有效地从水性混合物中将之去除。例如，通过使得pH较低的流体通过装置，可以从亲和配体移除靶蛋白或抗体。

在其它实施方式中，在其中具有无机颗粒的至少一个聚合物膜(例如，如上所述的聚合物膜)围绕穿孔中空或实心芯体150进行包裹以形成缠绕膜组件。在大致如图6所示的一实施方式中，膜组件110包括：含有具有第一标称粒度的第一无机颗粒和具有第二标称粒度的第二无机颗粒的第一聚合物膜20。第一和第二无机颗粒可以是相同类型的(例如，多孔二氧化硅)，或者可以是不同类型的(例如，二氧化硅和沸石)，并且可以具有相同或不同的标称粒度。聚合物膜20中的无机颗粒混合物可以是任意混合物，例如，50/50掺混物、30/70掺混物、60/40掺混物、25/75掺混物或20/80掺混物。

在一些实施方式中，中间层位于聚合物膜上，并且用聚合物膜进行包裹，以使得在缠绕时中间膜位于聚合物膜的缠绕层之间。中间膜可以是含氟聚合物膜或者非含氟聚合物膜(例如聚丙烯或其它聚烯烃膜)。此外，中间层可以是多孔或者非多孔的。

在另一实施方式中，膜组件110可以由在其中含有具有单一标称粒度的无机颗粒的单一聚合物膜20形成。例如，可以使用至少部分填充有具有标称粒度且与亲和配体结合的无机颗粒的单一聚合物膜作为膜组件110。此外，在其中具有相同粒度无机颗粒的多层聚合物膜可以用于形成膜组件10。

在缠绕膜组件110中可以存在两层(或更多层)聚合物膜。当超过一层聚合物膜存在于缠绕膜组件110中时，具有第一标称粒度的第一聚合物膜20和具有第二标称粒度的第二聚合物膜30可以以堆叠结构层叠于彼此上，然后围绕堆叠结构中的芯体150缠绕，以形成缠绕膜组件110，如图7所示。或者，第一聚合物膜20可以围绕芯体150缠绕，然后第二聚合物膜30可以随后围绕经缠绕的第一聚合物膜110进行包裹。应理解，如果需要超过两层膜，则聚合物膜20、30可以在缠绕前以如上文所述的交替或非交替结构进行堆叠。

如图6和7所示，缠绕膜组件110设置在具有第一流动分配器60和位于壳体50相反端的第二流动分配器70的壳体50中。色谱装置200包括使得水性混合物流动通过亲和色谱装置100的入口80和出口85。具体来说，入口80使得流体流入壳体50，并且出口85使得流体流出壳体50。在示例性实施方式中，壳体是圆柱形的。缠绕膜组件110还可以包括与缠绕膜组件垂直且与流动分配器60和/或流动分配器70相邻放置的至少一个多孔玻璃料40。在一实施方式中，芯体150是实心的，并且流动分配器60包括冲击表面，以使得水性混合物的流动从进料方向在径向上重新定向。在使用中，水性混合物以箭头5所示(正交于膜的面积厚度方向)的方向流动通过膜组件10中的聚合物膜。随着水性混合物流动通过色谱装置200，亲和配体与靶蛋白或抗体可逆结合，由此高效地从水性混合物中将之去除。例如，通过使得pH较低的流体通过装置，可以从亲和配体移除靶蛋白或抗体。

在另一实施方式中，芯体150是空心多孔芯体，使得水性混合物从芯体150向外流动并通过聚合物膜。或者，水性混合物向内流动通过聚合物膜，并流入芯体150。

在另一实施方式中，如上所述的聚合物膜、多层堆叠膜组件、或螺旋缠绕膜组件可以可以固定到包含多孔表面90的多孔板130上，多孔表面90将可在减压下操作的下腔室与在较高(例如大气压)压力下操作的上腔室分开。如图9A和9B所示的实施方式中，膜组件包括：在其中含有具有第一标称粒度的第一无机颗粒和具有第二标称粒度的第二无机颗粒的多个聚合物膜20。在操作中，水性混合物垂直于聚合物膜20流动。

在Fc结合蛋白为亲和配体时，如本文所述的亲和色谱装置的动态结合能力(DBC)可以为在20秒或更短的停留时间、10％穿透时至少30mg/ml。在抗体、非Fc结合蛋白、或多糖为亲和配体时，色谱装置的动态结合能力(DBC)可以为在20秒或更短的停留时间、10％穿透时至少0.07微摩尔/毫升。此外，色谱装置可以多次使用而不会损失显著的动态结合能力。具体来说，色谱装置可以在各分离过程后用苛性溶液(例如，氢氧化钠)进行清洁，并再次使用。

虽然膜组件10和110的示例性实施方式如本文所述，但是，应当理解膜组件中任意数量的聚合物膜以及聚合物膜类型、无机颗粒类型、无机颗粒尺寸、无机颗粒形状、聚合物膜的取向的任意和所有组合皆在本公开的范围内。同样，一些或全部的聚合物膜可相互之间在组成、厚度、渗透性等方面发生变化。

本领域的技术人员应理解，可通过用于发挥所需作用的任何数量的方法和设备来实现本公开内容的各个方面。还应注意，本文参考的附图不一定是按比例绘制，而是有可能放大以说明本公开的各个方面，就此而言，附图不应视为限制性的。

测试方法

应理解，虽然下文描述了某些方法和设备，但也可选择性地采用本领域普通技术人员确定适用的其它方法或设备。

确定10％穿透时动态结合能力的方法

将色谱装置插入AKTApurifier^TM(GE医疗公司(GE Healthcare))液相色谱系统的流动路径中，并且将由以下方案组成的单一循环实施多次以产生图10中所示的数据。为了检查苛性溶液及其对动态结合能力的影响，仅使用了原位清洁(clean in place，CIP)苛性溶液。表1列出了所使用的溶液。表2列出了确定10％穿透时动态结合能力的方案步骤。

表1

表2

以这种方式确定上述色谱装置的动态结合能力。市售装置的动态结合能力通过相同的方法进行确定，但是具有以下不同：市售装置的停留时间是60秒而不是20秒。

因此，除了CIP步骤相同之外，如本文所述的色谱装置以比商业装置评估快三倍的体积流速进行评估。

实施例

实施例1–堆叠膜

获得具有15质量％PTFE和85质量％标称粒度10微米(马里兰州巴尔的摩的格瑞斯公司(Grace,Baltimore,MD))的多孔二氧化硅颗粒(马里兰州巴尔的摩的格瑞斯公司(Grace,Baltimore,MD))的多孔聚四氟乙烯膜(PTFE)。此外，获得具有15质量％PTFE和85质量％标称粒度20微米的多孔二氧化硅颗粒(马里兰州巴尔的摩的格瑞斯公司(Grace,Baltimore,MD))的多孔PTFE膜。在PTFE膜中的多孔二氧化硅颗粒在其他化学和物理特性(例如，化学组成、颗粒形状，标称颗粒孔隙率、标称颗粒孔径和标称颗粒BET表面积)上基本相同。

表3列出了两种多孔PTFE膜的一些物理特性。

表3

将多孔膜A和B用于制造亲和色谱装置。将聚丙烯流动分配器固定到聚丙烯圆柱形壳体的一端。将多孔聚丙烯玻璃料置于壳体中。将所需PTFE膜层数堆叠到壳体中的聚丙烯玻璃料上。(参见表4)。将第二多孔聚丙烯玻璃料置于PTFE膜堆叠体的顶部。将第二聚丙烯流动分配器固定到圆柱形壳体的与第一聚丙烯流动分配器相反的一端。色谱装置通过热处理进行密封。

表4

然后以与实施例3的装置相同的方式处理中间装置，结果，蛋白A共价结合到堆叠PTFE膜(例如膜组件)上。

对如上所述进行制造的亲和色谱装置进行测试，以使用多个循环并使用本文所述测试方法中描述的方案来评估其二十(20)秒停留时间的动态结合能力。这些亲和色谱装置中每个的性能如图10所示。

获得了两种不同市售颗粒填充床亲和色谱装置，并以相同的方式测试，不同的是它们在六十(60)秒的停留时间下进行评估。其中一个市售装置用含有残留硼的二氧化硅颗粒(市售装置1)进行填充，另一个市售装置填充有琼脂糖(市售装置2)。两个市售亲和色谱装置的性能如图11所示。亲和色谱装置以比市售亲和色谱装置快三倍的速率进行评估。

实施例2–螺旋缠绕膜

将实施例1的多孔PTFE膜B用于构建螺旋缠绕亲和色谱装置。PTFE膜B的长度用车床和膜张紧元件缠绕在实心芯体上，直到所获得的卷绕膜组件的直径略大于圆柱状聚丙烯壳体的内径。然后，在缠绕膜组件于车床上旋转的同时，用切割工具将缠绕膜组件切至所需长度尺寸。在将壳体沿其长度分开以使缠绕膜组件插入后，将缠绕膜组件插入合适尺寸的圆柱形聚丙烯壳体内。将多孔聚丙烯玻璃料和聚丙烯分配器组装在圆柱形壳体的相反端。装置通过热处理进行密封。

以这种方式用制造3.5mL床体积的三个密封中间色谱装置。这些装置使用实施例1中所用的相同聚丙烯分配器和聚丙烯玻璃料来构建。然后以与实施例3的装置相同的方式处理中间装置，结果，蛋白A共价结合到缠绕膜组件上。

发现当测试溶液(水)以各种体积流速流过这些色谱装置时，缠绕膜组件的渗透性显著大于实施例1的堆叠膜组件的渗透性。在包括缠绕膜组件的装置中，测试溶液以正交于膜的面积厚度方向流动。

实施例3

该实施例说明了将蛋白A共价结合至包含PTFE和多孔二氧化硅颗粒的多孔PTFE膜或多层多孔PTFE膜的一种方法，其中，将多孔膜或多层多孔膜整合到具有用于流体流动的入口和出口的装置壳体中。虽然该方法是针对包含堆叠膜组件的亲和色谱装置进行描述的，但应该理解的是，该方法可不管以下因素进行使用：不管多孔膜相对于流体流动路径的取向或构型；以及不管颗粒形状、标称颗粒尺寸、多孔二氧化硅颗粒相的标称颗粒孔径或标称颗粒孔体积；以及膜组件是否堆叠或卷绕或以其他方式组装。

除非另有说明，所有溶液均以0.2微米过滤。此外，所有溶液在注射泵或蠕动泵的帮助下流动通过装置。

3.5mL床体积色谱装置由具有15质量％PTFE和85质量％多孔二氧化硅颗粒(二氧化硅未结合级，XWP1000A，16-24μm，马里兰州巴尔的摩的格瑞斯公司(Grace,Baltimore,MD))的多孔聚四氟乙烯(PTFE)膜制造。生产堆叠膜组件。膜组件用21mL的95体积份乙醇(美国密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO))和5体积份去离子水(美国马里兰州巴尔的摩的Neu-Ion公司(Neu-Ion,Inc.,Baltimore,MD))的溶液以0.7毫升/分钟的体积流速进行洗涤。接着，将10.5mL的5.885克3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷(G6720，美国宾夕法尼亚州巴特拉姆的UCT特种公司(UCTSpecialties,LLC,Bartram,PA))的非过滤溶液溶解于94.5mL的95体积份乙醇和5体积份去离子水的溶液中，并且以0.7毫升/分钟的体积流速流动通过膜组件。装置在室温下静置约17个小时。然后，将装置加热至90℃，并在该温度保持2小时，随后将装置冷却至室温1小时，随后，膜组件用21mL的95体积份乙醇和5体积份去离子水的溶液以0.7毫升/分钟的体积流速进行洗涤。

然后，膜组件用pH＝0.8的硫酸和去离子水的溶液进行处理，21mL溶液以0.7毫升/分钟的体积流速流动通过装置组件，随后，在90℃加热2小时，然后将装置冷却至室温1小时，随后用42mL的pH＝4.2的10mM乙酸盐缓冲液处理膜。pH＝4.2的10mM乙酸盐缓冲液通过混合3,952mL的去离子水与40mL的乙酸(美国密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,Saint Louis,MO))和8mL的1M氢氧化钠((美国密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,Saint Louis,MO))来制备。然后，120mL的10mM乙酸盐缓冲液与6.417克的高碘酸钠(美国密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,Saint Louis,MO))混合，并且10.5mL的该溶液以0.7毫升/分钟的体积流速流动通过膜组件。然后使装置在室温下反应九十分钟，接着21mL的pH＝4.2的10mM乙酸盐缓冲液流动通过膜组件。这之后，21mL的pH＝10.9的0.01M碳酸钠缓冲液以0.7毫升/分钟的体积流速流动通过膜组件。pH＝10.9的0.01M的碳酸钠缓冲液通过混合1000的去离子水与1.06克碳酸钠(美国密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,SaintLouis,MO))和5.84克的氯化钠(美国新泽西州吉布斯镇的EMD化学品公司(EMD Chemicals,Gibbstown,NJ))来制备。

接着，21mL的4mg/mL蛋白A溶液以0.7毫升/分钟体积流速在室温下以循环流动方式流动通过装置17小时。4mg/mL蛋白A溶液通过混合202.4mL的pH＝10.9的之前制备的碳酸钠缓冲液和17.6mL的50mg/mL蛋白A溶液((马萨诸塞州沃特汉姆市的瑞普里根rSPA公司(Repligen rSPA,Waltham,MASS))来制备。在约17小时后，停止蛋白A溶液循环工艺，并且检测循环溶液在280nm的吸光度，并与新鲜制备的4mg/mL蛋白A溶液的吸光度进行比较。

然后，膜组件用21mL的pH＝10.5的第二0.01M碳酸钠缓冲液以0.7毫升/分钟的体积流速进行洗涤，所述pH＝10.5的第二0.01M碳酸钠缓冲液通过混合1000mL去离子水、1.06克碳酸钠和58.4克氯化钠进行制备。这之后是以0.7毫升/分钟的体积流速使用21mL的pH＝10.9的0.01M碳酸钠缓冲液的另一洗涤步骤。然后，31.5mL的0.01M碳酸钠缓冲液中的1mg/mL的硼氢化钠(美国密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,SaintLouis,MO))以0.26毫升/分钟的体积流速流动通过膜组件。这之后，31.5mL的pH＝7.4的0.05M磷酸盐缓冲液以0.7毫升/分钟的体积流速流动通过膜组件。pH＝7.4的0.05M磷酸盐缓冲液早先通过混合1000mL的去离子水与1.035克的磷酸二氢钠一水合物(美国密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,Saint Louis,MO))、11.393克磷酸氢二钠七水合物(美国密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,SaintLouis,MO))和8.766克的氯化钠来制备。然后，膜组件用21mL的去离子水以0.7毫升/分钟的体积流速进行洗涤。接着，膜组件用21mL的20体积份乙醇和80体积份去离子水的溶液进行洗涤。然后，装置装备有入口和出口盖，并在4℃至8℃进行储存。

实施例4

该实施例说明了将蛋白A共价结合至包含PTFE和多孔二氧化硅颗粒的一层多孔PTFE膜或多层多孔PTFE膜的第二方法，其中，将一层多孔膜或多层多孔膜整合到具有用于流体流动的入口和出口的装置壳体中。虽然该方法是针对包含堆叠膜组件的亲和色谱装置进行描述的，但应该理解的是，该方法可不考虑以下因素而进行使用：不管多孔膜相对于流体流动路径的取向或构型；以及不管颗粒形状、标称颗粒尺寸、多孔二氧化硅颗粒相的标称颗粒孔径或标称颗粒孔体积；以及膜组件是否堆叠或卷绕或以其他方式组装。

该方法在以下方面不同于实施例3所述的方法。使用醛硅烷(PSX1050，美国宾夕法尼亚州巴特拉姆的UCT特种公司(UCT Specialties,LLC,Bartram,PA))替代实施例3中的环氧硅烷。在对该方法和实施例3的方法进行比较时，许多其他制造步骤被消除，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。

除非另有说明，所有溶液均以0.2微米过滤。所有溶液在注射泵或蠕动泵的帮助下流动通过装置。

3.5mL床体积色谱装置由包含聚四氟乙烯(PTFE)(15质量％)PTFE和标称粒度20微米的多孔二氧化硅颗粒(85质量％)(二氧化硅未结合级，XWP1000A，16-24μm，马里兰州巴尔的摩的格瑞斯公司(Grace,Baltimore,MD))的多孔膜片材制造。生产堆叠膜组件。膜组件用21mL的95体积份乙醇(美国密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO))和5体积份去离子水(美国马里兰州巴尔的摩的Neu-Ion公司(Neu-Ion,Inc.,Baltimore,MD))的溶液以0.7毫升/分钟的体积流速进行洗涤。将10.5mL的3.21克醛硅烷(PSX1050，美国宾夕法尼亚州巴特拉姆的UCT特种公司(UCTSpecialties,LLC,Bartram,PA))溶解于97.0mL的95体积份乙醇和5体积份去离子水的的非过滤溶液以0.7毫升/分钟的体积流速流动通过膜组件。装置在室温下静置约17个小时。然后，将装置加热至90℃，并在该温度保持2小时，随后将装置冷却至室温1小时，随后，膜组件用42mL的95体积份乙醇和5体积份去离子水的溶液以0.7毫升/分钟的体积流速进行洗涤。然后，膜组件用21mL的pH＝10.9的0.01M碳酸钠缓冲液以0.7毫升/分钟的体积流速进行洗涤。pH＝10.9的0.01M的碳酸钠缓冲液通过混合1000的去离子水与1.06克碳酸钠(美国密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,Saint Louis,MO))和5.84克的氯化钠(美国新泽西州吉布斯镇的EMD化学品公司(EMDChemicals,Gibbstown,NJ))来制备。

接着，21mL的4mg/mL蛋白A溶液以0.7毫升/分钟体积流速在室温下以循环流动方式流动通过装置17小时。4mg/mL蛋白A溶液通过混合202.4mL的pH＝10.9的之前制备的碳酸钠缓冲液和17.6mL的50mg/mL蛋白A溶液((马萨诸塞州沃特汉姆市的瑞普里根rSPA公司(Repligen rSPA,Waltham,MASS))来制备。在约17小时后，停止溶液循环工艺，并且检测循环溶液在280nm的吸光度，并与新鲜制备的4mg/mL蛋白A溶液的吸光度进行比较。

然后，膜组件用21mL的pH＝10.5的第二0.01M碳酸钠缓冲液以0.7毫升/分钟的体积流速进行洗涤，所述pH＝10.5的第二0.01M碳酸钠缓冲液通过混合1000mL去离子水、1.06克碳酸钠和58.4克氯化钠进行制备。该洗涤之后是以0.7毫升/分钟的体积流速使用21mL的pH＝10.9的0.01M碳酸钠缓冲液的洗涤步骤。然后，31.5mL的0.01M碳酸钠缓冲液中的1mg/mL的硼氢化钠(美国密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,SaintLouis,MO))以0.26毫升/分钟的体积流速流动通过装置膜组件。这之后，31.5mL的pH＝7.4的0.05M磷酸盐缓冲液以0.7毫升/分钟的体积流速流动通过装置膜组件。pH＝7.4的0.05M磷酸盐缓冲液早先通过混合1000mL的去离子水与1.035克的磷酸二氢钠一水合物(美国密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,Saint Louis,MO))、11.393克磷酸氢二钠七水合物(美国密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,Saint Louis,MO))和8.766克的氯化钠来制备。然后，装置膜组件用21mL的去离子水以0.7毫升/分钟的体积流速进行洗涤。接着，装置膜组件用21mL的20体积份乙醇和80体积份去离子水的溶液进行洗涤。然后，装置装备有入口和出口盖，并在4℃至8℃进行储存。

在该实施例中所制备的装置用多克隆IgG评估一个循环，然后用包含单克隆抗体和杂质(如，宿主细胞蛋白)的粗制中国仓鼠卵巢(CHO)细胞澄清培养基(加利福尼亚州摩根希尔的阿拉贡公司(Aragen，Morgan Hills，California))进行评估。证实了本实施例的装置可用于从粗制CHO细胞澄清培养基中纯化单克隆抗体。

实施例5–包含多孔二氧化硅混合物的堆叠膜装置

获得具有85质量％多孔二氧化硅颗粒(二氧化硅未结合级，XWP1000A，16-24μm，马里兰州巴尔的摩的格瑞斯公司(Grace,Baltimore,MD))和15质量％PTFE的多孔聚四氟乙烯(PTFE)膜。多孔二氧化硅可以以两种不同标称粒度的50/50(以质量计)混合物，并且这些对应于实施例1中用于生产多孔膜A和B的多孔二氧化硅。

表5列出了所获得膜的一些物理特性。

表5

将多孔PTFE膜C用于制造亲和色谱装置。将聚丙烯流动分配器固定到聚丙烯圆柱形壳体的一端。将多孔聚丙烯玻璃料置于壳体中。将所需层数的PTFE膜堆叠到壳体中的聚丙烯玻璃料上。(参见表6)。将第二多孔聚丙烯玻璃料置于PTFE膜堆叠体的顶部。将聚丙烯流动分配器固定到圆柱形壳体的与第一聚丙烯流动分配器相反的一端。色谱装置通过热处理进行密封。

表6

然后以与实施例3的装置相同的方式处理中间装置，结果，蛋白A共价结合到膜组件上。

然后，对亲和色谱装置进行测试，以使用本文所述测试方法中描述的方案来评估其二十(20)秒停留时间的动态结合能力。确定亲和色谱装置在20秒停留时间时具有每毫升床体积44mg IgG的10％动态结合能力。

实施例6–包含多孔二氧化硅混合物的螺旋缠绕膜装置

将实施例5的多孔PTFE膜C用于构建螺旋缠绕亲和色谱装置。PTFE膜C的长度用车床和膜张紧元件缠绕在实心芯体上，直到卷绕膜组件的直径略大于聚丙烯壳体的内径。然后，在缠绕膜组件在车床上旋转的同时，用切割工具将缠绕膜组件切至所需长度。在将壳体沿其长度分开以使缠绕膜组件插入后，将所需尺寸的缠绕膜组件插入合适尺寸的圆柱形聚丙烯壳体内。将多孔聚丙烯玻璃料和聚丙烯分配器组装在圆柱形壳体的相反端。色谱装置通过热处理进行密封，由此产生3.5ml床体积的中间色谱装置。

然后以与实施例3的装置相同的方式处理中间装置，结果，蛋白A共价结合到缠绕膜组件上。发现当测试溶液(水)以各种体积流速流过亲和色谱装置时，缠绕膜组件的渗透性是实施例5的堆叠膜组件的渗透性的大约两倍。在包括缠绕膜组件的装置中，测试溶液以正交于膜的面积厚度方向流动。亲和层析装置在20秒停留时间时具有每毫升床体积31mgIgG的10％动态结合能力。

上文已经中概括性地并且结合具体实施方式描述本申请的发明。对本领域的技术人员来说显而易见的是，可以在不偏离本发明的精神和范围的情况下，对本文所述的实施方式进行各种修改和变动。因此，实施方式旨在覆盖对本发明的这些修改和变动，只要这些修改和变动在所附权利要求及其等同方案的范围之内。