阅读说明：本技术 生产l-瓜氨酸和l-精氨酸的谷氨酸棒杆菌及其改造方法和应用 (Corynebacterium glutamicum for producing L-citrulline and L-arginine and modification method and application thereof ) 是由 满在伟 郭静 刘典典 戴嘉辰 许颖琦 姚智仁 于 2020-06-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种生产L-瓜氨酸和L-精氨酸的谷氨酸棒杆菌及其改造方法和应用,通过对谷氨酸棒杆菌基因组进行改造,在argR基因中插入大肠杆菌的argB<Sub>Ec</Sub>基因获得重组菌株。应用该改进的菌株进行发酵在发酵的过程中能够同时生成L-瓜氨酸和L-精氨酸。(The invention discloses a corynebacterium glutamicum for producing L-citrulline and L-arginine, a modification method and application thereof Ec The gene is obtained into a recombinant strain. The improved strain is applied to fermentation, and L-citrulline and L-arginine can be simultaneously generated in the fermentation process.)

生产L-瓜氨酸和L-精氨酸的谷氨酸棒杆菌及其改造方法和 应用

技术领域

本发明属于基因改造领域，具体涉及一种生产L-瓜氨酸和L-精氨酸的谷氨酸棒杆菌及其改造方法和应用。

背景技术

L-瓜氨酸是一种重要的非蛋白质氨基酸，参与尿素循环维持血氨平衡，同时具有抗氧化和稳定血压等生理功能。因此，L-瓜氨酸在医疗药品、食品和化妆品行业具有非常广阔的应用前景。目前，L-瓜氨酸合成研究主要集中于酶转化法和发酵法。酶转化法是以L-精氨酸为底物利用精氨酸脱亚氨基酶催化生成L-瓜氨酸。底物L-精氨酸价格较高，因此酶转化法具有底物成本高的问题。微生物直接发酵法生产L-瓜氨酸可使用葡萄糖等廉价底物，具有工艺简单、成本低、环境污染小等优势，因此近年来逐渐得到重视。

L-精氨酸是人和动物体内的一种半必需氨基酸，同样参与尿素循环维持血氨平衡。是多种生物活性物质的合成前体，具有多种独特的生理和药理作用，在食品、医药和动物饲料等方面具有广泛的应用。

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是一种兼性厌氧革兰氏阳性安全菌株。随着研究的深入尤其是代谢工程的发展，C.glutamicum广泛应用于各种氨基酸、有机酸乃至生物燃料和生物基化学品等的发酵生产。C.glutamicum中L-鸟氨酸、L-瓜氨酸和L-精氨酸存在于同一条合成代谢途径，可称之为L-精氨酸合成代谢途径。该代谢途径终产物为L-精氨酸，L-瓜氨酸则为L-鸟氨酸合成L-精氨酸代谢反应的中间产物。

C.glutamicum ATCC13032中L-精氨酸合成代谢途径相关基因以基因簇argCJBDFRGH的形式存在于染色体上，分为两个操纵子分别为argCJBDFR和argGH。L-瓜氨酸主合成途径中所有酶的编码基因则集中在argCJBDFR操纵子上。其中，由argB基因编码的N-乙酰谷氨酸激酶为L-瓜氨酸与L-精氨酸合成的关键限速酶，同时，其活性受L-精氨酸反馈抑制，很低浓度的L-精氨酸即可严重抑制N-乙酰谷氨酸激酶的催化活性。由argR基因编码的阻遏蛋白ArgR可抑制argCJBDFR和argGH操纵子的转录，从而抑制细胞中整条L-瓜氨酸和L-精氨酸合成代谢途径。因此，C.glutamicum ATCC13032细胞中L-瓜氨酸和L-精氨酸合成代谢途径受到精密的代谢调控，不会过量合成L-瓜氨酸或L-精氨酸。C.glutamicumATCC13032发酵培养过程中发酵液中不会积累L-瓜氨酸或L-精氨酸。只有解除细胞对L-瓜氨酸和L-精氨酸合成代谢途径的代谢调控作用，才能实现L-瓜氨酸和L-精氨酸的过量合成。来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的N-乙酰谷氨酸激酶活性则不受L-精氨酸反馈抑制，其编码基因命名为argB_Ec。

发明内容

针对上述问题，本发明提出一种生产L-瓜氨酸和L-精氨酸的谷氨酸棒杆菌及其改造方法和应用。

实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种改造谷氨酸棒杆菌生产L-瓜氨酸和L-精氨酸的方法，对谷氨酸棒杆菌基因组进行改造，在argR基因中插入大肠杆菌的argB_Ec基因。

作为本发明的进一步改进，采用PCR扩增argR基因上游片段argR_F、argR基因下游片段argR_R和argB_Ec基因获得argR_F-argB_Ec-argR_R基因片段。

作为本发明的进一步改进，包括以下步骤：

(1)以argR_F基因和argB_Ec基因混合物为模板，利用引物argRF1和argB_EcR重叠延伸PCR扩增获得argRF-argB_Ec基因片段；

(2)以argR_F-argB_Ec基因和argR_R基因混合物为模板，利用引物argRF1和argRR2重叠延伸PCR扩增获得argR_F-argB_Ec-argR_R基因片段。

作为本发明的进一步改进，所述引物argRF1序列如SEQ ID NO.3所示。

作为本发明的进一步改进，所述引物argRR2序列如SEQ ID NO.6所示。

作为本发明的进一步改进，所述引物argB_EcR序列如SEQ ID NO.8所示。

作为本发明的进一步改进，所述大肠杆菌选用E.coli BL21菌株，所述argB_Ec基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种生产L-瓜氨酸和L-精氨酸的谷氨酸棒杆菌，根据上述所述的一种改造谷氨酸棒杆菌生产L-瓜氨酸和L-精氨酸的方法获得的菌株。

本发明还提供了一种应用所述谷氨酸棒杆菌同时生产L-瓜氨酸和L-精氨酸。

本发明的有益效果：本发明通过一步基因组改造，在C.glutamicum ATCC13032菌株基因组中argR基因中间插入了argB_Ec基因，相当于C.glutamicum ATCC13032菌株argR基因敲除的同时引入了来源于E.coli的argB_Ec基因。通过一步基因组改造，在C.glutamicumATCC13032菌株中失活L-瓜氨酸和L-精氨酸合成操纵子阻遏蛋白ArgR，同时表达了来源于E.coli的抗L-精氨酸反馈抑制的N-乙酰谷氨酸激酶。在C.glutamicum ATCC13032菌株中解除了细胞对L-瓜氨酸和L-精氨酸合成代谢途径的代谢调控作用。使得改造菌株在发酵的过程中能够同时生产L-瓜氨酸和L-精氨酸。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

1.材料选择

所使用的谷氨酸棒杆菌的C.glutamicum模式菌株ATCC13032，通过购买获得。C.glutamicum ATCC13032 argR基因核苷酸序列如SEQ NO.1所示。

大肠杆菌所选用的菌株为E.coli BL21，E.coli BL21 argB_Ec基因核苷酸序列如SEQ NO.2所示。

2.引物设计

利用PCR扩增技术，以C.glutamicum ATCC13032基因组为模板扩增argR基因上游片段argR_F和下游片段argR_R，以E.coli BL21基因组为模块扩增argB_Ec基因。所述设计的序列表1如下：

表1：引物序列

3.基因重组

(1)以argR_F基因和argB_Ec基因混合物为模板，利用引物argRF1和argB_EcR重叠延伸PCR扩增获得argR_F-argB_Ec基因片段。

以argR_F-argB_Ec基因和argR_R基因混合物为模板，利用引物argRF1和argRR2重叠延伸PCR扩增获得argR_F-argB_Ec-argR_R基因片段。

(2)将获得的argR_F-argB_Ec-argR_R基因片段与C.glutamicum基因组整合质粒pK18mobsacB线性化载体连接，并转入E.coli JM109，挑取阳性转化子，构建质粒pK18-argR::argB_Ec。

(3)将pK18-argR::argB_Ec质粒电击转化C.glutamicum ATCC13032，经1800V，5ms电击后涂布于含有卡那霉素的LBG固体培养基平板，30℃培养36h，第一次同源重组转化子长出。转化子菌株于液体LBG培养基培养。然后，在含蔗糖的培养基中进行二次筛选。二次筛选菌株通过PCR进行鉴定，鉴定正确的菌株命名为Cg-argR::argB_Ec。

4.结果验证

将未经基因改造的C.glutamicum ATCC13032菌株(对照组)与Cg-argR::argB_Ec(实验组)同步进行发酵，观察发酵液中的发酵成分的变化。

其中，发酵过程中，发酵培养基成分为：葡萄糖80g/L，酵母粉8g/L，硫酸铵40g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.02g/L，硫酸亚铁0.02g/L，碳酸钙20g/L。发酵温度为30℃，摇床转速220r/min。

如表2、3所示的发酵液中的发酵成分随着发酵时间的变化情况。

表2：L-瓜氨酸随发酵时间的变化

	12h	24h	36h
				对照组	ND	ND	ND
实验组	0.32g/L	1.9g/L	3.6g/L

注：ND表示检测不到。

表3：L-精氨酸随发酵时间的变化

	12h	24h	36h
				对照组	ND	ND	ND
实验组	0.14g/L	0.47g/L	1.1g/L

注：ND表示检测不到。

由此可知，菌株Cg-argR::argB_Ec基因组中argR基因中间插入了argB_Ec基因，相当于C.glutamicum ATCC13032菌株argR基因敲除的同时引入了来源于E.coli的argB_Ec基因。通过一步基因组改造，在C.glutamicum ATCC13032菌株中失活L-瓜氨酸和L-精氨酸合成操纵子阻遏蛋白ArgR，同时表达了来源于E.coli的抗L-精氨酸反馈抑制的N-乙酰谷氨酸激酶。通过一步基因组改造，实现了C.glutamicum ATCC13032菌株发酵生产L-瓜氨酸和L-精氨酸。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 常州大学

<120> 生产L-瓜氨酸和L-精氨酸的谷氨酸棒杆菌及其改造方法和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 516

<212> DNA

<213> antibiotic resistance genes

<400> 1

atgtcccttg gctcaacccc gtcaacaccg gaaaacttaa atcccgtgac tcgcactgca 60

cgccaagctc tcattttgca gattttggac aaacaaaaag tcaccagcca ggtacaactg 120

tctgaattgc tgctggatga aggcatcgat atcacccagg ccaccttgtc ccgagatctc 180

gatgaactcg gtgcacgcaa ggttcgcccc gatgggggac gcgcctacta cgcggtcggc 240

ccagtagata gcatcgcccg cgaagatctc cggggtccgt cggagaagct gcgccgcatg 300

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gaactaggtg aattactcag cgggcgcacc acttaa 516

<210> 2

<211> 887

<212> DNA

<213> antibiotic resistance genes

<400> 2

cgaagacaac ttactgaaag gcgcggcggc acaagcggta cagtgcgcca atattcgttt 60

cggctatgcg gaaacgcagt ctcttattta agggtgcaat gatgaatcca ttaattatca 120

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acggtatgcc gatgggtacg cggattttag cttaagtttt gttggcc 887

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccggaattct aacgctaaca agctctcatt ttgcagatt 39

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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<210> 5

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

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