阅读说明：本技术 一种纳米材料固定化脂肪酶的方法 (Method for immobilizing lipase by using nano material ) 是由 陈可泉 刘逸 李辉 郭兴 乔荣梅 陆秋豪 曾金磊 李春秋 欧阳平凯 于 2019-11-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种纳米材料固定化脂肪酶的方法。该方法先制备固定化酶,再将固定化酶重悬后重新加入CALB、Zn<Sup>2+</Sup>和二甲基咪唑溶液,离心后的纳米固定化脂肪酶,经过预冻后,继续冻干称重,即可计算出蛋白固载量。与现有技术相比,采用该方法固定化脂肪酶后,在固载率有提高的情况下仍然保持较高的酶活,方便重复利用,降低生产成本,提高经济效益。(The invention discloses a method for immobilizing lipase by using a nano material. The method comprises the steps of firstly preparing immobilized enzyme, then re-suspending the immobilized enzyme and then adding CALB and Zn again 2+ And (3) carrying out pre-freezing on the nano immobilized lipase after centrifugation and the dimethyl imidazole solution, and continuously carrying out freeze-drying and weighing to calculate the protein immobilization amount. Compared with the prior art, after the lipase is immobilized by adopting the method, the high enzyme activity is still kept under the condition of improving the immobilization rate, the reutilization is convenient, the production cost is reduced, and the economic benefit is improved.)

一种纳米材料固定化脂肪酶的方法

技术领域

本发明属于固定化酶制备技术领域，具体涉及一种纳米材料固定化脂肪酶的方法。

背景技术

脂肪酶是重要的工业酶制剂品种之一，可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。不同来源的脂肪酶具有不同的催化特点和催化活力。其中用于有机相合成的具有转酯化或酯化功能的脂肪酶的规模化生产对于酶催化合成精细化学品手性化合物有重要意义。目前酯化反应大多是高温酸碱催化，存在副产物有毒，反应条件苛刻，能耗高，环境污染等问题。而酶法合成能够克服以上缺点，反应条件温和，能耗低，催化反应特异性强，不易产生副产物，对环境友好，是绿色化学工业的发展方向。游离酶存在的普遍问题是在有机相反应中难以发挥作用，极易失活，重复利用性差等问题。常用的解决办法是进行固定化，酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用，便于运输和贮存，有利于自动化生产。

专利CN102839166A利用大孔吸附树脂树脂对脂肪酶进行固定化，由于有机物残留高，预处理困难，孔隙过大不利于固定化；专利CN101205532A利用海藻酸—碳酸钙杂化凝胶对β－葡萄糖醛酸苷酶进行固定化，由于制备工艺复杂，酶活有损失等特点不利于酶的固定化。

纳米材料本身具有较大的比表面积，纳米材料作为固定化材料有着很大的优势，易于固定化酶，提高酶的固载量，能快速分离出来便于重复利用，有较好的生物相容性，但是MOFS（金属有机骨架化合物）在制备过程中使用到了二甲基咪唑这一试剂，二甲基咪唑的水溶液Ph值在11左右，对于酶活的伤害较大，同时因为MOFS合成的速度较快，导致有部分的酶溶液游离在外无法结合到纳米材料上，最终导致固载率低。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种纳米材料固定化脂肪酶的方法，克服现有的游离脂肪酶难以被单一的MOFS材料固定且酶活较低的难题。采用该方法固定化脂肪酶后，在固载率有提高的情况下仍然保持较高的酶活，方便重复利用，降低生产成本，提高经济效益。

为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：

一种纳米材料固定化脂肪酶的方法，包括以下步骤：

步骤1，测定脂肪酶CALB(南极假丝酵母脂肪酶B)的蛋白浓度为4 g/L，分别配置等摩尔比的NaDC（脱氧胆酸钠）和CoCl₂（氯化钴），室温下先加入CALB(南极假丝酵母脂肪酶B)，低转速搅拌，再依次加入NaDC（脱氧胆酸钠）和Co²⁺，低速搅拌30 min后高速离心洗涤2次得固定化脂肪酶，留上清液，测定上清液的蛋白含量；

步骤2，按1：4的摩尔比配置Zn²⁺和二甲基咪唑溶液，将离心洗涤后的固定化脂肪酶用纯水重悬后重新置于磁力搅拌器上，转速调高至6000-8000转，搅拌均匀后重新加入CALB(南极假丝酵母脂肪酶B)，再依次加入Zn²⁺和二甲基咪唑溶液，搅拌30 min后离心留上清液，用MiNi-Q（超纯水）洗涤三遍得纳米材料固定化脂肪酶，留上清液，测定上清液中的蛋白含量；

步骤3，将纳米材料固定化脂肪酶进行预冻后放在冻干机里冻干，冻干后进行称重，计算出蛋白固载量。

作为改进的是，步骤1中所述低速搅拌的速度为200-300转。

作为改进的是，步骤1中高速离心的转速为2000-4000转，转速太高容易将先形成的胆酸盐内核解体。

上述步骤3中计算蛋白固载量的计算方法为：加入酶的总质量为A，上清中测出来的酶的质量为B（既没有固定住的酶的质量），C为固定住的酶的质量，C=A-B，假设材料最终质量为D，固载量E的计算方法为E=C/D，冻干后的固定化酶放在4℃冰箱保存备用。

作为改进的是，步骤2中配置的Zn²⁺为无水乙酸锌。

作为改进的是，步骤2离心洗涤的转速为8000转。

作为改进的是，步骤3中冻干后的材料为粉末状。

有益效果：

与现有技术相比，本发明一种纳米材料固定化脂肪酶的方法的优势为：

（1）载体制备工艺简单，成本低廉，

（2）制备过程中不会产生有毒有害的副产物，制备过程对环境友好 ；

（3）载体比表面积增大，有利于酶的固定和固定后的稳定性 ；

（4）先合成疏水性的胆酸盐内核，有利于保护脂肪酶，防止脂肪酶在碱性环境里丧失酶活；

（5）材料离心后即可与产物分离，方便产物分离检测，且有利于酶的重复利用；

（5） 固定后的脂肪酶酶热稳定性提高，在80℃恒温下2 h，游离酶酶活仅保存45%，而本发明固定化脂肪酶的酶活能保存80%以上。

附图说明

图1为不同温度下的纳米材料固定化脂肪酶活对比；

图2为不同pH下的纳米材料固定化脂肪酶活对比；

图3为本发明纳米材料固定化脂肪酶的结构示意图，其中，1-纳米材料固定化脂肪酶，2-胆酸盐内核，3-ZIF-8框架。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。

一种纳米材料固定化脂肪酶的方法，包括以下步骤：

步骤1，测定脂肪酶CALB(南极假丝酵母脂肪酶B)的蛋白浓度为4 g/L，分别配置等摩尔比的NaDC（脱氧胆酸钠）和CoCl₂（氯化钴），室温下先加入CALB(南极假丝酵母脂肪酶B)，低转速搅拌，再依次加入NaDC（脱氧胆酸钠）和Co²⁺，以200-300转的速度搅拌30 min后，高速离心洗涤2次得固定化酶，留上清液，测定上清液的蛋白含量；

步骤2，按摩尔比为1：4配置Zn²⁺和二甲基咪唑溶液，将离心洗涤后的固定化酶用纯水重悬后重新置于磁力搅拌器上，转速调高至6000-8000转，搅拌均匀后重新加入2-3mlCALB(南极假丝酵母脂肪酶B)，再依次加入Zn²⁺和二甲基咪唑溶液，搅拌30 min后离心留上清液，用MiNi-Q（超纯水）洗涤三遍得纳米材料固定化脂肪酶，留上清液，测定上清液中的蛋白含量；

步骤3，将洗涤后的材料进行预冻后放在冻干机里冻干，冻干后进行称重，计算出蛋白固载量，计算方法为：加入酶的总质量为A，上清中测出来的酶的质量为B（既没有固定住的酶的质量），C为固定住的酶的质量，C=A-B，假设材料最终质量为D，固载量E的计算方法为E=C/D，冻干后的固定化酶放在4℃冰箱保存备用。

步骤1中高速离心的转速为2000-4000转，转速太高容易将先形成的胆酸盐内核解体。

实施例1

固定CALB的碳酸钙微球制备：配置等摩尔比的CaCl₂和NaOH，室温下先加入2-3mLCALB，然后加入CaCl₂溶液，搅拌均匀后缓慢加入等摩尔比的NaOH溶液，低速转10min后静置半小时，高速离心洗涤两次，留上清液，测定上清液的蛋白含量。

结果: 碳酸钙固定化材料对CALB的固定效率不好，固载效率仅45%，计算方法是用固定住的酶的质量A除以加入的酶的质量B。而本发明制备的纳米材料对CALB的固载效率为100%，远高于市面上常见的固定化材料。

实施例2

不同摩尔比对于固定化酶的影响

配置MOFS材料最主要用的是二甲基咪唑和锌离子，在原料确定的情况下浓度和配比就显得尤为重要。尝试用40mM锌离子，按照1：4、1：10、1：20的配比配置对应浓度的二甲基咪唑水溶液，以及500mM锌离子，按照1：4、1：10、1：20的配比配置对应浓度的二甲基咪唑水溶液，按照这六种配比分别制备纳米材料。

结果：40mM锌离子对应三种配比制备的材料，1：10和1：20合成的材料较多，但固载率不高，固定住的脂肪酶酶活不高，与游离酶持平。1:4配比制备的材料量正常，固定效率为100%，且酶活较好。

500mM锌离子的三种配比中前体浓度增加，合出来的材料过多，大部分是空载体，且二甲基咪唑溶液浓度太高，固定住的酶基本无酶活。

实施例3

固定化脂肪酶降解棕榈酸对硝基苯酯

棕榈酸对硝基苯酯(PNPP)被脂肪酶降解为对硝基苯酚，对硝基苯酚在 410 nm 处有较强的特征吸收，可以采用紫外可见分光光度计进行检测。

缓冲液配置：0.05 mM pH 8.0的Tris-HC。

底物配置：称取0.0378 g的PNPP，加入1-2 mL曲拉通-x100和 5-10mL异丙醇溶液，溶解后用0.05 mM pH 8.0的Tris-HCl的缓冲液定容到100 mL。

做产物标曲：配置1 g/L的对硝基苯酚溶液母液，对母液进行逐步稀释，直到A410的吸光值在0.2-0.8之间，选取梯度为0.01-0.1之间，用酶标仪进行测定，得出的标曲方程为：y=7.1854x+0.0532，R²=0.9994。

测定方法：反应体系为1 mL，其中200 μL是缓冲液和酶液，800 μL是配置的底物溶液。进行反应后每 5 min 记数一次至 25 min，以 A410 对时间做图。将游离的脂肪酶与固定化后的脂肪酶分别进行温度、pH的酶活测试，将游离酶与固定化酶的酶活进行比较，固定化酶的酶活均高于游离酶。

从图1和图2可看出，用合成的纳米材料固定后的CALB的酶活有提升，且温度耐受性和pH耐受性也有相应的提高提高。